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骨质疏松发病过程中骨髓间充质干细胞差异性表达microRNA的筛选及其在干细胞多向分化中的功能

浙江大学学报（医学版） 2012年第1期41卷 75-80页

作者：廖立杨小红金岩第四军医大学口腔医院口腔组织病理学教研室组织工程研发中心陕西西安710032 遵义医学院附属口腔医院口腔修复科贵州遵义563003

目的:研究去势小鼠骨质疏松模型中骨髓间充质干细胞(BMMSC)microRNA表达谱的改变,确定特异性改变microRNA的功能,明确其在骨质疏松发病中的作用。方法:通过微阵列芯片筛查,寻找在骨质疏松模型骨髓间充质干细胞中差异性表达的microRNA,... 详细信息

目的:研究去势小鼠骨质疏松模型中骨髓间充质干细胞(BMMSC)microRNA表达谱的改变,确定特异性改变microRNA的功能,明确其在骨质疏松发病中的作用。方法:通过微阵列芯片筛查,寻找在骨质疏松模型骨髓间充质干细胞中差异性表达的microRNA,并在成骨成脂分化诱导后行RT-PCR检测其表达水平,研究其在BMMSC多向分化中的作用。结果:本研究发现了10个在骨质疏松发病过程中有差异性表达的microRNA,其中5个microRNA在BMMSC成骨分化过程中,3个microRNA在成脂分化过程中表达出现明显改变。结论:microRNA表达异常可能导致骨质疏松发病过程中BMMSC的功能缺陷。

关键词：微RNAs/药理学骨质疏松基因表达调控间质干细胞/药物作用细胞分化芯片分析技术

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土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用

土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的干预作用

引用

作者：李树强福建中医学院

学位级别：硕士

目的:激素性股骨头缺血性坏死可能与激素诱导下骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成脂分化有关,土鳖虫对该病早期的防治有明显疗效。本研究项目通过观察激素诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化以及土鳖虫含药血清对其干预作用,探讨土鳖虫对激... 详细信息

目的: 激素性股骨头缺血性坏死可能与激素诱导下骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成脂分化有关,土鳖虫对该病早期的防治有明显疗效。本研究项目通过观察激素诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化以及土鳖虫含药血清对其干预作用,探讨土鳖虫对激素诱导骨髓间充质干细胞成脂分化的影响,为临床防治激素性股骨头缺血性坏死奠定理论基础,并为中药土鳖虫对本病的治疗提供理论依据。方法: (1)选用优质中药土鳖虫,采用十天法制备土鳖虫含药血清。(2)取1月龄SD大鼠胫骨和股骨骨髓进行BMSCs贴壁培养和传代。检测传三代BMSCs表面抗原CD45、CD90的表达阳性率以鉴定。(3)传三代BMSCs随机分为空白组、对照组和中药低、中、高剂量组。对照组应用大剂量激素诱导使其向脂肪细胞分化,中药各组在激素诱导的同时给予土鳖虫含药血清干预。(4)各组干预6天后对成骨和成脂标志物进行检测,包括倒置显微镜观察、碱性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、骨钙素(BGP)的检测、RT-PCR对Ⅰ型胶原(ColⅠ)、脂肪细胞过氧化物酶增殖物激活受体(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白(aP2)mRNA表达的测定。结果: 1.根据BMSCs贴壁生长特性,可将BMSCs和骨髓内造血细胞分离开。通过此种方法分离和培养的BMSCs表面抗原CD45、CD90的表达阳性率分别为1.9%和99.1%。 2.细胞干预培养6天后,对照组细胞内甘油三酯含量较空白组显著升高,两组比较差异具有高度显著性(P＜0.01)。中药各组较对照组均有不同程度下降,和对照组比较差异均具有高度显著性(P＜0.01)。且随着中药浓度的增高细胞内甘油三酯含量呈递减趋势。 3.细胞干预培养6天后,对照组培养液中骨钙素含量低于空白组,差异具有高度显著性(P＜0.01)。中药各组较对照组均有不同程度的上升,且随着中药浓度的增高培养液中的骨钙素含量呈递增趋势。其中中药中、高剂量组与对照组比较差异具有高度显著性(P＜0.01)。 4.细胞干预培养6天后,对照组细胞内碱性磷酸酶(ALP)含量较空白组显著降低,且差异具有高度显著性(P＜0.01)。中药各组较对照组都有不同程度升高,和对照组比较差异均具有高度显著性(P＜0.01)。且随着中药浓度的增高细胞内ALP含量呈递增趋势。 5.基因表达:细胞干预培养6天后,通过凝胶成像扫描系统做PCR产物半定量分析,显示Ⅰ型胶原、脂肪细胞过氧化物酶增殖物激活受体(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白(aP2)mRNA表达,对照组,空白组和中药各组均有显著性差异。结论: 1.本实验体外分离培养的细胞经形态学、流式细胞仪检测表面标志物等技术鉴定其属于BMSCs,且具有较高的纯度。 2.大剂量激素诱导可促使BMSCs向成脂分化,且使成骨分化减少。 3.土鳖虫含药血清干预后,细胞内甘油三酯含量、PPARγmRNA和aP2 mRNA的表达较对照组都明显降低,提示土鳖虫可逆转激素诱导下的BMSCs成脂分化。 4.土鳖虫含药血清干预BMSCs后,细胞ALP、BGP的含量及Col ImRNA的表达较对照组均有增加,提示土鳖虫可促使BMSCs成骨分化。 5.土鳖虫防治激素性股骨头缺血坏死的机理不仅是改善股骨头的微循环,同时也可抑制BMSCs成脂分化,促进其成骨分化。

关键词：间质干细胞/药物作用脊髓股骨头坏死/中药疗法土鳖虫细胞分化/药物作用细胞培养技术

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透骨消痛颗粒含药血清诱导BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

透骨消痛颗粒含药血清诱导BMSCs向软骨细胞分化的实验研究

引用

作者：吴追乐福建中医学院

学位级别：硕士

目的通过透骨消痛颗粒对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外抽取、分离、纯化、培养、增殖、软骨分化等基础实验,以优化软骨组织工程的种子细胞,增强软骨的自我修复功能,延缓软骨的退行性改变,达到预防与治疗骨性关节炎（OA）的目的,为中医... 详细信息

目的通过透骨消痛颗粒对骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外抽取、分离、纯化、培养、增殖、软骨分化等基础实验,以优化软骨组织工程的种子细胞,增强软骨的自我修复功能,延缓软骨的退行性改变,达到预防与治疗骨性关节炎（OA）的目的,为中医药治疗OA提供坚实的临床基础。方法（1）抽取SD大鼠骨髓液,采用全骨髓贴壁培养法经体外分离、纯化、培养获得SD大鼠BMSCs,通过倒置相差显微镜观察其生长情况,研究BMSCs的体外生长状况。（2）取4周龄SD大鼠72只,随机分为3组,即:水提物组（48只）、醇提物组（16只）和空白对照组（8只）,再将水提物组随机分为3个亚组,即:高剂量组、中剂量（等效量）组、低剂量组,每个亚组16只。给予相对应的给药量灌胃3d,末次给药分别在1小时、2小时后进行采血,制备透骨消痛颗粒含药血清,运用透骨消痛颗粒不同含药血清浓度对获得的BMSCs进行药物干预72h,通过MTT法研究透骨消痛颗粒对BMSCs增殖的影响。（3）将第2代SD大鼠BMSCs分为空白对照组、单纯软骨诱导剂组及透骨消痛颗粒含药血清加软骨诱导剂组,采用原培养液、软骨诱导培养液(TGF-β310ug/L,Dex10-7mol/L,VitC50mg/L)及透骨消痛颗粒含药血清的软骨诱导培养液,50ml细胞培养瓶内进行培养,1、2、3周后通过倒置相差显微镜及免疫细胞化学染色等实验技术,研究透骨消痛颗粒对BMSCs诱导成软骨细胞的影响。（4）数据统计与分析:数据以均数±标准差表示,用统计软件SPSS14.0进行统计分析。结果（1）体外培养的BMSCs生长状况良好,12d可获得均质性较好的BMSCs,实验证明全骨髓贴壁培养法是分离BMSCs的一种比较理想的方法,BMSCs体外分离培养成功。（2）透骨消痛颗粒含药血清各实验组均可以促进BMSCs增殖,且各组与空白对照组相比均有非常显著性差异（P＜0.01）;在中剂量药物浓度时达到最大效应（P＜0.01）,继续增加浓度则使OD值呈现下降趋势;中剂量1小时组与2小时组相比无显著性差异（P＞0.05）。实验说明:透骨消痛颗粒刺激BMSCs增殖与药物浓度有关,水提物中剂量组的促增殖作用效应最大。（3）在TGF-β3等诱导下,软骨表型化BMSCs彼此融合,聚集生长,向三角形、多边形转变。透骨消痛颗粒组、软骨诱导剂组均有Ⅱ型胶原表达,而且透骨消痛颗粒组比软骨诱导剂组表达强,空白对照组没有Ⅱ型胶原表达。实验结果证明:透骨消痛颗粒可以有效的促进Ⅱ型胶原表达。结论（1）通过体外对SD大鼠BMSCs的抽取、分离、纯化、培养与增殖,已经建立起比较完整的BMSCs体外培养体系。（2）透骨消痛颗粒促进BMSCs增殖的同时,在诱导BMSCs向软骨细胞分化有显著的促进作用,从而增加软骨细胞的数量。（3）透骨消痛颗粒可以促进BMSCs向软骨细胞转化,优化骨组织工程的种子细胞体系,改善软骨组织的质量,延缓软骨的退变过程。

关键词：骨关节炎,膝/中药疗法间质干细胞/药物作用软骨细胞/药物作用细胞培养技术/方法细胞分化/药物作用比色法转化生长因子β 胶原Ⅱ型 @透骨消痛颗粒

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蛋白酶体抑制剂PS-341靶向干预多发性骨髓瘤骨髓间充质干细胞的实验研究

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中国误诊学杂志 2007年第24期7卷 5708-5711页

作者：陆化林如峰沈文怡葛峥刘澎张建富吴雨洁费小明李建勇南京医科大学第一附属医院血液科江苏南京210029

目的:分析蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤(MM)骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡及其对IL-6、IL-1β、SCF细胞因子表达的影响。方法:含10%FBS的1640培养液培养得到MSCs,流式细胞术(FCM)鉴定所培养细胞的表型,以终浓度分别为0 nmol/L、50 ... 详细信息

目的:分析蛋白酶体抑制剂PS-341对多发性骨髓瘤(MM)骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡及其对IL-6、IL-1β、SCF细胞因子表达的影响。方法:含10%FBS的1640培养液培养得到MSCs,流式细胞术(FCM)鉴定所培养细胞的表型,以终浓度分别为0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L的PS-341作用MSCs 4 h,光学显微镜观察细胞形态改变,荧光显微镜下Annexin V-FITC/PI双染法观察细胞凋亡,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测IL-6、IL-1β、SCF细胞因子表达的变化。结果:PS-341可诱导MSCs凋亡,与其浓度成正比;与对照组(0 nmol/L PS-341)比较,浓度分别为50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L、200 nmol/L的PS-341作用MSCs 4 h后明显抑制IL-6、IL-1β、SCF的表达(P<0.05);PS-341对IL-6和SCF的抑制与PS-341浓度成正相关(P<0.05),在初发/难治复发和完全缓解(CR)两组患者间均无显著差异;对IL-1β的抑制在CR组较初发/难治复发组更明显(P<0.05);PS-341作用后IL-1β表达的强弱对IL-6及SCF的表达无影响。结论:PS-341诱导MM患者MSCs凋亡和抑制其IL-6、IL-1β、SCF的表达,是PS-341有效治疗MM的靶点之一。

关键词：硼酸化物/治疗应用吡嗪类/治疗应用蛋白酶抑制药/治疗应用多发性骨髓瘤/药物疗法骨髓细胞/药物作用间质干细胞/药物作用人类

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