检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2022年第9期38卷 3453-3465页

作者：冯莹莹肖梦珂路江涛王小引柴玉荣王天云贾岩龙新乡医学院药学院河南新乡453003 新乡医学院重组药物蛋白表达系统国际联合实验室/河南省生物创新药物工程技术研究中心河南新乡453003 新乡医学院基础医学院河南新乡453003 郑州大学基础医学院组织学与胚胎学系河南郑州450001

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基... 详细信息

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因,验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性;构建两种真核表达载体:对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP),分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池;重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度,并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明,CHO细胞aprt基因成功敲除;获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明,与野生型CHO细胞相比,转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%;特别是长期传代培养时,转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P<0.05);构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。

关键词：中国仓鼠卵巢细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因敲除重组蛋白表达

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家鸡TSHβ、FSHβ和LHβ重组蛋白表达及纯化研究

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四川大学学报（自然科学版） 2016年第1期53卷 163-168页

作者：阎振鑫莫春横王亚军李娟四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都610065

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索... 详细信息

本文以家鸡冷冻垂体组织为模版,克隆了TSHβ、亚基FSHβ亚基和LHβ亚基的部分特异性功能片段,并用pET原核表达系统构建了它们的原核表达质粒:pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ.利用大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami TM菌株摸索到高效重组表达pET32a-TSHβ、pET28a-FSHβ和pET32a-LHβ的IPTG诱导浓度分别为:200μM、25μM和15μM.并在此基础上利用镍离子亲和层析蛋白纯化技术对重组蛋白进行了纯化.

关键词： TSHβ FSHβ LHβ 基因克隆重组蛋白表达蛋白纯化

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*** BL21(DE3)对乙酸或氨的耐受性及其重组蛋白表达:碱性pH转换策略

*** BL21(DE3)对乙酸或氨的耐受性及其重组蛋白表达:碱性pH转换策...

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作者：王恒伟上海交通大学

学位级别：博士后

背景简介:摇瓶培养与发酵罐培养的一个重要差别实际上体现在碳、氮源的供应和菌体产乙酸程度上,这也是的放大过程经常出现问题的地方。乙酸和氨是大肠杆菌培养过程中产生的两类可解离的小分子产物。许多报道认为乙酸积累通常会抑制菌体... 详细信息

背景简介:摇瓶培养与发酵罐培养的一个重要差别实际上体现在碳、氮源的供应和菌体产乙酸程度上,这也是的放大过程经常出现问题的地方。乙酸和氨是大肠杆菌培养过程中产生的两类可解离的小分子产物。许多报道认为乙酸积累通常会抑制菌体生长和外源蛋白表达,这种问题在发酵罐上高密度培养菌体时最易出现。另有报道认为,发酵液中较高浓度的铵离子对某些重组蛋白的表达有利。　　理论基础:乙酸和铵离子发挥作用同其未解离的分子即Hac分子和NH3分子的浓度紧密相关。根据弱酸碱的电离平衡公式,我们知道,提高培养基的pH,可以减少发酵液中有毒性的Hac分子浓度,和提高NH3分子的浓度。这两类未解离的中性分子可以以自由扩散的方式跨过***细胞膜,从而在胞内积累。调节培养基的pH可以调控胞内的乙酸根和铵离子的浓度。　　实验主要结果及其讨论:该发酵策略主要是应用在*** BL21(DE)生产重组蛋白方面。是指在发酵过程中,将摇瓶或发酵罐中培养基的pH控制在7.5-8.5之间,从而可以提高细胞对乙酸的耐受性或者提高培养基中氨分子的浓度,来保证某些重组蛋白高水平地表达。　　 (1)在克服乙酸毒害:　　我们的数据表明,300 mM以内的乙酸钠所造成的培养基渗透压不会明显地抑制*** BL21(DE3)的生长,有抑制作用的是Hac分子;300 mM的乙酸钠对***21(DE3)表达重组蛋白的影响还依赖于具体的重组蛋白,有些蛋白的表达更易受到乙酸的负影响,而pH的升高会增加这些重组蛋白的表达水平。另外,重组蛋白的表达也会加重乙酸对菌体生长的抑制作用。　　我们还发现50-300 mM乙酸钠会严重地抑制菌体细胞膜还原性电子产生的强度。在各种所测试的pH条件下,300 mM NaCl胁迫最高只能造成大肠杆菌细胞膜电子产生活性10％的下降;而50-300 mM的乙酸钠可以使该活性降低约50-75%,尤其是低pH会加重这种副作用。这种乙酸钠的副作用可以通过提高培养基pH来缓解。　　乙酸抑制大肠杆菌的生长的机理主要有两种解释,一种即未解离形式的弱酸即Hac分子是一种解偶联剂,可以自由扩散进细胞膜,从而造成跨膜ApH的崩溃;另一种是胞内Ac-阴离子的高度积累所造成的后果。我们的数据显示,在实验室常见的大肠杆菌培养所用的pH条件和乙酸积累浓度下,*** BL21(DE3)胞内乙酸的积累,并不符合按照未解离的Hac分子自由扩散和平衡公式的计算得到的结果。　　总之,在碱性pH环境下,可以使造成跨膜质子梯度崩溃的有害的Hac分子的浓度和高度积累的胞内Ac-阴离子的浓度降低,提高大肠杆菌细胞膜电子产生活性,从而在一定程度上减轻乙酸的副作用。碱性pH转换策略对于克服乙酸副作用来讲,只是一种补救策略,最有效的办法还是通过分子操作或过程控制来减少乙酸的产生。　　 (2)在增加培养基中氨分子浓度以促进重组蛋白表达:　　本研究的结果表明,较高的pH可以提高培养基中氨分子浓度,从而可以在较低的胞外铵离子浓度下有利于rtPA蛋白的表达。但对于其他的重组蛋白如GST和Trx,铵离子却没有明显的促进作用。在碱性pH环境下,*** BL21(DE3)胞内的铵离子浓度会有升高,但远远低于根据铵离子电离平衡和自由扩散进出细胞膜所得到的理论值。　　我们还发现250 mM浓度以上的(NH4)2SO4会严重地抑制菌体细胞膜还原性电子产生的强度。在pH6.5条件下,500 mM(NH4)2SO4胁迫能造成大肠杆菌细胞膜电子产生活性70-80%的下降:而相同pH和相同浓度的Na2SO4能造成大约25-65%的下降,这种(NH4)2SO4的抑制作用,很可能不只是高盐胁迫的结果,我们推测弱碱盐的氨分子也可能参与其中。提高培养基的pH,可以缓解高浓度的(NH4)2SO4或Na2SO4对***细胞膜的电子产生活性的抑制作用。

关键词：大肠杆菌乙酸胁迫氨胁迫发酵罐培养重组蛋白表达碱性pH转换

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烟草天蛾新细胞系生长特性及重组蛋白表达的研究

烟草天蛾新细胞系生长特性及重组蛋白表达的研究

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作者：姜磊青岛农业大学

学位级别：硕士

昆虫细胞作为生物农药和基因表达的新型生物反应器而备受青睐。因此，不断发掘新细胞系，为科学研究和生产提供新资源，是目前研究的热点。\n 本研究以烟草天蛾（Manduca sexta）受精卵为材料，建立多株烟草天蛾胚胎细胞系，从中筛... 详细信息

昆虫细胞作为生物农药和基因表达的新型生物反应器而备受青睐。因此，不断发掘新细胞系，为科学研究和生产提供新资源，是目前研究的热点。\n 本研究以烟草天蛾（Manduca sexta）受精卵为材料，建立多株烟草天蛾胚胎细胞系，从中筛选了三株生长状况较好的细胞系，分别命名为QB-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7。并对其生物学特性进行研究，主要结果如下:\n ***-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7三株细胞在辅以10％胎牛血清的TNM-FH培养基中28℃条件下传代培养50代以上，性状稳定，细胞以棱形为主，有少量圆形。\n 2.对QB-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7三株细胞与烟草天蛾卵的基因组DNA进行RAPD-PCR鉴定，结果表明各细胞株与烟草天蛾卵具有相同的DNA扩增谱带。\n 3.测定了QB-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7三株细胞的生长曲线和群体倍增时间，QB-Ms2-2细胞在生长第6d达到最大值，达到1×106cells/mL，QB-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7三株细胞的群体倍增时间分别为61，37，46h。\n 4.病毒侵染试验表明，QB-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7三株细胞对AcMNPV不敏感，感染率分别为33％、40％、36％，平均每个细胞病毒多角体(OBs)产量非常低。\n 5.重组蛋白表达水平测定表明，QB-Ms1-8，QB-Ms2-2，QB-Ms2-7三株细胞的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）表达量较低，但是QB-Ms2-2细胞的分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phosphatase，SEAP）表达量2.33IU/mL与BTI-Tn5B1-4的蛋白表达量2.28 IU/mL相当，作为重组蛋白表达，是有潜力的生物资源。

关键词：新细胞系重组蛋白表达烟草天蛾生长特性

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伪结核棒状杆菌全基因组测序及SlpA重组蛋白表达与免疫效果评价

伪结核棒状杆菌全基因组测序及SlpA重组蛋白表达与免疫效果评价

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作者：钱虹宇西南大学

学位级别：硕士

伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp）是一种兼性胞内寄生菌,可感染马、牛、羊、猪、骆驼等多种动物和人,其感染主要引起慢性炎症,是慢性传染病干酪样淋巴结炎（Caseous lymphadenitis,CLA）的重要病原,CLA是世界... 详细信息

伪结核棒状杆菌（Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp）是一种兼性胞内寄生菌,可感染马、牛、羊、猪、骆驼等多种动物和人,其感染主要引起慢性炎症,是慢性传染病干酪样淋巴结炎（Caseous lymphadenitis,CLA）的重要病原,CLA是世界上公认最难防控的疫病之一。在动物临床上,Cp感染最常见的是小反刍动物,尤其是山羊和绵羊,该病原一旦传入羊群极难控制和根除,是造成养羊业重要经济损失的原因之一。与此同时,该病原在动物中的感染和流行具有传播给人的风险,对人类健康造成潜在威胁。在防控Cp感染的手术治疗、药物预防和接种疫苗等手段中,接种疫苗是最有效的措施之一。找到具有良好免疫原性和免疫保护性菌株或其关键的毒力因子是制备活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗的关键。本文首先对实验室前期筛选的毒力强,且具有良好免疫保护性的Cp万州株（WZ）进行全基因组测序分析。进一步选取具有一定免疫原性潜力的毒力基因或假定毒力基因进行原核表达并评价其免疫原性;最后,选择Cp的表面蛋白（Slp A）对小鼠进行免疫保护性评价。旨在为Cp亚单位疫苗的研究提供参考。 ***万州株（WZ）全基因组测序及分析为了进一步了解Cp的毒力基因等信息,本文对实验室前期筛选到一株毒力强、免疫原性及稳定性较好的Cp WZ株进行全基因组测序分析。培养Cp WZ株,送至上海美吉生物有限公司进行全基因组测序。以Fast QC软件对二代测序数据进行质量控制分析,组装后上传至NCBI,获得登录号。分析并预测WZ株的耐药基因与毒力基因。结果显示,Cp WZ株的基因组大小为2,338,216 bp,提交Gen Bank获得登录号:SRR24947429。WZ株基因组编码的基因数目为2255个、每个基因的平均长度为909.24 bp、基因编码区的GC含量为52.85%、所有基因的全长与基因组全长占比为87.69%、基因组上基因间区的长度为287887 bp、基因间区的GC含量为47.46%、基因间区在基因组上的占比为12.31%。其中,共检测到99个耐药基因、178个毒力相关基因。 ***部分基因原核表达及多克隆抗体制备为了探究Cp某些毒力基因的的免疫原性,本文以p ET-28α为载体,克隆表达rpl B、Dak2、Fag A、Fag B、Rec A、Slp A、LPx TG、mtr B、Ndh、DTx R和aro B基因。将带有目的基因的p ET-28目载体化转到大肠杆菌BL21（DE3）中,以IPTG进行诱导表达,超声破碎后SDS-PAGE电泳检测。对可溶性表达蛋白采用过柱（镍柱）纯化法,包涵体表达采用洗涤纯化法。以纯化后的重组蛋白与佐剂相融合,对家兔进行免疫,制备兔抗多克隆抗体。通过ELISA及Western-blot检测重组蛋白与Cp免疫小鼠及感染山羊血清样本的反应、抗r Slp A血清与Cp WZ株全菌蛋白的反应。结果显示,成功构建p ET-Slp A、p ET-LPx TG、p ET-rpl B、p ET-Ndh、p ET-DTx R、p ET-mtr B、p ET-Dak2、p ET-Fag A、p ET-Fag B、p ET-aro B和p ET-Rec A重组质粒。重组蛋白raro B、r Rec A、r Dak2、rrpl B主要在上清中表达,为可溶性蛋白;而r Slp A、r Ndh在包涵体中的表达量高于破碎上清中。制备的抗raro B和抗r Slp A血清效价最高达1:10～5,而抗r Dak2血清效价最高为1:10～6,提示raro B、r Dak2、r Slp A蛋白具有良好的免疫原性。发现r Slp A能与Cp免疫小鼠及感染山羊的血清发生反应。 *** rSlpA亚单位疫苗制备及免疫效果评价为了评价r Slp A的作为亚单位疫苗研究的可能性,本文选取r Slp A开展了抗r Slp A多克隆抗体的体外血清杀菌试验,及r Slp A免疫小鼠的主动免疫保护试验。将Cp WZ株复苏活化,对阴性血清及抗r Slp A血清在56℃、30 min条件下进行灭活处理;对活化后的菌株进行扩培后比浊计数,将10-5CFU的菌与阴性血清、抗r Slp A血清进行孵育后涂布平板计数。以r Slp A皮下免疫小鼠,首免后21d二免,二免后21 d,以WZ株进行攻毒。检测免疫前和二免疫后21 d的血清抗体滴度;攻毒后观察小鼠的精神状态、体重变化、攻毒部位变化和死亡情况,解剖并检测脏器载菌量。结果显示:r Slp A多克隆抗体可以增强血清对Cp的的杀菌活性,其细菌相对杀菌率为46.52%。r Slp A免疫小鼠后可诱导较高水平的Slp A抗体水平,对WZ攻毒小鼠的保护率为83.33%。表明r Slp A能作为Cp亚单位重

关键词：伪结核棒状杆菌基因组测序毒力基因重组蛋白表达疫苗

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翻译调控元件对CHO细胞重组蛋白表达的影响及机制

翻译调控元件对CHO细胞重组蛋白表达的影响及机制

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作者：张洹瑜新乡医学院

学位级别：硕士

背景大多数重组蛋白药物是由哺乳动物细胞表达的,其中中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是应用最广泛的重组蛋白表达平台,但CHO细胞瞬时蛋白表达量仍然不够理想。如何提高CHO细胞的瞬时表达能力成为研究的热点。从转录和翻... 详细信息

背景大多数重组蛋白药物是由哺乳动物细胞表达的,其中中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是应用最广泛的重组蛋白表达平台,但CHO细胞瞬时蛋白表达量仍然不够理想。如何提高CHO细胞的瞬时表达能力成为研究的热点。从转录和翻译到翻译后修饰和分泌的过程中,胞内蛋白合成受到多层次的调控。目前大多数的CHO细胞重组蛋白表达策略都关注于细胞的转录水平,如何通过翻译调控提高重组蛋白的产量仍不清楚,因此研究CHO瞬时表达系统的翻译调控具有重要意义。目的研究翻译调控元件对CHO细胞中重组蛋白表达的影响,提高重组蛋白产量。方法1.载体构建:在增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,e GFP)瞬时表达载体编码序列上游分别插入不同的非翻译区(untranslated region,UTR)翻译调控序列(UTR-1、UTR-2和UTR-3),构建三个瞬时表达载体(UTR-1-e GFP、UTR-2-e GFP和UTR-3-e GFP),再将白介素6(interleukin-6,IL6)和人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的编码序列替换e GFP的编码序列,构建分泌蛋白的瞬时表达载体(UTR-2-IL6和UTR-2-HSA)。2.瞬时表达分析:荧光显微镜观察、流式细胞术、蛋白质印迹法(Western Blot,WB)等方法,检测UTR序列对下游目的蛋白表达的影响。3.翻译调控序列的分析:对所有插入序列的上游AUG(upstream AUG,u AUG)起始密码子进行数量和位置统计,使用Mfold在线工具分析m RNA的5'UTR的二级结构,明确UTR-1和UTR-3对翻译效率的负面影响。另外,以5'端到3'端的顺序在UTR-2上寻找翻译调控元件,并结合二级结构的预测结果在理论上分析这些元件对翻译的促进作用。最后,使用核糖体分析(ribosome profiling,Ribo-seq)、WB和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对理论分析进行实验验证。4.翻译调控序列的优化:基于对UTR-2上翻译调控元件和自身序列特征的阐明,并结合其他研究中对翻译促进元件的总结,合成优化后的UTR-2-mod序列,验证能否在UTR-2的基础上进一步提高重组蛋白的表达量。结果1.载体经过酶切和测序,证实含三个非翻译区的不同目的蛋白表达载体构建正确。2.在e GFP编码序列上游分别插入UTR-1和UTR-3导致e GFP的瞬时表达量降低4.95%和19.69%,而插入UTR-2能够使e GFP、IL6和HSA的表达量提高约1.26～1.55倍。q PCR结果证明造成这一差异的原因是这些序列对下游蛋白的翻译效率存在不同的影响。3.在e GFP编码序列上游插入无u AUG的UTR-1后,额外的长度和发卡结构使CHO细胞中e GFP的瞬时的表达量略微降低,而插入含有5个u AUG的UTR-3则会因为翻译起始环境更加复杂而使核糖体难以识别正确的AUG,不仅影响N端肽链的保真性,甚至有移码突变的风险,导致翻译资源的浪费。相反,UTR-2中含有的上游ORF(upstream ORF,u ORF)、末端上游核糖体结合位点(termination upstream ribosomal binding site,TURBS)、18S r RNA的互补(complementary sequence to 18S r RNA,CR)序列和Kozak序列等翻译元件对e GFP的翻译有不同程度的促进作用,使表达量提高。通过RNA二级结构预测和5'UTR-18S-r RNA互补率的计算推测出了核糖体栓系(Ribo-tether)片段的作用机制,并与Ribo-seq的结果共同揭示了核糖体与5'UTR结合的位置及偏好性。4.结合前期的实验结果和序列分析结果,总结出了一系列的有利于重组蛋白翻译的序列特征,并在UTR-2上整合这些翻译促进元件,使HSA表达量进一步提高了10.12%。结论使用一种由整体到局部的5'UTR序列分析方法,阐明了各翻译调控序列影响CHO细胞中重组蛋白表达的机制,并为如何进一步提高蛋白表达提出了详细的序列优化思路。

关键词：重组蛋白表达翻译调控元件 5'非翻译区核糖体足迹 18S rRNA

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APRT缺陷型CHO细胞系的建立及对重组蛋白表达的影响

APRT缺陷型CHO细胞系的建立及对重组蛋白表达的影响

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作者：冯莹莹新乡医学院

学位级别：硕士

背景在生物制药工业中,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重组药物蛋白生产应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞克隆之间转基因表达水平的差异,导致重组蛋白表达的不稳定性(异质性)成为突出的问题。腺嘌呤磷酸核... 详细信息

背景在生物制药工业中,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是重组药物蛋白生产应用最为广泛的哺乳动物细胞表达系统。CHO细胞克隆之间转基因表达水平的差异,导致重组蛋白表达的不稳定性(异质性)成为突出的问题。腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)作为生物体内ATP合成中嘌呤补救途径的关键酶,不仅参与生物体嘌呤的合成代谢,还对基因沉默引起的基因表达具有重要的影响。因此,本研究通过基因编辑并筛选获得aprt基因敲除的CHO细胞系及研究其对重组蛋白表达的影响,以期最终建立一个基于APRT缺陷型细胞系的高效表达目的蛋白的基因扩增系统。目的采用CRISPR/Cas9基因编辑(gene editing)技术,敲除CHO细胞的aprt基因并筛选获得APRT缺陷型CHO细胞系,研究缺陷型细胞对重组蛋白表达的影响。方法(1)Aprt基因敲除及验证:根据CHO细胞aprt基因组序列设计并合成sg RNA,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除aprt基因,利用PCR扩增、测序和实时荧光定量PCR等方法鉴定基因敲除是否成功。(2)APRT缺陷型CHO细胞生物学特性验证:通过观察细胞形态和生长状态,进行生物学特性验证缺陷型CHO细胞系能否进行正常的生长和传代。即分别采用CCK-8法和倍增时间计算,检测缺陷型细胞的增殖情况;流式细胞术检测缺陷型细胞的凋亡情况。(3)重组蛋白真核表达载体的构建:以本实验室构建的表达报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,e GFP)真核表达载体为基础载体,在e GFP表达盒上游插入含有SV40启动子弱化或(和)aprt基因起始密码子突变的APRT表达盒,分别命名为弱化表达载体和突变表达载体;相应的目的蛋白真核表达载体是将e GFP分别替换为人玻连蛋白(human vitronectin,VN)或阿达木单抗(adalimumab,ADM)基因序列。将构建好的上述真核表达载体分别转染野生型和APRT缺陷型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池(cell pool)。(4)重组蛋白表达分析:转染筛选获得重组CHO-e GFP细胞池传代培养60代并用流式细胞术检测e GFP表达的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI),比较不同实验组e GFP的表达稳定性。转染筛选获得重组CHO-VN、CHO-ADM细胞池,并通过Western Blot比较不同实验组重组蛋白的表达量。结果(1)PCR扩增、测序和实时荧光定量PCR等检测结果表明,aprt基因DNA片段缺失141 bp,成功敲除CHO细胞aprt基因。(2)与野生型CHO细胞,获得的APRT缺陷型CHO细胞系,在细胞形态、细胞增殖和凋亡以及细胞的倍增时间无显著区别(野生型:17.69±0.3 h,APRT缺陷型:17.99±0.2 h)(P>0.05)。这些结果表明,aprt基因的敲除对CHO细胞的生物学特性无明显影响。(3)瞬时转染和稳定转染的细胞池检测结果表明,与重组野生型CHO细胞相比,e GFP在重组APRT缺陷型CHO细胞系中的表达显著提高(P<0.05)。(4)长期传代培养结果表明,在杀稻瘟菌素加压或不加压的情况下,转染弱化载体或突变载体的缺陷型细胞能够显著提高e GFP蛋白的表达量(P<0.05)。其中,转染突变载体的缺陷型细胞的e GFP表达量最高,其MFI是转染对照载体的野生型细胞的2.02倍。转染突变载体的两组重组CHO细胞表达e GFP较为稳定,e GFP蛋白的长期表达维持率均高于70%。(5)重组目的蛋白VN和ADM在缺陷型CHO细胞中的表达量均高于对照野生型CHO细胞。结论(1)通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了APRT缺陷型CHO细胞系,缺陷型细胞系与野生型CHO细胞在生物学特性方面无显著差异。(2)获得的APRT缺陷型CHO细胞系能够显著提高重组蛋白表达水平和表达稳定性,为最终建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的基因工程策略。

关键词：中国仓鼠卵巢细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因敲除重组蛋白表达

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殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的克隆及重组蛋白表达

殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因的克隆及重组蛋白表达

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作者：薛莹吉林大学

学位级别：硕士

殊异韦荣菌(Veillonella dispar)是口腔中常见的一种球菌，其具有专性厌氧以及生长缓慢的特点，其在口腔菌斑pH调节以及龋病的发生等方面都有着重要作用。电子传递黄素蛋白是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FlavinAdenine Dinucleotide,FAD)... 详细信息

殊异韦荣菌(Veillonella dispar)是口腔中常见的一种球菌，其具有专性厌氧以及生长缓慢的特点，其在口腔菌斑pH调节以及龋病的发生等方面都有着重要作用。电子传递黄素蛋白是一类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FlavinAdenine Dinucleotide,FAD)为辅酶的蛋白，参与细胞的电子传递及pH调节。本实验以殊异韦荣菌为研究对象，对其电子传递黄素蛋白基因(Electron Transfer Flavoprotein,etf)进行克隆及表达，为将来龋病防治提供理论基础。本实验第一部分提取殊异韦荣菌基因组，通过PCR反应扩增etf基因序列，并与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定后，进行测序验证。PCR产物特异大小约900bp。测序结果经Blast软件分析该序列为etf基因，通过基因序列及氨基酸的分析证明其具有完整的阅读框架，该基因序列已登录GenBank，序列号为JQ669939。第二部分构建etf-pET28a-c(+)重组质粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达，以及表达条件的优化。etf-pET28a-c(+)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，蛋白大小约33KD，设定七个诱导剂浓度梯度、七个诱导时间梯度成功摸索出etf-pET28a-c(+)重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达的最佳诱导条件为0.2mM IPTG诱导3小时，并通过超声裂解鉴定表达形式为包涵体，进行了重组蛋白的高效表达。本实验成功克隆了殊异韦荣菌的etf基因序列，通过基因序列及氨基酸的分析证明其具有完整的阅读框架，并进行了重组质粒的构建及最适表达条件的摸索，鉴定蛋白表达形式为包涵体，希望通过对其的研究能够为后续蛋白功能研究提供理论基础并为龋病防治探寻新途径。

关键词：殊异韦荣菌电子传递黄素蛋白基因克隆重组蛋白表达

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原癌基因Zbtb7A及其POZ功能区的重组蛋白表达与抗体制备

原癌基因Zbtb7A及其POZ功能区的重组蛋白表达与抗体制备

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作者：王会南京大学

学位级别：硕士

原癌基因Zbtb7A，即POK红系髓性致癌因子，是POK(POZ and Kruppel)家族的一员。POK家族成员含有N端的POZ功能区和C端的由Kruppel样锌指组成的DNA结合域，它们通过招募组蛋白脱乙酰酶(histone-deacetylases，HDAC)及随后的染色体重铸扮... 详细信息

原癌基因Zbtb7A，即POK红系髓性致癌因子，是POK(POZ and Kruppel)家族的一员。POK家族成员含有N端的POZ功能区和C端的由Kruppel样锌指组成的DNA结合域，它们通过招募组蛋白脱乙酰酶(histone-deacetylases，HDAC)及随后的染色体重铸扮演着转录抑制因子的作用。其中POZ区是一段高度保守的蛋白-蛋白相互作用域，已被证明可与其它蛋白的POZ区形成同源或异源二聚体。在人类许多肿瘤组织中，如人类淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌，尤其是淋巴瘤中，原癌基因Zbtb7A的呈高度表达水平。在小鼠胚胎成纤维细胞中，作为抑癌基因p19arf的特异性抑制物，过表达的Zbtb7可抑制其表达，从而以ARF-MDM2-p53的致癌模式而导致癌细胞分化。此外，Zbtb7还联合其它原癌基因，如E1A，H-rasv12，T-ag等，促进肿瘤细胞的增殖。因此，Zbtb7A在肿瘤发生、发展以及分化中扮演着重要作用。鉴于无商品化的Zbtb7A和POZ区重组蛋白以及抗Zbtb7A和POZ区抗体，本研究试图重组表达Zbtb7A蛋白及其POZ区，制备相应抗体，为以后的研究奠定工作基础。<br>　　在本研究第一部分，我们构建了可高效表达POZ功能区的原核重组表达系统及制备抗POZ区多克隆抗体。我们将优化密码子后的POZ区编码序列克隆到原核表达载体pET-26b(+)中，转入大肠杆菌BL21(DE3)中。经0.5mM的IPTG诱导表达我们获得了融合了His6标签的POZ蛋白重组表达。重组获得的POZ-His6蛋白被用于免疫制备多克隆抗体制备。我们每隔三周分三次免疫新西兰大白兔，并在最后一次加强免疫后一周取血。Western Blot分析制备的多克隆抗体效果。Western Blot结果表明，制备的多克隆抗体可用于Zbtb7A蛋白的检测。<br>　　在本研究第二部分，我们在毕赤酵母中重组表达了Zbtb7A蛋白并制备了其单克隆抗体。首先，通过分析Zbtb7A编码区的G+C含量及稀有密码子状况，我们优化了Zbtb7A编码序列，并由两步法PCR扩增获得了Zbtb7A全长编码序列。然后，我们将经测序确认正确的Zbtb7A编码片段克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中并经电转染转入到毕赤酵母感受态细胞GS115中。SDS-PAGE分析甲醇诱导的重组蛋白表达情况并以Western Blot鉴定。我们优化了重组菌株的表达条件并建立了纯化重组蛋白的两步法纯化体系。此外，我们还分析了重组蛋白的糖基化情况。SDS-PAGE和Western Blot分析表明我们成功获得了Zbtb7A重组蛋白。1％的甲醇浓度和4天诱导表达时间为该重组蛋白的较优表达条件。经阴离子交换柱层析和His柱亲和层析纯化重组蛋白，然后过超滤仪脱盐浓缩以及冻干处理，我们获得了较高纯度的蛋白，蛋白的产量为18mg/L。糖基化分析表明，该重组蛋白发生了糖基化，但无法为PNFase F蛋白酶所识别。<br>　　纯化的Zbtb7A蛋白被应用于单克隆抗体制备。我们每隔三周分三次免疫4-6周龄的BALB/c雌性小鼠。最后一次加强免疫后四天，我们取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，并用HAT/HT培养基筛选融合细胞。筛选得到的融合细胞经ELISA检测抗体分泌后，我们将阳性克隆进行了有限稀释，最终获得了稳定分泌Zbtb7A单克隆抗体的细胞株。我们将该细胞株腹腔注射4-6周龄的BALB/c雌性小鼠制备腹水。制备获得腹水经ELISA和Western Blot分析单克隆抗体效果。ELISA分析表明制备获得的腹水效价达到1:1024。Western Blot结果表明，制备的Zbtb7A单克隆抗体可特异性的识别内源性Zbtb7A蛋白。因此，我们成功制备了Zbtb7A重组蛋白及其单克隆抗体，为以后的研究奠定了基础。

关键词：原癌基因 POK红系髓性致癌因子 POZ功能区重组蛋白表达抗体制备

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SIGIRR胞内TIR区/GST融合蛋白表达载体的构建及重组蛋白表达

SIGIRR胞内TIR区/GST融合蛋白表达载体的构建及重组蛋白表达

引用

中华医学会呼吸病学年会——2013（第十四次全国呼吸病学学术会议）

作者：李少莹郭亮吕学军吴学玲钱桂生第三军医大学附属新桥医院

目的构建谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签的人单免疫球蛋白IL-1受体相关分子(SIGIRR)胞内TIR区融合蛋白原核表达载体,并诱导、纯化、鉴定其表达。方法采用PCR技术扩增出SIGIRR胞内TIR区(480-1230bp)基因片段,并将其重组于GST融合蛋白表达质粒... 详细信息

目的构建谷胱甘肽硫转移酶(GST)标签的人单免疫球蛋白IL-1受体相关分子(SIGIRR)胞内TIR区融合蛋白原核表达载体,并诱导、纯化、鉴定其表达。方法采用PCR技术扩增出SIGIRR胞内TIR区(480-1230bp)基因片段,并将其重组于GST融合蛋白表达质粒PGEX-5X-1中,酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒转化Ecoil-XL1-Blue感受态菌,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生SIGIRR胞内TIR区/GST融合蛋白,谷胱甘肽Sepharose 4B纯化融合蛋

关键词： SIGIRR 重组蛋白表达 TIR GST

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