检索结果-内蒙古大学图书馆

黑龙江畜牧兽医 2008年第6期 94-95页

作者：吕永智程文超重庆三峡职业学院农业与生物工程系重庆404001

美国波士顿儿童医院科学家在研究抗癌新方法及寻找新血管生长抑制剂的过程中,从无血管且具有抗癌作用的软骨提取物巾分离纯化到Troponin I,并证明Troponin I能够抑制血管内皮细胞生长和血管形成,阻断新血管生长及抑制实体瘤的生长与转移... 详细信息

美国波士顿儿童医院科学家在研究抗癌新方法及寻找新血管生长抑制剂的过程中,从无血管且具有抗癌作用的软骨提取物巾分离纯化到Troponin I,并证明Troponin I能够抑制血管内皮细胞生长和血管形成,阻断新血管生长及抑制实体瘤的生长与转移,其生物活性比目前已进入临床试验的所有的同类血管形成抑制剂包括endostatin和angiostatin要强10～100倍,是一种极具研究和开发价值的新型抗肿瘤药物.我们在构建重组表达质粒pET22b(+)-Tn I的基础上,拟建立了Troponin I的纯化工艺方案,这为明确它的临床药理学性质及开发出其临床药用价值奠定了基础.

关键词：分离纯化工艺重组表达质粒 endostatin 生长抑制剂血管形成抗癌作用临床试验药用价值

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人可溶性4-1BB蛋白分子表达载体的构建

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南京医科大学学报（自然科学版） 2003年第1期23卷 80-81页

作者：沈丽琴徐颖张学光苏州大学生物技术研究室江苏苏州215007

4-1BB分子是近年来发现的一种共刺激分子,属肿瘤坏死因子受体/神经生长因子受体(TNFR/NGFR)超家属成员,表达于活化的T淋巴细胞表面,以CD8+T细胞为主.

关键词：可溶性4-1BB 表达载体逆转录-聚合酶链反应重组表达质粒

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人β2微球蛋白成熟肽基因克隆及其原核表达载体的构建

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河南农业大学学报 2010年第1期44卷 91-95页

作者：张蕾李新生崔保安陈红英魏战勇孙凯宋亚鹏阮武营河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

根据GenBank基因库中人β2微球蛋白(β2m)成熟肽基因序列设计2对引物,使用RT-PCR法从健康人血液中扩增人β2m成熟肽基因,扩增产物进行T-A克隆和测序.结果表明,获得的人β2m成熟肽基因为297 bp,与模板序列的同源性为100%.利用基因重组技... 详细信息

根据GenBank基因库中人β2微球蛋白(β2m)成熟肽基因序列设计2对引物,使用RT-PCR法从健康人血液中扩增人β2m成熟肽基因,扩增产物进行T-A克隆和测序.结果表明,获得的人β2m成熟肽基因为297 bp,与模板序列的同源性为100%.利用基因重组技术,将β2m成熟肽基因亚克隆入pET-28 a(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-28/Humβ2m中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-28/Humβ2m.

关键词：人β微球蛋白克隆原核表达载体成熟肽重组表达质粒重组质粒四聚体基因工程技术免疫应答基因序列

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斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）hepcidin抗菌肽的基因工程制备

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）hepcidin抗菌肽的基因工程制备

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作者：赵冬梅上海海洋大学

学位级别：硕士

我国为世界水产大国，也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家。然而，亟待解决的种质、病害与环境等关键问题日趋严重。由于细菌性感染和细菌性疾病呈上升趋势，为解决这些问题导致大量抗生素的使用，不仅破坏水产养殖动物体内... 详细信息

我国为世界水产大国，也是世界上唯一水产养殖产量高于捕捞产量的国家。然而，亟待解决的种质、病害与环境等关键问题日趋严重。由于细菌性感染和细菌性疾病呈上升趋势，为解决这些问题导致大量抗生素的使用，不仅破坏水产养殖动物体内的正常菌落，而且抗生素易在动物体内残留。基因工程抗菌肽替代传统抗生素或作为环保型饵料添加剂，既可以增强水产养殖生物的抗病能力，又可以提高养殖水产品的质量。抗菌肽（Anti-bacterial peptides，简称ABP）是在诱导的条件下，动物免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是动物免疫防御系统的一个重要组成部分。抗菌肽具有广谱抗菌活性，同时还具有高效的抗真菌、抗病毒和抗肿瘤活性。因此，抗菌肽类物质在医药和农业上有广阔的应用前景。本研究涉及到的肝脏表达的抗菌肽hepcidin，最初是从人的血液中分离得到。目前已有的报道证明hepcidin对革兰氏阳性及阴性细菌均表现出抗菌活性，因此可以推测hepcidin可作为一种替代抗菌肽的绿色饲料添加剂在水产养殖中应用。本研究选取斑点叉尾鮰为研究对象，采用重组DNA技术来制备抗菌肽。本研究内容主要分为五部分，第一部分主要是斑点叉尾鮰hepcidin原前体肽及成熟肽基因的cDNA克隆。从斑点叉尾鮰的肝脏中提取总RNA，根据已知的斑点叉尾鮰hepcidin基因序列设计引物，以第一股cDNA为模板，利用RT-PCR技术扩增得到长度为291bp的hepcidin全长基因，再以hepcidin全长基因为模板，利用巢式PCR技术分别扩增得到长度为219bp的hepcidin原前体肽基因和长度为78bp的hepcidin成熟肽基因，并进行了序列测定。Hepcidin全长基因编码96个氨基酸残基组成的多肽；经信号肽预测分析，该多肽的信号肽由24个氨基酸残基组成，成熟肽由25个氨基酸残基组成。斑点叉尾鮰与其他生物之间hepcidin氨基酸序列的比对结果表明：斑点叉尾鮰与其他鱼类hepcidin之间氨基酸序列有较高的同源性，与哺乳动物之间显示了低的同源性，但是无论是鱼类还是哺乳动物都显示出位于多肽羧基端的8个半胱氨酸残基的高度保守，这与hepcidin抗菌活性密切相关。第二部分主要是hepcidin原前体肽基因和成熟肽基因的表达载体构建。以割胶纯化后的原前体肽基因和成熟肽基因分别作为模板，设计含EcoR I和Hind III酶切位点的引物，分别扩增得到长度为236bp的原前体肽基因pCH和长度为95bp的成熟肽基因mCH，将pCH、mCH和表达载体pET32a分别双酶切，利用DNA重组技术，在T4DNA连接酶的作用下，将pCH和mCH分别与表达载体pET32a连接。经过菌落PCR检验、双酶切鉴定及序列测定证实：成功构建了pET32a-pCH和pET32a-mCH重组表达质粒。第三部分主要是pCH和mCH在大肠杆菌中的融合表达及表达产物的纯化。将重组表达质粒pET32a-pCH和pET32a-mCH分别转化宿主工程菌*** BL21(DE3)，采用25℃，终浓度为1mmol/L的IPTG诱导融合蛋白表达。Tricine-SDS-PAGE分析结果表明：融合蛋白TrxA-pCH和TrxA-mCH得到了大量的表达。为了进一步获得高纯度的融合蛋白，利用IMAC即Ni-IDA琼脂糖凝胶柱的亲和作用对超声破碎后的总蛋白液进行层析，利用梯度的咪唑进行洗脱，通过Tricine-SDS-PAGE分析证明得到高纯度的TrxA-pCH和TrxA-mCH融合蛋白，其对应的分子量分别为33kD和26kD，与推断的分子量相符。将得到的高浓度TrxA-mCH融合蛋白进行肠激酶酶切处理。酶切后的酶切混合物再经过超滤离心分离浓缩经Tricine-SDS-PAGE分析后将含有目的蛋白mCH的凝胶进行MALDI-TOF-TOF分析，分析结果证明获得了高纯度的目的蛋白mCH。第四部分主要是mCH成熟肽的抑菌活性鉴定。抑菌活性鉴定采用琼脂糖弥散法，以50μ g/mL氨苄青霉素为阳性对照，以无菌的ddH2O为空白对照。阳性对照产生了明显的抑菌圈，而空白对照未产生抑菌圈，说明抑菌实验具有充分的可信度和较好的效果。mCH显示出对革兰氏阳性和阴性细菌的抑制作用。第五部分主要是两种hepcidin成熟肽基因的cDNA串联及其真核表达载体的构建。根据已有的斑点叉尾鮰hepcidin成熟肽基因mCH及尼罗罗非鱼hepcidin成熟肽基因mTH为模板，通过设计含有交叉互补序列的引物，利用SOE-PCR技术将mCH和mTH基因串联扩增得到156bp的mCH-mTH片段。根据mCH-mTH的序列，设计含Xho I和Xba I酶切位点的引物，扩增得到168bp的片段。对mCH

关键词：斑点叉尾鮰 hepcidin 重组表达质粒融合表达活性鉴定 MALDI-TOF-TOF分析

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RNA干扰对胃癌MGC803细胞E2F-1基因表达及其生物学行为的研究

RNA干扰对胃癌MGC803细胞E2F-1基因表达及其生物学行为的研究

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作者：尹永硕广西医科大学

学位级别：硕士

第一部分小分子干扰RNA对胃癌细胞E2F-1表达及其功能研究目的探讨小分子干扰RNA（siRNA）对胃癌MGC803细胞E2F-1基因表达及其生物学行为的影响。方法用LipofectamineTM2000把E2F-1-siRNA（实验组）和negativecontrol-siRNA（阴性对照组... 详细信息

第一部分小分子干扰RNA对胃癌细胞E2F-1表达及其功能研究目的探讨小分子干扰RNA（siRNA）对胃癌MGC803细胞E2F-1基因表达及其生物学行为的影响。方法用LipofectamineTM2000把E2F-1-siRNA（实验组）和negativecontrol-siRNA（阴性对照组）转染MGC803细胞,转染48h后,采用实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）及蛋白印迹（western blotting）技术分别检测E2F-1 mRNA及蛋白的表达,四唑盐（MTT）法检测MGC803细胞增殖的变化,流式细胞仪检测MGC803细胞周期变化。应用体外侵袭实验及克隆实验分别检测E2F-1-siRNA对胃癌MGC803细胞侵袭力和增殖力的影响。结果E2F-1-siRNA和阴性对照siRNA由脂质体介导成功转染胃癌MGC803细胞,E2F-1-siRNA有效抑制了胃癌细胞E2F-1 mRNA的表达,与阴性对照组及未转染组细胞比较分别降低了84.8%和85.3%（P＜0.05）;E2F-1-siRNA抑制胃癌MGC803细胞E2F-1蛋白的表达,与阴性对照组及未转染组细胞比较降低了77.2%和79.6%;E2F-1-siRNA抑制MGC803细胞的增殖,与阴性对照组和未转染组比较增殖分别抑制了69%和81.6%,差异有统计学意义（P＜0.05）;E2F-1-siRNA促使更多MGC803细胞DNA含量聚集于G2/M期附近,G2/M期DNA含量比例为（54.98±3.46）%,与阴性对照组（44.70±3.82）%和未转染组（31.47±2.12）%比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。同时,细胞体外侵袭力及增殖能力相应减弱（P＜0.05）。结论E2F-1-siRNA能有效抑制人胃癌MGC803细胞E2F-1mRNA及蛋白的表达,使G1期细胞的DNA含量下调,同时显示细胞分裂停滞在G2/M期附近,进而抑制其增殖,并在一定程度上抑制了胃癌细胞的侵袭能力,E2F-1有望成为胃癌基因治疗的有效靶点。第二部分转录因子E2F-1 siRNA表达质粒的构建及沉默效应目的转录因子E2F-1作为细胞周期进程中重要的调控因子,与肿瘤的发生有着密切的关系。本研究通过构建人E2F-1基因的小干扰RNA（smallinterfering RNA,siRNA）表达质粒,探讨其对胃癌MGC803细胞中E2F-1基因表达的影响。方法将设计合成的具有短发夹结构的人E2F-1基因的siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1-CMVneo表达质粒,并做酶切及测序鉴定。用脂质体把构建的重组质粒转染至MGC803细胞,采用实时定量PCR（real-time quantitative PCR）及蛋白印迹（western blotting）技术分别检测E2F-1 mRNA及蛋白的表达。结果经酶切及测序鉴定,成功构建了E2F-1 siRNA表达质粒;它可显著抑制MGC803细胞中E2F-1基因的mRNA及蛋白的表达,与未转染组及阴性对照组细胞比较,分别降低了86.4%、86.1%和81.5%、79.6%。结论成功构建了E2F-1 siRNA表达质粒,pSilencer4.1-E2F-1能抑制人胃癌MGC803细胞E2F-1基因的表达,为进一步E2F-1基因的功能研究及胃癌治疗研究提供了实验基础。第三部分基因表达谱芯片筛选E2F-1小分子干扰胃癌细胞的相关差异表达基因目的利用基因表达谱芯片技术筛选转染E2F-1-siRNA（实验组）和negative control-siRNA（阴性对照组）的胃癌MGC803细胞间差异表达基因。方法分别抽取转染E2F-1-siRNA和negative control-siRNA的胃癌MGC803细胞的总RNA。采用逆转录的方法,制成cDNA链,并以两种荧光Cy5和Cy3标记后作为探针,与含有21522条人类22K基因表达谱芯片进行杂交。采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪（CapitalBio公司）扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan3.0图像分析软件（CapitalBio公司）对芯片图像进行处理和分析。结果在21522条基因中,胃癌MGC803细胞分别转染E2F-1-siRNA和negative control-siRNA后差异性表达基因18条,其中上调基因8条,下调基因10条,上调与下调的基因中各有1条功能信息不明。结论胃癌发生过程涉及多基因相互作用、多种信号通路相互调节和拮抗。体外干扰E2F-1

关键词：胃癌小分子干扰RNA E2F-1 细胞周期细胞增殖侵袭 RNA干扰 E2F-1 胃癌MGC803细胞重组表达质粒胃癌 RNA干扰 E2F-1 基因表达谱芯片差异表达基因

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高迁移率蛋白N2抗口腔致病菌及抗乙肝病毒功能

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中国组织工程研究 2016年第B5期20卷 133-134页

作者：张永红白求恩国际和平医院口腔科河北省石家庄市050082

背景：高迁移率蛋白主要结合于真核细胞的活性转录基因的核小体区域内，在维持染色质活性结构，以及基因转录，复制等过程中起着重要作用。目的：探讨高迁移率蛋白N2分子抗口腔致病菌及抗乙肝病毒的作用。方法：用基因克隆的方法构建pGE... 详细信息

背景：高迁移率蛋白主要结合于真核细胞的活性转录基因的核小体区域内，在维持染色质活性结构，以及基因转录，复制等过程中起着重要作用。目的：探讨高迁移率蛋白N2分子抗口腔致病菌及抗乙肝病毒的作用。方法：用基因克隆的方法构建pGEX-4T-1-高迁移率蛋白N2重组表达质粒，经IPTG诱导表达后，亲和层析方法纯化GST-高迁移率蛋白N2融合蛋白，凝血酶酶切融合蛋白，获得目的蛋白，Tricine—SDS-PAGE电泳鉴定其相对分子质量，琼脂糖弥散法检测其抗口腔致病菌功能，微量直接法检测其抗乙肝病毒功能。结果与结论：构建的pGEX-4T-1-高迁移率蛋白N2重组表达质粒，其表达获得的目的蛋白对口腔致痴性变异链球菌和牙龈卟啉单胞菌均有抗菌活性，对乙肝病毒的复制有一定的抑制作用。结果说明，高迁移率蛋白N2具有抗口腔细菌和乙肝病毒的作用。

关键词：组织工程高迁移率蛋白N2 重组表达质粒抗口腔致病菌

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一人α-synuclein cDNA克隆及异源表达研究二 Chloroperoxidase基因在毕赤酵母系统的表达研究

一人α-synuclein cDNA克隆及异源表达研究二 Chloroperoxidase...

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作者：韩杨中国协和医科大学

学位级别：硕士

α-synuclein主要存在于中枢神经系统的突触前末梢。该蛋白目前已受到国内外学者的普遍关注，主要原因在于发现它的功能异常与几种神经退行性疾病，如帕金森氏病（parkinson’s disease，PD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies，... 详细信息

α-synuclein主要存在于中枢神经系统的突触前末梢。该蛋白目前已受到国内外学者的普遍关注，主要原因在于发现它的功能异常与几种神经退行性疾病，如帕金森氏病（parkinson’s disease，PD）、路易体痴呆（dementia with Lewy bodies，DLB）和老年性痴呆（Alzheimer’s disease，AD）有关。α-synuclein的生理功能至今仍不完全清楚。有一些报道显示：α-synuclein与神经细胞膜的稳定性和可塑性有关，并具有抗神经细胞凋亡的作用和分子伴侣样功能，它还参与了信号传导过程。但其他一些报道则表明，它的异常积累和聚集将导致α-synuclein类疾病，如PD的发生，而且这是一个由环境或遗传因素触发的级联（cascade）反应，包括α-synuclein的错误折叠与正常功能的丧失。在高浓度时，α-synuclein（以及它的突变体形式A53T和A30P）有自我聚集的倾向，导致寡聚体初原纤维、原纤维和多聚体的形成。有证据显示两种突变体形成初原纤维的速率高于其野生型蛋白，而A30P形成原纤维的速率较低，A53T形成原纤维的速率较高。α-synuclein的寡聚体（protofibril）被认为具有神经细胞毒性，能引起细胞凋亡。鉴于α-synuclein具有上述病理学特征，且神经细胞内α-synuclein聚集体的形成又是几种神经退行性疾病，如PD的一个特性，α-synuclein有可能被作为一个潜在的靶点用于新型抗PD药物的寻找。本文从人骨髓神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中成功克隆到α-synuclein编码序列并完成A53T点突变，后者将被用于构建PD转基因动物的表达载体。同时在毕赤酵母中成功表达了人α-synuclein的A53T突变蛋白，并初步观察了A53T突变型α-synuclein在酵母细胞内表达对细胞生长的影响。以多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞总RNA为模板，应用RT-PCR方法扩增了人α-synuclein包含编码区的cDNA片段，核苷酸序列分析表明扩增片段与GenBank报道序列完全一致。将目的基因进行定点突变，使Ala53→Thr，将获得的突变基因进行以下研究： 1)亚克隆到pcDNA3.0，构建含BGH polyA site的重组质粒，用于进一步构建PD转基因动物重组表达质粒。每一步得到的亚克隆经序列测定与比对，准确无误。 2)将α-synuclein A53T编码区序列插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的α-因子信号肽编码基因序列下游，构建重组质粒pPIC9K-Sym；进一步构建含有绿色萤光蛋白（GFP）融合基因的重组质粒pPIC9K-SyGFP。重组质粒用SacⅠ线性化后，采用电击方法转入毕赤酵母感受态（Pichia pastoris GS115）细胞。利用MD培养基和含有G418的YPD培养基筛选出His+Mut+转化子。转化子经PCR鉴定后，用BMMYC培养基培养，以终浓度为1％（v／v）的甲醇诱导表达。发酵夜上清经过SDS-PAGE分析，发现转入pPIC9K-SyGFP的转化子在40kDa处有特异蛋白条带，而转入pPIC9K-Sym的转化子在20kDa处有蛋白条带。Western blot实验结果证实表达蛋白为重组人α-synuclein。 3)将α-synuclein A53T编码区序列亚克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K上，构建胞内重组表达质粒pPIC3.5K-Sym和pPIC3.5K-SyGFP，用上述方法转化毕赤酵母感受态（Pichia Pastoris GS115）细胞并进行转化子筛选。甲醇诱导表达后，用荧光显微镜观察到含pPIC3.5K-SyGFP的重组菌株产生绿色荧光，根据荧光强度判断，融合蛋白表达量很高，并且主要集中在细胞质。转化子经液体及固体培养和甲醇诱导后，没有见到细胞凋亡现象，生长反而比较旺盛，其原因可能在于转化子尚缺乏一定的环境和遗传方面的条件。鉴于某些基因缺失突变会显著增加酵母对α-synuclein的敏感性（增强α-synuclein毒性），对GS115／pPIC3.5K-SyGFP转化子进行了紫外诱变处理，获得了一些在MM培养基（碳源：甲醇）上生长受到抑制、而在MD培养基（碳源：葡萄糖）上生长基本正常的突变株（如uv13），这些突变株在MM培养基上的生长速率也明显低于对照转化子在MM培养基上的生长速率。对此模型进行优化并将其用于高通量筛选将有助于寻找对抗α-synuclein毒性的化合物。海洋真菌Caldariomyces fumago分泌的氯化物过氧化物酶（Chloroperoxidase，CPO；EC 1.11.1.10），相对分子量42kDa，是

关键词： CPO 双酶切多巴胺能神经元细胞凋亡 Chloroperoxidase 毕赤酵母初原纤维 GFP 甲醇诱导重组表达质粒 synuclein cDNA 异源表达

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鸡a干扰素成熟蛋白基因的表达

鸡a干扰素成熟蛋白基因的表达

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作者：李丽宁夏大学

学位级别：硕士

干扰素(简称IFN)是一种具有抗病毒、调节免疫、抑制细胞分裂和促进细胞凋亡等多种生物学活性的细胞因子。信号肽是指在新合成的多肽链中指导蛋白质跨膜运输的氨基酸残基，其长度绝大多数是20～30个氨基酸残基，以含疏水氨基酸为主，位于... 详细信息

干扰素(简称IFN)是一种具有抗病毒、调节免疫、抑制细胞分裂和促进细胞凋亡等多种生物学活性的细胞因子。信号肽是指在新合成的多肽链中指导蛋白质跨膜运输的氨基酸残基，其长度绝大多数是20～30个氨基酸残基，以含疏水氨基酸为主，位于“N”端。信号肽对蛋白质的定位有着非常重要的作用，尤其是适当改造信号肽结构可以提高外源蛋白的分泌效率。多数外源基因在大肠杆菌宿主中过量表达时，常常导致表达产物在胞内形成不溶性的聚集体，即形成包涵体。包涵体表达具有表达量大的优点，但其中的重组蛋白缺乏生物学活性，需要进行变性和复性才能恢复其活性。因此，改造包涵体重组表达质粒，向其中加一段L-天(门)冬酰胺酶Ⅱ(ASP)信号肽，用以提高外源蛋白的分泌效率，这种方法对真核分泌蛋白尤为有效。　　本研究设计一对特异性引物，从鸡肝脏中扩增出编码α干扰素的成熟蛋白基因(ChIFN-α);将扩增得到的鸡α干扰素的成熟蛋白基因与原核表达载体pET-28a(+)融合，构建成原核重组表达质粒pET-28a/ChIFN-α，并对其诱导表达，考察编码鸡α干扰素的成熟蛋白基因的表达效果;在此工作的基础上，通过设计一对特异性引物，从大肠杆菌中扩增出编码ASP信号肽的基因片段，将ASP信号肽基因插入到pET-28a/ChIFN-α质粒中构建成分泌型原核重组表达质粒pET-28a/ChIFN-α-ASP，并对其进行诱导表达，考察ASP信号肽在重组表达质粒中的分泌表达作用和编码鸡α干扰素的成熟蛋白基因的表达效果。　　研究结果表明，已构建的两种原核重组表达质粒均能表达鸡α干扰素成熟蛋白。其中，原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α的表达方式为包涵体型，蛋白表达量为27％;重组质粒pET-28a/ChIFN-α-ASP的表达方式为分泌型，蛋白表达量为38％。通过对这两种重组质粒的表达效果比较得出，原核重组质粒pET-28a/ChIFN-α-ASP对外源基因进行分泌型诱导表达，不形成包涵体，从而简化了变性、复性过程，为筛选出鸡α干扰素成熟蛋白的高效表达菌株奠定了基础。

关键词：干扰素成熟蛋白基因原核表达信号肽重组表达质粒

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弓形虫SAG1真核表达质粒的体外表达及其诱导的细胞免疫应答

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中国人兽共患病学报 2004年第Z1期21卷 88-页

作者：黄达娜吴少庭袁仕善张仁利高世同龙彩虹林琦萍雷明军潘晖榕深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 华南农业大学兽医学院广州510642 华南农业大学兽医学院广州510642 华中科技大学同济医学院武汉430030 华中科技大学同济医学院武汉430030

　　分析弓形虫SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.重组表达质粒pVAX1-SAG1瞬时转染vero细胞,Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒pVAX1-SAG1及空质粒pVAX1于0周、4周分别经肌注免疫BALB/c小... 详细信息

　　分析弓形虫SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.重组表达质粒pVAX1-SAG1瞬时转染vero细胞,Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒pVAX1-SAG1及空质粒pVAX1于0周、4周分别经肌注免疫BALB/c小鼠;第8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经ConA和抗原刺激,用MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率;使用直接免疫荧光法,用流式细胞仪对CD4+、CD8+T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的26kDa的特异带,与理论值相符;抗原刺激小鼠脾T淋巴细胞发生增殖反应,免疫组与空质粒对照组间差异有显著性(P<0.05),但ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性(P>0.05);T细胞亚群CD4+、CD8+动态分析,CD4+、CD8+T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性(P1<0.05,P2<0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.真核表达质粒pVAX1-SAG1在vero细胞中获得表达,且能诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答. ……

关键词：弓形虫感染重组真核表达质粒体外表达淋巴细胞免疫组小鼠对照组组间差异细胞亚群免疫应答抗原刺激攻击感染直接免疫荧光法重组表达质粒平均存活时间流式细胞仪转染细胞增殖反应细胞数量细胞发生

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八肋游仆虫rab基因的克隆与表达

八肋游仆虫rab基因的克隆与表达

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作者：樊俊蝶山西大学

学位级别：硕士

真核细胞中细胞器在空间上分布不同，各细胞器之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递。Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关，在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。纤毛虫是单细胞的原生... 详细信息

真核细胞中细胞器在空间上分布不同，各细胞器之间通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递。Rab蛋白作为真核细胞中各细胞器之间囊泡运输的分子开关，在囊泡运输的不同阶段调节囊泡特定的运输途径。纤毛虫是单细胞的原生动物，在进化上属于低等的真核生物，但其各细胞器之间囊泡运输系统极为完善。研究Rab蛋白在单细胞真核生物纤毛虫中的功能及阐明囊泡定向运输机理具有重要意义。本研究利用PCR技术从游仆虫(Euplotes octocarinatus)大核DNA中扩增出rab基因，并对该基因进行序列分析，该基因全长为783bp，两端为端粒序列，编码框为624bp，编码207个氨基酸，开放读框中有3个TGA，在此编码半胱氨酸。该基因拟编码的蛋白属于Rab蛋白家族，具有Rab蛋白家族保守的结构特征。系统进化树呈现的规律表明该Rab蛋白可能在囊泡从内质网到高尔基体的运输途径中起作用将游仆虫rab基因(Eo-rab1)构建于克隆载体pGEM-T Easy得重组质粒pGEM-T-Eorab1。以此重组质粒为模板进行PCR定点突变，将Eo-rab1基因中前两个TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGC，获得截短型Eo-rab1基因。以第一次突变后的重组质粒为模板，进行第二次突变，获得全长型Eo-rab1基因。分别将全长型Eo-rab1基因和截短型Eo-rab1基因构建于原核表达载体pGEX-4T-2中，得到重组表达质粒pGEX-Eorab1和pGEX-deEorab1。将重组表达质粒pGEX-Eorab1和pGEX-deEorab1分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。全长型和截短型融合蛋白与抗GST抗体分别在49kD、37kD处有很强的交叉反应。全长型和截短型融合蛋白通过亲和层析柱纯化后经凝血酶酶切分析表明全长型和截短型Eo-rab1基因获得融合表达。全长型融合蛋白经凝血酶酶切和进一步亲和纯化得到达电泳纯的游仆虫Rab蛋白(EoRab1)。这为GTPase活性的深入研究，抗体的制备及细胞内定位准备了前提物质。

关键词：八肋游仆虫 GTPase Rab 重组表达质粒 rab 克隆与表达

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