检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：高冬丽郑州大学

学位级别：硕士

目的：　　近年来新突发传染病疫情频发，尤其是2019年末暴发的新冠肺炎疫情引起全球大流行，严重危害人类健康及社会发展。新出现的呼吸道病毒可引起暴发,发病率和死亡率很高，快速识别病原体、流行病学追踪、症状描述以及制定预防和... 详细信息

目的：　　近年来新突发传染病疫情频发，尤其是2019年末暴发的新冠肺炎疫情引起全球大流行，严重危害人类健康及社会发展。新出现的呼吸道病毒可引起暴发,发病率和死亡率很高，快速识别病原体、流行病学追踪、症状描述以及制定预防和治疗措施对于限制这些病毒的传播至关重要。以新型冠状病毒、流感病毒为代表的呼吸道病毒感染起始症状多以非特异性流感样症候群为主，因此快速准确地甄别流感样症候群病原体是及时发现传染源、精准防控的关键。目前常用的病原体检测主要时聚合酶链式反应(PCR)，但该核酸检测方法扩增反应时间较长且依赖实验室及温控设备等，不适用于疫情现场传染病的快速检测。发展现场即时检测技术对于传染病的“三早”防控具有重大现实意义。重组酶介导链置换核酸扩增(Recombinase-Aid Amplification,RAA)具有反应条件温和、扩增速度快、灵敏度高等优点，适宜于偏远地区以及疫情现场快速检测。本研究对常见的6种呼吸道病毒，包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、新型冠状病毒、腺病毒等基于重组酶链置换核酸扩增设计扩增引物及探针并筛选优化，通过病毒核酸标准品检验引物探针的敏感性及特异性，最终选择灵敏高、特异好的引物探针。将优化后的引物及探针用于临床样本检验，评价引物探针对临床样本的筛检能力。借助小型便携式8通道或16通道等温检测仪器在医疗资源匮乏的偏远地区或疫情现场可以实现临床样本多通道同时快速检测，也可实现6种呼吸道病毒联合快速检测。为基层社区、农村等无中心检测实验室地区进行快速、准确地诊断流感样症候群病原体提供了极具应用前景的技术手段。　　方法：　　从 NCBI(National Center for Biotechnology Information)上分次选择 20 条各呼吸道病毒基因序列并下载，将下载的20条病毒序列通过DNAMAN软件进行序列比对，选出各个病原的保守序列，并在NCBI网站BLAST获得保守序列评分，根据评分结果选出最优保守序列。将保守序列放在NCBI的Primer BLAST或者primer premier 5软件上根据引物相关要求设定相关参数。每种呼吸道病毒设计数对扩增引物，根据引物扩增序列设计RAA荧光探针，前后引物及探针分别组合进行筛选，根据筛选结果选出引物探针的最优组合。将病毒核酸标准品按照10倍浓度梯度稀释用于引物探针的敏感性评价，通过对21种呼吸道症状病原体的特异性检测，评价引物探针的特异性。使用引物探针进行临床样本检测，比较荧光RAA与荧光PCR检测结果的一致性。6种呼吸道病毒引物探针预包在RAA反应管中可以同时实现病毒的多通道联合检测。　　结果：　　6种呼吸道病毒使用RT-RAA荧光法扩增，在39℃的反应温度下，20 min内完成快速检测，其中呼吸道合胞病毒A型检测限为102 copies/mL,呼吸道合胞病毒B型检测限为 101 copies/mL,副流感病毒检测限为102 copies/mL,甲型流感病毒检测限为102 copies/mL,乙型流感病毒检测限为103 copies/mL,新型冠状病毒检测限为102 copies/ mL,腺病毒检测限为102 copies/mL。利用以上病毒核酸标准品以及鼻病毒A型、鼻病毒B型、鼻病毒C型、甲型流感病毒H7N9型、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63、金黄色葡萄球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、人偏肺病毒、SARS-CoV、MERS-CoV、肺炎克雷伯菌等共21种模拟样本核酸作为模板对筛选出的7组引物和探针进行特异性评价，结果显示不同病原之间无交叉反应，即引物及探针的特异性较好。应用RT-RAA与RT-PCR荧光法对85份临床样本进行平行检测，包括11份呼吸道合胞病毒临床样本、5份副流感病毒临床样本，6份甲型流感病毒临床样本，30份乙型流感病毒临床样本，11份新型冠状病毒临床样本，8份腺病毒临床样本，14份阴性样本，结果表明除1份乙型流感病毒与PCR检测结果不一致外，其余临床样本检测的结果均一致。样本多通道联合检测结果显示具有可行性。建立的基于荧光RAA技术的呼吸道病毒检测方法具有恒温、快速、简便、高灵敏、高特异等优点，为呼吸道病毒的现场快速检测提供技术支撑。　　结论：　　通过对6种呼吸道病毒引物探针筛选评价后，最终获得灵敏性高、特异性强的引物探针。RT-RAA和RT-PCR荧光法对临床样本平行检测，结果具有一致性。在39℃条件下20 min可同时对6种呼吸道病毒进行多通道联检，提前制备检测试剂并冷藏保存，在疫情现场制备核酸加样后实现快速检测，其使用的恒温检测仪器具有便携性，可充电不依赖于电源等条件，在疫情现场即可完成病毒的早期检测，具有很大的应用前景。

关键词：呼吸道传染病病原体检测重组酶介导链置换核酸扩增聚合酶链式反应

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口蹄疫病毒通用型RT-RAA-LFD快速检测方法的建立

引用

中国动物检疫 2024年第6期41卷 97-102页

作者：寇美玲谢佳芮李占鸿张振兴苏晓航王轶男宋建领苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短... 详细信息

为建立一种操作简便、有效的口蹄疫病毒(FMDV)核酸通用型检测方法,以FMDV 3D基因为靶基因,设计标记引物及探针,建立了一种新的检测FMDV的反转录-重组酶介导链置换核酸扩增结合侧流层析试纸检测(RT-RAA-LFD)方法。该方法操作简便,耗时短,40℃35 min内即可完成检测,通过肉眼观察可判定结果;具有较好的覆盖面,能够检出我国O型、A型FMDV主要流行拓扑型病毒,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等其他猪病病原无交叉反应;对RNA标准品的最低检测限为10^(-7)拷贝/μL,敏感性较高。利用建立的FMDV RT-RAA-LFD方法对5份临床样品进行检测,其结果与RT-PCR结果一致。结果表明,本研究建立的FMDVRT-RAA-LFD方法具有快速、直观、特异强、重复性好等优点,适合在基层兽医防疫部门和养殖场推广应用。

关键词：口蹄疫病毒重组酶介导链置换核酸扩增侧流层析试纸恒温扩增快速检测

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