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生物技术通报 2021年第9期37卷 180-190页

作者：曹汝菲李泽轩许欢张莎张敏敏戴枫段晓雷遵义医科大学生物化学教研室遵义563000 遵义医科大学检验医学院遵义563000 西北农林科技大学生命科学学院杨凌712100

获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能。构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-f... 详细信息

获得可用于X射线衍射的B.f Pif1单晶以用于探究B.f Pif1结构与功能。构建原核表达载体pET15b-SUMO-B.f Pif1,并进行B.f Pif1重组蛋白的诱导表达;经镍柱亲和层析、SUMO酶切、DEAE交换层析与S200凝胶过滤层析等一系列纯化;并利用Stopped-flow技术检测纯化蛋白的活性;使用结晶机器人及多种试剂盒进行结晶条件筛选与优化培养,并进行初步的X射线衍射分析。获得高纯度(>98.5%)与高浓度(17 mg/mL)的B.f Pif1蛋白,动力学结果显示其解旋活性良好。结晶实验表明:在0.1 mol/L Bis-Tris乙酸(pH 8.3),0.05 mol/L碳酸氢钠,5%甘油和0.015 mol/L亚精胺条件下培养出形态较好的单晶,其X射线衍射分辨率达到3.5?。成功表达纯化与结晶培养出具有较高分辨率的B.f Pif1蛋白的单晶。

关键词： Pif1解旋酶脆弱拟杆菌重组表达纯化蛋白结晶

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布氏锥虫eIF4E蛋白的表达纯化与晶体生长

布氏锥虫eIF4E蛋白的表达纯化与晶体生长

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作者：张珍珍安徽大学

学位级别：硕士

论文由布氏锥虫eIF4E蛋白和斑马鱼MO25蛋白初步晶体学研究两部分组成。　　布氏锥虫属动基体目、锥虫科中的锥虫属，是致病的鞭毛原虫寄生，可引发严重的传染病。在人类中主要为昏睡病，南美锥虫病和利什曼病，流行于非洲，通过采采蝇... 详细信息

论文由布氏锥虫eIF4E蛋白和斑马鱼MO25蛋白初步晶体学研究两部分组成。　　布氏锥虫属动基体目、锥虫科中的锥虫属，是致病的鞭毛原虫寄生，可引发严重的传染病。在人类中主要为昏睡病，南美锥虫病和利什曼病，流行于非洲，通过采采蝇传播。对人类和其他动物健康造成极大的干扰。目前，对这些寄生虫有效的疫苗的开发仍是一个难以实现的目标，而临床治疗手段仅限于化疗。常规药物的成本，毒性和抗药性问题导致迫切需要确定和开发新的治疗方向，而此关键是确立新的先导结构和新的药物靶标。　　真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)最初发现时为分子量为25KD的多肽。主要分布在细胞胞质内，细胞核内分布少量，与mRNA的5'端帽子结构特异性结合，在帽子依赖性翻译和mRNA输出发挥重要的调控作用。它多以游离或形成复合物存在，它能被其他蛋白所调节，如与支架蛋白eIF4G结合作为eIF4F复合物的一部分介导发挥其功能以及能够结合eIF4E蛋白远端背侧表面到帽子结合位点，并能调节帽子结合活性4EBPs(eIF4E binding proteins)蛋白。这两种蛋白质可增加eIF4E蛋白与5'cap结合的亲和力。在布氏锥虫中，真核生物翻译起始因子eIF4E(TbeIF4E)分为四个亚型(TbeIF4E1-4)，同时它们在生物体内，行使不同功能。　　目前布氏锥虫的eIF4E蛋白结合相关蛋白和调控翻译过程的途径仍然不清晰。因此我们构建了布氏锥虫eIF4E1(1-233aa)-C-His-pET22b，eIF4E2(1-251aa)-C-His-pET22b, eIF4E3(1-442aa)-C-His-pET28a,eIF4E4(1-427aa)-C-His-pET22b重组表达质粒。通过表达检测只获得eIF4E1的可溶性蛋白。再经过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化和Superdex200凝胶过滤层析后，SDS-PAGE检测后收集纯度较高较均一的蛋白坐滴气象扩散法进行晶体生长。　　MO25是一种保守的支架蛋白，它与假激酶STRAD共同激活肿瘤抑制基因LKB1从而发挥调控功能。MO25同样也能促进STE20家族激酶MST3，MST4，STK25，SPAK以及OSR1的活性。因此，我们纯化并结晶了斑马鱼的MO25(DrMO25)蛋白，然后采用X射线衍射，获得晶体衍射分辨率达到2.9(A)。此结构属于空间群为P3221，晶胞参数为a=b=156.665(A)，c=221.251(A)。此外，通过分子置换的方法对斑马鱼MO25的结构进一步确认。斑马鱼MO25由七个重复的螺旋组成，通过结构对比表明斑马鱼与人的MO25整体结构非常相似。我们的工作为MO25的进一步的功能和进化研究提供了一个结构基础。

关键词：布氏锥虫eIF4E 重组表达纯化晶体生长斑马鱼MO25蛋白晶体结构疫苗开发

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布氏锥虫elF4E蛋白的表达纯化与晶体生长

布氏锥虫elF4E蛋白的表达纯化与晶体生长

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作者：张珍珍安徽大学

学位级别：硕士

论文由布氏锥虫eIF4E蛋白和斑马鱼MO25蛋白初步晶体学研究两部分组成。布氏锥虫属动基体目、锥虫科中的锥虫属,是致病的鞭毛原虫寄生,可引发严重的传染病。在人类中主要为昏睡病,南美锥虫病和利什曼病,流行于非洲,通过采采蝇传播。对人... 详细信息

论文由布氏锥虫eIF4E蛋白和斑马鱼MO25蛋白初步晶体学研究两部分组成。布氏锥虫属动基体目、锥虫科中的锥虫属,是致病的鞭毛原虫寄生,可引发严重的传染病。在人类中主要为昏睡病,南美锥虫病和利什曼病,流行于非洲,通过采采蝇传播。对人类和其他动物健康造成极大的干扰。目前,对这些寄生虫有效的疫苗的开发仍是一个难以实现的目标,而临床治疗手段仅限于化疗。常规药物的成本,毒性和抗药性问题导致迫切需要确定和开发新的治疗方向,而此关键是确立新的先导结构和新的药物靶标。真核细胞翻译起始因子4E (eukaryotic translation initiation factor4E, eIF4E)最初发现时为分子量为25KD的多肽。主要分布在细胞胞质内,细胞核内分布少量,与mRNA的5’端帽子结构特异性结合,在帽子依赖性翻译和mRNA输出发挥重要的调控作用。它多以游离或形成复合物存在,它能被其他蛋白所调节,如与支架蛋白eIF4G结合作为eIF4F复合物的一部分介导发挥其功能以及能够结合eIF4E蛋白远端背侧表面到帽子结合位点,并能调节帽子结合活性4EBPs (eIF4E binding proteins)蛋白。这两种蛋白质可增加eIF4E蛋白与5’cap结合的亲和力。在布氏锥虫中,真核生物翻译起始因子eIF4E (TbeIF4E)分为四个亚型(TbeIF4E1--4),同时它们在生物体内,行使不同功能。目前布氏锥虫的eIF4E蛋白结合相关蛋白和调控翻译过程的途径仍然不清晰。因此我们构建了布氏锥虫eIF4E1(1-233aa)-C-His-pET22b, eIF4E2(1-25laa)-C-His-pET22b, eIF4E3(1-442aa)-C-His-pET28a, eIF4E4(1-427aa)-C-His-pET22b重组表达质粒。通过表达检测只获得eIF4E1的可溶性蛋白。再经过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化和Superdex200凝胶过滤层析后,SDS-PAGE检测后收集纯度较高较均一的蛋白坐滴气象扩散法进行晶体生长。 M025是一种保守的支架蛋白,它与假激酶STRAD共同激活肿瘤抑制基因LKB1从而发挥调控功能。M025同样也能促进STE20家族激酶MST3,MST4, STK25,SPAK以及OSR1的活性。因此,我们纯化并结晶了斑马鱼的M025(DrM025)蛋白,然后采用X射线衍射,获得晶体衍射分辨率达到2.9A。此结构属于空间群为P3221,晶胞参数为α=b=156.665A,c=221.251A.此外,通过分子置换的方法对斑马鱼M025的结构进一步确认。斑马鱼M025由七个重复的螺旋组成,通过结构对比表明斑马鱼与人的M025整体结构非常相似。我们的工作为M025的进一步的功能和进化研究提供了一个结构基础。

关键词：布氏锥虫eIF4E 重组表达纯化晶体生长斑马鱼MO25 晶体结构

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