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中国人兽共患病学报 2004年第Z1期21卷 89-90页

作者：林绮萍吴少庭翁亚彪秦莉黄达娜袁仕善华南农业大学兽医学院广州510642 圳市疾病预防控制中心广东深圳518020 华南农业大学兽医学院广州510642 华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系武汉430030 圳市疾病预防控制中心广东深圳518020 圳市疾病预防控制中心广东深圳518020

　　构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在HEK-293细胞中的表达情况.采用PCR方法自弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-GRA4重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入HEK-... 详细信息

　　构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在HEK-293细胞中的表达情况.采用PCR方法自弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-GRA4重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入HEK-293细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物.从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段,成功构建重组表达质粒pVAC-GRA4;转染GRA4的HEK-293细胞,RT-PCR检测可见一条约987bp的目的条带,表达产物经Western-blot鉴定,其分子量约为41kD,能被pET-GRA4重组蛋白免疫血清所识别.构建的真核表达质粒pVAC-GRA4能在HEK-293细胞中表达,为弓形虫疫苗的进一步研究打下基础.……

关键词：弓形虫基因片段真核表达重组质粒真核表达质粒细胞构建重组表达质粒致密颗粒蛋白真核表达载体基因组脂质体介导转染重组蛋白免疫血清扩增鉴定检测定向克隆分子量疫苗

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猪囊尾蚴AgB重组质粒在免疫小鼠体内的表达及其抗体水平检测

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中国预防兽医学报 2010年第6期32卷 488-490页

作者：巩伟侯俊玲骆学农张少华郭爱疆才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生病重点实验室甘肃兰州730046 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

为评价猪囊尾蚴副肌球蛋白(AgB)真核表达重组质粒作为候选DNA疫苗的免疫效果,本研究将猪囊尾蚴AgB基因亚克隆于真核表达载体pVAX1中构建了重组表达质粒pVAX1-AgB;将pVAX1-AgB与ISA206佐剂按1:1体积比乳化,以每只100μg的剂量,肌肉注免疫... 详细信息

为评价猪囊尾蚴副肌球蛋白(AgB)真核表达重组质粒作为候选DNA疫苗的免疫效果,本研究将猪囊尾蚴AgB基因亚克隆于真核表达载体pVAX1中构建了重组表达质粒pVAX1-AgB;将pVAX1-AgB与ISA206佐剂按1:1体积比乳化,以每只100μg的剂量,肌肉注免疫5周龄左右的BALB/c小鼠,3周后加强免疫。同时,通过原核表达制备重组AgB蛋白作为ELISA检测抗原,通过间接ELISA方法检测免疫小鼠的抗体水平。结果显示,在小鼠免疫后2周即可检测到抗AgB抗体,6周达到峰值,并维持在较高水平,持续达8个月;实验组血清抗体水平明显高于对照组(p<0.01)。本研究为pVAX1-AgB作为候选DNA疫苗提供了实验依据。

关键词：重组表达质粒 pVAX1 免疫

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弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达

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中国人兽共患病学报 2004年第Z1期21卷 86-87页

作者：袁仕善吴少庭黄达娜张仁利高世同余新炳中山大学基础医学博士后流动站深圳市疾病预防控制中心科研基地深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 中山大学广州510089

　　构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒.设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVA C而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8... 详细信息

　　构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒.设计GRA8的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA8的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVA C而构建真核重组表达质粒pVAC-GRA8,转化大肠杆菌DH5α;将构建的真核重组表达质粒pVAC-GRA8转染vero细胞,分析转染vero细胞中GRA8的表达状况.PCR扩增出GRA8基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAC,构建了真核重组表达质粒pVAC-GRA8;在vero细胞中获得表达.成功构建了GRA8的真核重组表达质粒pVAC-GRA8.……

关键词：弓形虫真核表达质粒构建重组表达质粒真核表达载体亚克隆转化大肠杆菌致密颗粒蛋白细胞基因片段多聚酶链反应转染特异引物特异片段扩增基因组状况设计技术编码

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转录因子E2F-1 siRNA表达质粒的构建及对胃癌MGC803细胞的沉默效应

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广西医学院学报 2008年第2期18卷 175-178页

作者：尹永硕肖强谢玉波李雷王长青唐振勇马玉林崔建华广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科南宁530021 广西医科大学第一附属医院麻醉科南宁530021

目的:通过构建人E2F-1基因的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,探讨其对胃癌MGC803细胞中E2F-1基因表达的影响。方法:将设计合成的具有短发夹结构的人E2F-1基因siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4·1... 详细信息

目的:通过构建人E2F-1基因的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,探讨其对胃癌MGC803细胞中E2F-1基因表达的影响。方法:将设计合成的具有短发夹结构的人E2F-1基因siRNA寡核苷酸链退火形成双链,连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4·1-CMVneo表达质粒,并做酶切及测序鉴定。用脂质体把重组质粒转染至细胞,采用实时定量PCR(real-time quantitativePCR)及蛋白印迹(western blotting)技术分别检测E2F-1mRNA及蛋白表达。结果:经酶切及测序鉴定,成功构建了E2F-1 siRNA表达质粒;它可显著抑制MGC803细胞中E2F-1基因mRNA及蛋白表达,与未转染组及阴性对照组细胞比较,分别降低了86·4%、86·1%和81·5%、79·6%。结论:pSilencer4·1-E2F-1重组质粒能抑制人胃癌MGC803细胞E2F-1基因的表达,为进一步E2F-1基因的功能研究及胃癌治疗研究提供了实验基础。

关键词： RNA干扰胃癌MGC803细胞 E2F-1 重组表达质粒

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Ag43/GFP嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达

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广东医学 2015年第4期36卷 517-521页

作者：黄用豪赵焕阁周松林林映莹谭光宏黄风迎海南医学院海南省热带病重点实验室海口571199

目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒... 详细信息

目的构建大肠杆菌抗原Ag43(p ETAg43')以及Ag43和绿色荧光蛋白(GFP)(p ETAg43'/GFP)的重组表达质粒,了解p ETAg43'/GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列(Ag43'),同时用酶切方法从质粒p EGFP-C1切取GFP基因序列,首先将Ag43'基因序列插入表达质粒p ET-22b中,获得重组质粒p ETAg43',然后再将GFP基因序列插入p ETAg43'获得质粒p ETAg43'/GFP。将重组质粒p ETAg43'/GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109(△Ag43),用荧光显微镜和SDS-PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43'/GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43'和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒p ETAg43'和p ETAg43'/GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒p ETAg43'/GFP经诱导后可以将Ag43'/GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109(△Ag43)的表面,55℃加热50 min是提取Ag43'/GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43'/GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。

关键词：抗原Ag43 绿色荧光蛋白嵌合重组蛋白质重组表达质粒细菌表面表达

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HCV核心基因插入突变体编码蛋白对人肝癌细胞系(Huh-7)细胞基因表达的影响

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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第6期25卷 501-506页

作者：窦骏刘蓬勃东南大学基础医学院病原生物学与免疫学系南京210009 美国爱默蕾大学医学院病理学与实验医学系

目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core,C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh7)表达,探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系。方法构建HCV1bC基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒,建立表达C基因插... 详细信息

目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core,C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh7)表达,探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系。方法构建HCV1bC基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒,建立表达C基因插入突变体编码蛋白Huh7细胞系,按Affymetrix公司实验程序制备探针、再与该公司HGU133A和HGU133B芯片杂交。对基因表达上调或下调≥3倍的基因,用NetAffx作进一步分析。并用半定量RTPCR对其中3个上调基因进行鉴定。结果Microarray分析显示,HCV1bC基因插入突变体编码蛋白比C蛋白引起更多的基因表达改变,主要集中在信号传导、蛋白酶活性、分子转运、免疫反应等,特别是免疫反应基因表达更加显著。C基因插入突变体编码蛋白表达可同时导致凋亡基因/抗凋亡基因表达上调或下调及致癌基因上调。半定量RTPCR对有趣的致癌基因FHL2、抗凋亡基因PRKCZ和凋亡基因LGALS1的鉴定结果表明,FHL2、PRKCZ和LGALS1基因的表达比空载体转染对照组相同基因明显上调。结论HCVC基因插入突变体编码蛋白在Huh7细胞表达对其基因表达有很大影响,其中对免疫反应基因的影响更明显,这一结果对理解HCVC基因插入突变体编码蛋白在HCV致病过程中的作用及其研制抗HCV药物均有重大的参考价值。

关键词：人肝癌细胞系基因插入编码蛋白突变体半定量RT-PCR 丙型肝炎病毒(HCV) Affymetrix Microarray 基因表达改变抗凋亡基因 PRKCZ 重组表达质粒 HCV-1b 免疫反应基因抗HCV药物表达上调致癌基因 FHL2 生物学功能蛋白酶活性

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人乳头状瘤病毒(HPV)16L1病毒样颗粒蛋白与HPV16L1基因联合免疫的体液免疫反应及其抗体的体外中和实验

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中华病理学杂志 2005年第7期34卷 421-424页

作者：宋建明孙向乐王一理郭建芬刘天菊司履生西安交通大学生命与科学技术学院肿瘤研究所

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方... 详细信息

目的用含有编码人乳头状瘤病毒(HPV)16L1和HPV16L1病毒样颗粒(VLP)蛋白联合免疫小鼠,与用HPV16L1重组表达质粒比较,观察VLP蛋白免疫对免疫小鼠产生抗体的增强作用,以及抗体的体外中和作用,寻找研制HPV16感染的预防性疫苗的有效途径。方法将C57BL/6小鼠,随机分为4组:Ⅰ组:pcDNA-L1(100μl/鼠),Ⅱ组:pcDNA-L1(70μl/鼠)+HPV16L1VLP,Ⅲ组:pcDNA3.1(100μl/鼠)空质粒,Ⅳ组:PBS缓冲液。质粒免疫3次,间隔3周。ELISA法检测其血清抗体,红细胞凝集实验和HPV16病毒样颗粒结合抑制实验体外检测抗体的中和活性。结果pcDNA-L1+HPV16L1VLP较pcDNA-L1免疫组,3次免疫后的抗体水平均增高,尤其以第2次和第3次免疫后的抗体水平增加更显著。pcDNA-L1+HPV16L1VLP联合免疫组血清的抑制活性高于pcDNA-L1免疫组,且HeLa细胞结合抑制实验染色呈阴性。结论HPV16L1VLP联合免疫可以增加目的抗原的中和抗体产生,可能是HPV16有效预防性疫苗研制的更有希望的策略。

关键词：人乳头状瘤病毒联合免疫体液免疫反应中和实验 L1基因颗粒蛋白 HPV16L1 c57BL/6小鼠 ELISA法检测 L1病毒样颗粒 HPV16感染重组表达质粒免疫小鼠抑制实验预防性疫苗红细胞凝集 VLP 免疫组增强作用中和作用血清抗体

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大鼠nelin基因干扰质粒的构建及其体外抑制效果研究

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中国分子心脏病学杂志 2010年第1期10卷 4-10页

作者：王慧王林宋莉叶珏孟宪敏北京协和医学院中国医学科学院阜外心血管病医院阜外心血管病研究所中心实验室北京100037

目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠c... 详细信息

目的构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具。方法提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证。以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒。以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,WesternBlot方法检测干扰效果。结果成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin。设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/siteⅠ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-siteI质粒的干扰效果最佳。结论本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制ne-lin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础。

关键词： nelin基因 RNA干扰 shRNA 载体构建重组表达质粒体外抑制大鼠设计合成酶切位点基因表达

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基因疫苗预防牙周炎的实验研究

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中华口腔医学杂志 2005年第4期40卷 310-313页

作者：张凤秋杨连甲吴织芬第四军医大学口腔医学院牙周科第四军医大学口腔医学院口腔病理学教研室西安710032

目的将已构建的***基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1+/kgpcd作为基因疫苗,免疫SD大鼠并观察其在预防牙周炎中的作用。方法pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,采用间接ELISA法检测唾液中特异性抗体的水平,并经组织化学染色观察... 详细信息

目的将已构建的***基因的真核重组表达质粒pcDNA3.1+/kgpcd作为基因疫苗,免疫SD大鼠并观察其在预防牙周炎中的作用。方法pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,采用间接ELISA法检测唾液中特异性抗体的水平,并经组织化学染色观察免疫对SD大鼠牙周炎的保护情况。结果重组质粒pcDNA3.1+/kgpcd经颌下腺靶向注射免疫SD大鼠,可诱导机体产生高水平的唾液中抗KGPcdsIgA抗体,显著高于对照组,并且实验组牙槽骨的破坏程度显著低于对照组。结论颌下腺靶向注射免疫可引起有效的黏膜免疫应答,KGPcd作为有效的免疫原产生的抗体对***引起的牙周炎可起到保护作用。

关键词：牙周炎实验研究疫苗预防 pcDNA3 ELISA法检测 SD大鼠重组表达质粒注射免疫 sIgA抗体黏膜免疫应答特异性抗体颌下腺基因疫苗 cd基因染色观察组织化学重组质粒保护作用对照组靶向高水平牙槽骨实验组免疫原

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人睫状神经营养因子基因的克隆、表达、纯化和生物活性鉴定

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复旦学报（医学版） 2005年第4期32卷 419-422,426页

作者：窦金民郭莉莉刘宏磊陈接根黄海燕宋后燕汤其群复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系-教育部分子医学重点实验室上海200032

目的表达和纯化人睫状神经营养因子(CNTF)并观察其生物学活性。方法用PCR方法构建人CNTF的结构基因,并克隆于pLy4原核表达载体中。将重组表达质粒pLy4-CNTF转化大肠埃希菌JF1125,30℃培养至A600(nm)达到0.6时,迅速升温至42℃诱导目的蛋... 详细信息

目的表达和纯化人睫状神经营养因子(CNTF)并观察其生物学活性。方法用PCR方法构建人CNTF的结构基因,并克隆于pLy4原核表达载体中。将重组表达质粒pLy4-CNTF转化大肠埃希菌JF1125,30℃培养至A600(nm)达到0.6时,迅速升温至42℃诱导目的蛋白的表达。细菌经超声破胞,包涵体经变性、复性、透析和阴离子交换层析,获得纯化的CNTF重组蛋白。然后,用鸡胚背根神经节神经元细胞存活实验观察其生物活性。结果42℃诱导后可以获得Mr≈22.9×103的目的蛋白,Western印迹结果进一步表明,其具有人CNTF的抗原性。表达蛋白主要以不溶形式存在,占菌体蛋白的35%以上,表达产物经变性、复性,纯化后可获得纯度90%以上的目的蛋白。该重组蛋白能够促进鸡胚背根神经节神经元细胞的存活。结论在大肠埃希菌JF1125中成功表达了人CNTF分子,经变性、复性,纯化后得到具有生物活性的蛋白。

关键词：人睫状神经营养因子生物活性鉴定纯化克隆 Western印迹背根神经节神经元大肠埃希菌 CNTF 原核表达载体重组表达质粒离子交换层析重组蛋白生物学活性 PCR方法神经元细胞结构基因实验观察细胞存活菌体蛋白

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