目的闭塞性血管病是一种常见的周围血管慢性闭塞性炎症病变,在器官移植性血管病、肺动脉高压、系统性硬化病的病理过程中均有表现。研究已经表明,血管紧张素II受体与内皮素-1受体在闭塞性血管病的病理进程中起到关键性作用。同时,同样作为G蛋白偶联受体,血管紧张素II受体与内皮素-1受体的胞外环结构在受体激活过程中扮演着重要角色。血管紧张素II1型(Angiotensin II type 1)和内皮素-1 A型(Endothelin-1 type A)受体的抗体被认为是免疫介导的闭塞性血管病,如移植排斥反应(graft rejection)和系统性硬化症(SSC)的自身抗体,这些抗体可诱发强效且长期的内源性配体激活过程。AT1R和ETAR两种受体有着高度相似的二级结构,这提示在免疫和内源性刺激作用于这两种受体时,很可能存在着不同的作用位点。为了进一步研究。AT1R和ETAR两种受体的单独和相互作用机制,我们将建立一种基于基因工程酵母菌的G蛋白偶联受体(GPCR)激活分析模型,在这一模型上,AT1R和ETAR两种受体可获得独立的表达。我们将以此为基础研究免疫刺激对其受体结构的影响。我们将利用基因定点突变技术对这两种受体胞外第二个环(second extracellular loop,ECL2)结构进行置换,并使用移植术后患者的血清IgG和内源性配体对突变型受体进行刺激,以研究免疫和内源性刺激对受体结构和功能的影响。方法以基因定点突变技术为基础,利用基因扩增技术来实现对于血管紧张素II受体与内皮素-1受体胞外第2个环的诱导突变,突变后将实现血管紧张素II受体与内皮素-1受体胞外第2个环结构的互换。将突变后的受体基因序列转化入细菌中进行选择性增殖,获得大量携带有突变型受体基因序列的线性质粒,以这些质粒为载体,转化基因工程酵母菌,建立针对突变型血管紧张素II受体与内皮素-1受体的真核细胞分析系模型。利用对应的血管活性肽以及心脏移植术后患者的血清IgG,对酵母菌模型施加刺激,检测酵母菌生长情况以得出突变型受体对于刺激的相应激活情况并分析。结果对于血管紧张素II和患者血清IgG的刺激,野生型血管紧张素II受体表现出明显的剂量依赖性,而经过胞外第2个环结构互换的突变型的血管紧张素II受体,在血管紧张素II和患者血清IgG的刺激下,并未表现出相应的剂量依赖性。对于内皮素-1和患者血清IgG的刺激,无论野生型内皮素-1受体还是突变型内皮素-1受体,均表现出了显著地剂量依赖性。结论在心脏移植术后患者免疫介导的移植物血管病(transplant vasculopathy)中,AT1R和ETAR确实可以作为内源性免疫物质IgG的作用位点。对于血管紧张素II A型受体(AT1R),该G蛋白偶联受体(GPCR)胞外第2环(ECL2)确实在其免疫激活过程中起到关键作用。对于内皮素-1 A型受体(ETAR),该G蛋白偶联受体(GPCR)胞外第2环(ECL2)在其免疫激活过程中并不起到关键作用。这一结果加深了对免疫介导的闭塞性血管病发病机制的认识,对新治疗方案的提出提供了帮助。
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