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布氏杆菌PBP_(39)/pCDNATE重组表达质粒的构建及免疫效果的研究

中华微生物学和免疫学杂志 2006年第2期26卷 145-149页

作者：罗德炎高永辉张松乐袁园谢应国师伟王希良军事医学科学院微生物流行病研究所免疫学研究室北京100071

目的构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠观察诱导的特异性体液免疫、细胞免疫及免疫保护效果。方法克隆PBP39基因,构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒。首先转染Cos-7细胞,免疫组化检测其PBP39蛋白抗原的表达。然后用PBP39基因... 详细信息

目的构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠观察诱导的特异性体液免疫、细胞免疫及免疫保护效果。方法克隆PBP39基因,构建PBP39/pCDNATE重组表达质粒。首先转染Cos-7细胞,免疫组化检测其PBP39蛋白抗原的表达。然后用PBP39基因疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠4次,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌544A强毒株腹腔攻毒,观察PBP39重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的PBP39保护性抗原基因片段在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的PBP39/pCDNATE重组表达质粒在Cos-7细胞中有目的蛋白的表达。制备的PBP39重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测PBP39重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,抗体亚型以IgG2a为主,表明诱导了TH1型的免疫应答。MTT测定PBP39重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组差异有统计学意义。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较差异有统计学意义,说明PBP39重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的PBP39重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性抗体和细胞免疫,且以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。

关键词：布氏杆菌PB39 重组表达质粒免疫应答免疫保护

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乙肝病毒前S/S抗原的重组表达质粒对HBV转基因小鼠的免疫治疗效应

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世界华人消化杂志 2005年第7期13卷 844-847页

作者：周陶友陈敏赵连三王松陈守春何芳刘丽唐红四川大学华西医院感染性疾病中心人类疾病生物治疗国家重点实验室四川省成都市610041 深圳东湖医院内科广东省深圳市518000 成都地奥集团药物研究所四川省成都市610041

目的:观察重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S对HBVDNA复制和抗原表达的抑制效果.方法:以能表达乙肝表面抗原主蛋白S(HBsAg)的重组真核表达质粒为骨架,构建了分别含有HBV前S1抗原和/或前S2抗原编码基因的pcDNA3.1-S1S2S,pcDNA3.1... 详细信息

目的:观察重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S对HBVDNA复制和抗原表达的抑制效果.方法:以能表达乙肝表面抗原主蛋白S(HBsAg)的重组真核表达质粒为骨架,构建了分别含有HBV前S1抗原和/或前S2抗原编码基因的pcDNA3.1-S1S2S,pcDNA3.1-S2S,并各以100μg肌肉接种C57BL/6HBVDNA转基因小鼠,2,4wk后各加强免疫1次.然后动态检测小鼠血清HBVDNA水平的变化、抗-HBs和前S2抗体的诱生,以及肝组织内HBsAg、前S2抗原的消长情况.结果:小鼠肝组织内HBsAg,前S2抗原呈逐渐减弱的趋势,8wk后各有1/3的小鼠已不能检出.pcDNA3.1-S1S2S组接种后4,8,12wk抗-HBs阳转率分别为50%、67%、100%,明显高于pcDNA3.1-S2S组(17%、33%、50%)(P<0.05);而前S2抗体阳转率均低于17%.接种后8wk,12wk,pcDNA3.1-S1S2S组和pcDNA3.1-S2S组小鼠血清HBVDNA水平明显下降,均低于自身接种前、接种后4wk以及同期对照组(P<0.05).结论:重组表达质粒pcDNA3.1-S2S和pcDNA3.1-S1S2S接种,能够抑制转基因小鼠体内的HBV复制,而重组质粒中S1基因的共表达使抑制作用得到增强.

关键词：重组表达质粒 HBV转基因小鼠治疗效应乙肝病毒 pcDNA3 S抗原 HBV前S1抗原抗-HBs阳转率前S2抗原表面抗原主蛋白 C57BL/6 DNA水平血清HBV HBsAg 真核表达质粒 DNA复制前S2抗体抗体阳转率 HBV复制接种后抑制效果

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旋毛虫ES抗原结构基因TSPG Ⅱ 重组表达质粒构建

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西北农业大学学报 1999年第4期27卷 67-70页

作者：袁慧君阎玉河张改平李健强河南职业技术师范学院河南省农业科学院西北农业大学动物科学与动物医学学院

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ，从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因，经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定，同时表达载体也用相同的酶进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳，分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ... 详细信息

用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ，从克隆载体ｐＵＴＳⅡ中切出一个０．９８８ｋｂＴＳＰＧⅡ基因，经ＥｃｏＲＩ和ＢｓｔＸＩ酶切鉴定，同时表达载体也用相同的酶进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳，分别回收ＴＳＰＧⅡ基因和ｐＳＶ·ＳＰＯＲＴⅠ表达载体，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶定向连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取重组子，经ＥｃｏＲⅠ，ＢｓｔＸⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切鉴定，构建了重组表达质粒ｐＳＶ·ＴＳⅡ．

关键词：旋毛虫 ES抗原结构基因重组表达质粒

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猪干扰素-γ哺乳动物细胞重组表达质粒作为疫苗佐剂在小鼠体内的组织分布及环境安全性研究

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中国预防兽医学报 2008年第4期30卷 289-294页

作者：蒙学莲景志忠房永祥窦永喜陈国华贾怀杰段凤云才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒经肌... 详细信息

重组表达质粒作为免疫佐剂从实验室走向临床必须解决其对机体和生物环境释放的安全性问题。本研究以pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒作为免疫佐剂进行试验,探讨了其在小鼠体内组织的分布和生物安全性。将pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒经肌肉途径免疫小鼠,免疫后不同时间迫杀,并取各种组织抽提基因组DNA:一是利用PCR技术检测其在组织内的分布及与细胞基因组发生整合的可能性;二是以PCR技术检测免疫动物现场环境样品,监测pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒中的猪IFN-γ基因、CMV启动子基因和抗性基因是否转移和扩散到环境细菌中。结果表明,免疫24h后在小鼠的各组织中仅注射部位肌肉存在重组表达质粒,免疫5d后仅有1只小鼠注射部位肌肉和血液中存在重组表达质粒,免疫15d后所有动物的各组织中无重组表达质粒存在;同时未发现pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒整合到宿主细胞基因组和转化到环境其他细菌中。因此,认为pcDNA3.1/IFN-γ重组表达质粒对动物和环境是安全的。

关键词：重组表达质粒生物安全性组织分布基因组整合转移和扩散

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猪γ-干扰素基因真核重组表达质粒的构建

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中国兽医杂志 2005年第3期41卷 5-7页

作者：任慧英郭鑫杨汉春陈艳红查振林中国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室北京海淀100094

用 RT- PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪 γ-干扰素 (IFN- γ)基因 ,经克隆测序表明与已发表序列同源性为10 0 %。将目的基因插入表达载体 pc DNA3.1(+) ,构建出真核重组表达载体 IFN-γ- pc DNA。将重组质粒转染 COS7细胞 ,检... 详细信息

用 RT- PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪 γ-干扰素 (IFN- γ)基因 ,经克隆测序表明与已发表序列同源性为10 0 %。将目的基因插入表达载体 pc DNA3.1(+) ,构建出真核重组表达载体 IFN-γ- pc DNA。将重组质粒转染 COS7细胞 ,检测转染细胞培养上清 IFN- γ活性 ,结果表明转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抑制作用。

关键词： IFN-γ γ-干扰素目的基因转染真核重组表达质粒培养上清 COS7细胞表达载体序列同源性

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小RNA重组表达质粒转入猪体内环境释放安全性研究概况

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动物医学进展 2015年第12期36卷 161-164页

作者：寇建平孙亚妮赵钦周恩民农业部优质农产品开发服务中心北京100020 西北农林科技大学动物医学院农业部兽用药物与兽医生物技术陕西科学观测实验站陕西杨凌712100

人工小RNA(MicroRNA,miRNA)是根据内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,可以模拟内源miRNA的作用方式与靶mRNA碱基互配指导靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后负调控。将人工miRNA转入动物体内调控目的基因表达,已在转... 详细信息

人工小RNA(MicroRNA,miRNA)是根据内源miRNA的生成途径人工合成的miRNA,可以模拟内源miRNA的作用方式与靶mRNA碱基互配指导靶mRNA的降解或抑制其翻译,从而对基因表达进行转录后负调控。将人工miRNA转入动物体内调控目的基因表达,已在转基因动物抗病育种方面得到广泛的研究,与此同时其环境释放导致的生物安全性问题也成为国际关注的重要问题。论文综述了以RNA干扰为基础的转人工miRNA抗猪蓝耳病猪在动物逃逸、环境释放以及与转入基因与宿主基因整合等方面对环境生物安全的影响,以期为猪蓝耳病NMHCⅡ-A转基因猪的进一步研究提供生物安全保障。

关键词：重组表达质粒基因水平转移基因组整合人工miRNA

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LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达质粒的构建

LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达质粒的构建

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作者：马兴元沈阳农业大学

学位级别：硕士

为了使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性消失,同时仍保留其较强的免疫原性,该实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条寡核苷酸引物,采用突出末端PCR法和重组PCR法,将克隆于质粒pEWD299上的LT基因,分别引入BamHI,NdeI和XhoI等位点,扩增出带... 详细信息

为了使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性消失,同时仍保留其较强的免疫原性,该实验依据LT基因的同源序列设计并合成5条寡核苷酸引物,采用突出末端PCR法和重组PCR法,将克隆于质粒pEWD299上的LT基因,分别引入BamHI,NdeI和XhoI等位点,扩增出带有上述RE位点且含有m<,7>T m<,112>突变点的约1100bp和约800bp的DNA片段和不含突变点的约300bp的DNA片段,使控制LT毒力活性中心的第7位和第112位氨基酸的碱基分别发生诱变,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后,插入经BamHI和XhoI双酶切的线性化的高效表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点区,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达,将连接产物转化入JM105菌株,挑出可疑阳性菌落,提取质粒,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析,证明读框正确,序列正确,获得了pGEX-4T-1(LTm<,7>)和pGEX-4T-1(LTm<,112>)两个重组表达质粒.

关键词： LT克隆基因 PCR定点诱变重组表达质粒

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构建高拷贝数重组表达质粒在毕赤酵母高产量表达HBsAg中的应用

构建高拷贝数重组表达质粒在毕赤酵母高产量表达HBsAg中的应用

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第三次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会

作者：何成蔡蓓蓓楼觉人上海生物制品研究所第二研究室上海 200052

目的：通过构建高拷贝数表达质粒获得稳定高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法：通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5'***-TT)重复导入载体,构建成高拷贝数表达质粒。通过电转化、l5L规模发... 详细信息

目的：通过构建高拷贝数表达质粒获得稳定高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法：通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5'***-TT)重复导入载体,构建成高拷贝数表达质粒。通过电转化、l5L规模发酵、纯化获得纯化HBsA9颗粒,经ELISA、Western blot、SDS-PAGE、电镜、免疫学试验等方法对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行了研究。结果：高拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot等试验,显示出特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制剂能有效刺激小鼠产生保护抗体。结论：构建含高拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。此为获取低成本免疫用HBsAg提供了一条新的途径。

关键词：乙型肝炎表面抗原高拷贝数毕赤酵母重组表达质粒

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HMGN2的重组表达质粒的构建及其抗菌功能研究

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四川生理科学杂志 2005年第4期27卷 147-149页

作者：马懿冯云李恒黄宁吴琦王伯瑶四川大学华西医学中心基础医学与法医学院感染免疫研究室四川成都610041

目的:构建HMGN2重组表达载体,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法:用基因克隆的方法构建pET-32 a-c(+)-HMGN2重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化H is-HMGN2融合蛋白,Tric ine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,行琼脂糖弥散法检测... 详细信息

目的:构建HMGN2重组表达载体,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法:用基因克隆的方法构建pET-32 a-c(+)-HMGN2重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化H is-HMGN2融合蛋白,Tric ine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,行琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果:成功构建了pET-32 a-c(+)-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白对致病性大肠杆菌54080,54299以及金黄色葡萄球菌ATCC25923均有抗菌活性。结论:HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。

关键词： HMGN2 重组表达质粒抗菌功能抗菌作用功能研究 SDS-PAGE电泳致病性大肠杆菌琼脂糖弥散法金黄色葡萄球融合蛋白

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传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能分析

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫...

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会

作者：马金荣欧阳伟王永山吴晓悠朱向东张海彬范红结王忠灿唐雨德江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心南京农业大学动物医学院南京农业大学动物医学院南京军区军事医学研究所南京军区疾病预防控制中心

为了提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本实验在前期工作基础上,设计合成鸡补体C3d基因,利用同尾酶获得C3d的3拷贝串联体3C3d,与IBDV VP2基因串联,构建VP2-3C3d串联基因的重组真核表达质粒,在BHK21细胞中表达。... 详细信息

为了提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本实验在前期工作基础上,设计合成鸡补体C3d基因,利用同尾酶获得C3d的3拷贝串联体3C3d,与IBDV VP2基因串联,构建VP2-3C3d串联基因的重组真核表达质粒,在BHK21细胞中表达。并进一步对动物进行基因免

关键词：传染性法氏囊病病毒 C3d VP2 重组表达质粒串联基因免疫功能

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