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医学研究生学报 2015年第8期28卷 840-842页

作者：王倩顾页林洁南方医科大学基础医学院病理学系广州医学硕士研究生510515

目的 K-ras基因在结直肠癌的发生、发展以及需要靶向药物治疗的药物选择方面具有重大临床意义。文中旨在探讨高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌组织K-ras基因突变情况,并分析K-ras基因突变与临床病理参数的关系。方法收集179例结直肠... 详细信息

目的 K-ras基因在结直肠癌的发生、发展以及需要靶向药物治疗的药物选择方面具有重大临床意义。文中旨在探讨高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌组织K-ras基因突变情况,并分析K-ras基因突变与临床病理参数的关系。方法收集179例结直肠癌患者的手术标本,检测结直肠癌组织中K-ras基因第12、13位密码子的突变情况,并分析K-ras基因突变与临床病理参数的关系。结果 179例结直肠癌组织标本中,K-ras基因突变率为43.02%（77/179）;在≥60岁组结直肠癌患者中K-ras基因突变率明显高于〈60岁组（55.17%vs 33.70%,P〈0.05）。多因素Logistic回归分析结果显示,年龄对K-ras基因突变有显著影响（OR=1.506,95%CI：1.028~2.011）。结论结直肠癌患者K-ras基因的突变与年龄相关,与性别、分化程度、病变部位及Dukes分期无关。

关键词：高分辨率熔解曲线分析法结直肠癌 K-ras基因突变

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高分辨率熔解曲线分析法检测毛细胞白血病BRAF基因突变

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中华血液学杂志 2014年第3期35卷 207-209页

作者：章艳茹刘慧敏齐军元刘薇邱录贵中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所、血液病医院淋巴瘤诊疗中心天津300020

目的探讨高分辨率熔解曲线分析（HRM）法检测毛细胞白血病（HCL）患者BRAFV600E基因突变的可行性及其意义。方法用HRM法检测4例初治确诊HCL患者BRAFV600E基因突变情况，并回顾性分析患者临床资料。结果HRM法分析4例HCL患者均发生BRAFV6... 详细信息

目的探讨高分辨率熔解曲线分析（HRM）法检测毛细胞白血病（HCL）患者BRAFV600E基因突变的可行性及其意义。方法用HRM法检测4例初治确诊HCL患者BRAFV600E基因突变情况，并回顾性分析患者临床资料。结果HRM法分析4例HCL患者均发生BRAFV600E突变。测序结果与HRM分析结果一致。结论用HRM法检测临床样本BRAFV600E基因突变，具有操作简便、结果准确、成本低的优点，可用于临床辅助诊断。

关键词：白血病多毛细胞基因 BRAF DNA突变分析高分辨率熔解曲线分析法

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一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法-高分辨率熔解曲线分析法

一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法-高分辨率熔解曲线分析法

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第八届全国遗传病诊断与产前诊断学术交流会

作者：许淼王娟龚秀丽蔡勤颜景斌 Nanbert Zhong 曾凡一黄淑帧上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海交通大学医学遗传研究所上海，200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海交通大学医学遗传研究所上海，200040 上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海交通大学医学遗传研究所上海，200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海交通大学医学院医学科研研究院发育生物学研究室上

本文利用高分辨率熔解曲线分析法(HRM)对CLN6模型小鼠不同基因型进行检测。结果显示，通过比较HRM结果和直接测序结果完全一致，准确性和灵敏性均达到100%，且相比其他方法大大节省了时间和成本。

关键词：基因诊断高分辨率熔解曲线分析法动物模型

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胶质瘤IDH1基因突变检测及其临床应用策略

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临床与实验病理学杂志 2016年第7期32卷 778-781页

作者：黎相照薛小磊张中满张颖芬丁彦青韩慧霞南方医科大学南方医院病理科广州510515 南方医科大学基础医学院病理学系广州510515 广州好芝生物科技有限公司广州510515

目的比较免疫组化EnVision法与高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting curve analysis,HRM）法在测定异柠檬酸脱氢酶-1（IDH1）基因突变中的优缺点,为临床IDH1基因突变的检测提供策略。方法运用免疫组化EnVision法和HRM法检... 详细信息

目的比较免疫组化EnVision法与高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting curve analysis,HRM）法在测定异柠檬酸脱氢酶-1（IDH1）基因突变中的优缺点,为临床IDH1基因突变的检测提供策略。方法运用免疫组化EnVision法和HRM法检测279例人胶质瘤及胶质神经元混合性肿瘤中IDH1基因突变。结果免疫组化检测结果：279例中有81例发生IDH1基因突变;HRM检测结果：275例中77例存在IDH1基因突变,4例因为DNA质量不佳导致检测无结果。免疫组化EnVision法和HRM法检测IDH1基因突变具有较好的一致性,差异无显著性（P=0.375）。结论 IDH1基因突变主要发生在WHOⅡ~Ⅳ级的星形细胞、少突胶质细胞以及星形-少突胶质细胞瘤中;中国人IDH1基因突变率较国外低,原因有待进一步分析。IDH1-R132H抗体免疫组化检测IDH1基因突变的结果与HRM法检测结果具有高度的一致性,临床IDH1-R132检测首推免疫组化法,IDH1突变分子检测适用于免疫组化检测突变阴性的病例。

关键词：脑肿瘤胶质瘤 IDH1 免疫组织化学高分辨率熔解曲线分析法

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高分辨率熔解曲线分析检测常见β-地中海贫血突变的方法学建立及其在产前诊断中的应用

高分辨率熔解曲线分析检测常见β-地中海贫血突变的方法学建立及...

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作者：陈汉彪广州医科大学

学位级别：硕士

目的：　　β-地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一,重型β-地中海贫血死亡率极高,预防该病主要依赖于基因诊断,但常用的反向斑点杂交法耗时长、结果不稳定,有时出现假阳性与假阴性,而高分辨率熔解曲线分析(HRM)具有快速、灵敏度高、... 详细信息

目的：　　β-地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一,重型β-地中海贫血死亡率极高,预防该病主要依赖于基因诊断,但常用的反向斑点杂交法耗时长、结果不稳定,有时出现假阳性与假阴性,而高分辨率熔解曲线分析(HRM)具有快速、灵敏度高、价格低廉等优点。本研究旨在建立检测常见β-地中海贫血突变的HRM方法,并进一步探讨该方法在产前诊断应用的可行性,以期建立β-地中海贫血产前基因诊断的第二技术验证平台。　　方法：　　1.选取1例经测序证实的无β-珠蛋白基因突变的健康对照者、21例经测序证实基因型为-28、CD17、CDs41-42、CDs71-72、IVS-Ⅱ-654、CDs41-42/71-72,-28/CDs41-42,-28/CD17、-28/IVS-Ⅱ-654、-28/CDs71-72的基因组DNA,建立应用HRM检测常见β-地中海贫血基因突变的方法。　　2.应用建立的HRM方法随机检测78例父母双方均为β-地中海贫血突变携带者的产前诊断标本(羊水、脐血、绒毛),同时行反向斑点杂交法(RDB)及DNA测序对比实验。　　结果：　　1.所建立的HRM法能准确检测出21例β-地中海贫血突变,包括-28、CD17、CDs41-42、CDs71-72、IVS-Ⅱ-654、CDs41-42/71-72,-28/CDs41-42等　　***法对78例父母双方均为β-地中海贫血基因携带者的产前诊断标本进行检测,结果显示:与RDB法及DNA测序结果一致,且通过测序发现了一个SNP位点:c.316_185C>T。　　结论：　　所建立的HRM方法具有简便、准确、灵敏度高等优点,有望在产前诊断领域检测β-地中海贫血基因突变方面有很好的应用前景。

关键词： β-地中海贫血产前诊断基因突变高分辨率熔解曲线分析法反向斑点杂交法 DNA测序

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HRM法在粪便DNA筛查大肠癌中的应用

HRM法在粪便DNA筛查大肠癌中的应用

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作者：李琛广东医学院

学位级别：硕士

目的：　　 1.探讨粪便APC、K-ras和P53基因突变检测对大肠癌分期及预后的判断价值。　　 2.探讨粪便APC、K-ras和P53基因突变检测在大肠癌筛查中的价值。　　 3.初步评价HRM法在粪便DNA筛查大肠癌中的应用价值。　　方法：　　选取20... 详细信息

目的：　　 1.探讨粪便APC、K-ras和P53基因突变检测对大肠癌分期及预后的判断价值。　　 2.探讨粪便APC、K-ras和P53基因突变检测在大肠癌筛查中的价值。　　 3.初步评价HRM法在粪便DNA筛查大肠癌中的应用价值。　　方法：　　选取2009.3～2009.9在惠州市中心人民医院胃肠外科及消化内科住院的大肠癌患者39例，大肠腺瘤患者28例，选取同期正常对照26例。研究组纳入标准：(1)经肠镜或外科手术获取标本，并经病理组织学检查确诊为大肠腺瘤或大肠癌患者;(2)如大肠癌和大肠腺瘤共存，纳入大肠癌组。研究组排除标准：(1)家族性腺瘤性息肉病或遗传性非息肉性大肠癌;(2)合并其他系统或器官恶性肿瘤;(3)大肠癌或大肠腺瘤患者同时患有炎症性肠病;(4)大肠癌手术切除前有放疗或化疗史;(5)非原发癌灶者及不能确诊的患者。对照组纳入标准：(1)年龄、性别匹配;(2)行全结肠镜检查阴性;(3)无其他系统或器官恶性肿瘤。收集研究对象肠镜检查前或手术前的新鲜粪便标本约1g，所有粪便标本收集后立即保存于-80℃冰箱。本研究经惠州市中心人民医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。粪便DNA的提取按QIAamp DNA stool mini kit(Qiagen)说明书操作，提取的DNA保存在-20℃冰箱。使用HRM法检测粪便中APC、K-ras和P53基因突变的情况。然后对HRM检测阳性的标本进行直接测序证实粪便DNA中APC、K-ras和P53基因碱基突变的具体情况。实验结果采用SPSS13.0统计软件处理。基因频率采用直接计数法，各组间率的比较采用x2检验和Fisher'S精确概率法。检验水准取α=0.05，P<0.05差别有统计学意义　　结果：　　 1.大肠癌患者粪便中APC、K-ras和P53基因突变与临床病理参数的关系　　 1.1粪便中APC、K-ras和P53基因突变率与大肠癌患者性别无关：粪便APC基因在男性和女性中的突变率分别为52.38％(11/21)和61.11％(11/18)(x2=0.30P>0.05);粪便K-ras基因在男性和女性中的突变率分别为42.86％(9/21)和27.78％(5/18)(x2=0.96 P>0.05);粪便P53基因在男性和女性中的突变率分别为66.67％(14/21)和55.56％(10/18)(x2=0.5119>0.05)。　　 1.2粪便中APC、K-ras和P53基因突变率与大肠癌患者年龄无关：粪便APC基因在≥50岁和<50岁患者中的突变率分别为51.61％(16/31)和75.00％(6/8)(x2=0.62P>0.05);粪便K-ras基因在≥50岁和<50岁患者中的突变率分别为32.26％(10/31)和50.00％(4/8)(x2=0.27 P>0.05);粪便P53基因在≥50岁和<50岁患者中的突变率分别为58.06％(18/31)和75.00％(6/8)(x2=0.02 P>0.05)。　　 1.3粪便中APC、K-ras和P53基因突变率与大肠癌分化状态无关：粪便APC基因在高中分化腺癌和低分化腺癌患者中的突变率分别为56.76％(21/37)和50.00％(1/2)(P=-0.50);粪便K-ras基因在高中分化腺癌和低分化腺癌患者中的突变率分别为35.14％(13/37)和50.00％(1/2)(P=0.47);粪便P53基因在高中分化腺癌和低分化腺癌患者中的突变率分别为62.16％(23/37)和50.00％(1/2)(P=-0.49)。　　 1.4粪便中APC、K-ras和P53基因突变率与大肠癌病变部位无关：粪便APC基因在左半结肠癌和右半结肠癌患者中的突变率分别为56.76％(21/37)和50.00％(1/2)(P=0.50);粪便K-ras基因在左半结肠痛和右半结肠癌患者中的突变率分别为35.14％(13/37)和50.00％(1/2)(P=-0.47);粪便P53基因在左半结肠癌和右半结肠癌患者中的突变率分别64.86％(24/37)和0.00％(0/2)(P=-0.14);粪便APC基因在直肠癌和结肠癌患者中的突变率分别为53.85％(14/26)和61.54％(8/13)(x2=0.21P>0.05);粪便K-ras基因在直肠癌和结肠癌患者中的突变率分别为34.62％(9/26)和38.46％(5/13)(x2=0.06 P>0.05);粪便P53基因在直肠癌和结肠癌患者中的突变率分别为53.85％(14/26)和76.92％(10/13)(x2=1.10 P>0.05)。　　 1.5粪便中APC、K-ras和P53基因突变率与大肠癌Dukes分期无关：粪便APC基因在Dukes A、B期和Duk

关键词：高分辨率熔解曲线分析法大肠癌粪便检测预后判断基因突变

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GJB2与mtDNA A1555G基因检测及其与临床表型相关性研究

GJB2与mtDNA A1555G基因检测及其与临床表型相关性研究

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作者：杨晓林复旦大学

学位级别：硕士

第一部分：无创性GJB2基因与mtDNA A1555G突变检测体系的建立第—章：口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞用于聋病基因检测可行性研究目的：探讨口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞无创、便捷DNA采样方式用于聋病基因检测的可行性。方法：随机收... 详细信息

第一部分：无创性GJB2基因与mtDNA A1555G突变检测体系的建立第—章：口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞用于聋病基因检测可行性研究目的：探讨口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞无创、便捷DNA采样方式用于聋病基因检测的可行性。方法：随机收集门诊聋儿98例,分别采用无创的口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞和抽取2ml静脉血两种方式采集标本,提取基因组DNA后遵循盲法原则,分别对常见聋病基因GJB2,线粒体基因1555A>G(mtDNA A1555G)进行检测,对检测结果通过Kappa检测进行一致性分析。结果：无创的口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞和有创的抽取静脉血两种方式采样后24h内提取基因组DNA一次成功率分别为98.98%和100%,DNA获得量分别为2.16±0.44μg和21.47±4.59μ(500μl血),OD值260/280分别为1.82±0.13和1.79±0.11.口拭子采样24h后和1周后提取得率有明显差异,t=2.52,p=0.01,血样则无统计学差异,而血样在提取1周和1月后得率差异有统计学意义,t=2.87, p=0.01;GJB2及mtDNA A1555G基因检测结果一致(kappa=1.00,P=0.00),共发现GJB2突变的占27.56%(27/98),mtDNA A1555G占4.08%(4/98)。结论：口拭子刮取口腔颊粘膜脱落细胞可以用于聋病基因GJB2及mtDNA A1555G检测,以该方法可靠、无创、便捷,可以在大规模聋病基因检测特别是小年龄检测对象中推广应用,特别是适用于新生儿早期聋病基因筛查。第二章：建立高分辨率熔解曲线分析结合基因测序二步法GJB2基因检测体系目的：建立以高分辨率熔解曲线分析法(High Resolution Melt,HRM)结合基因测序法为基础的GJB2基因检测体系,实现廉价、快速、结果可靠的检测目标。方法：从复旦大学附属儿科医院耳鼻喉科门诊患儿中随机选择感音神经性聋儿121例和听力正常新生儿72名,平均年龄分别为2岁4月和1.1月,遵循盲法原则分别以HRM结合基因测序二步法与直接测序法进行检测,并采用Kappar分析比较两种方法检测结果的一致性。结果：HRM结合基因测序二步法检测结果为：聋儿组和听力正常组阴性样品分别有24例和58例,可疑突变样品分别有97例和14例,对可疑突变样品进行基因测序,最终确定各样品基因型共发现聋儿组中GJB2双链突变的占46.28%(56/121),单链突变占37.19%(45/121)野生型占22.31%(27/121),听力正常组中单链突变占9.72%(7/72),野生型占90.28%(65/72),未见双链突变者;直接测序法检测结果：对两组样品盲法编号后,直接测序法进行检测,结果与前者一致,Kappa值为1,p=0.00。HRM成本约为PCR基础上增加不足0.5元,而基因测序费用为增加20-25元,检测耗时分别为15分钟和10h左右,HRM结合基因测序二步法使病例组19.83%(24/121)和对照组80.56%(58/72)仅通过HRM检测而无需进行基因测序即可完成检测。结论：HRM法结合基因测序法检测GJB2基因具有廉价、快速、结果准确可靠的特点,可应用于GJB2基因大规模临床检测,为明确耳聋病因、降低聋儿出生率提供一种技术支持。第三章：定量连接酶连反应在mtDNA A1555G点突变检测中的应用目的：建立以定量连接酶连反应(quantitative ligase chain reaction, Q-LCR)为基础的mtDNA A1555G点突变诊断技术,实现廉价、快捷、准确的检测目标。方法：从复旦大学儿科医院耳鼻喉科门诊中随机选择感音神经性聋儿121例及听力正常患儿30例,针对mtDNA A1555G点突变设计相应的探针和引物,建立稳写的检测体系,遵循双盲法原则分别以Q-LCR法和酶切法进行检测,用Kappa分析比较两种方法的检测结果。结果：Q-LCR法检测结果为：聋儿组中携带mtDNA A1555G点突变的占4.01%(5/121),听力正常组中未见携带mtDNA A1555G点突变者;酶切法检测后结果与Q-LCR法一致：经Kappa分析两种检测方法结果完全一致,未发现假阳性和假阴性。结论：所建立的Q-LCR法检测mtDNA A1555G点突变具有价格便宜,操作快捷,结果准确可靠的特点,可应用于我国mtDNA A1555G突变的大规模筛查,为明确聋儿病因,降低聋生出生率,预防药物性耳聋的发生提供一种很好的方法。第二部分：先天性聋儿GJB2及

关键词：口腔颊粘膜脱落细胞聋病基因 GJB2 mtDNA A1555G DNA抽提听力障碍 GJB2 高分辨率熔解曲线分析法 HRM 听力障碍 mtDNA A1555G 定量连接酶连反应 GJB2 mtDNA A1555G 听力障碍新生儿 NICU GJB2 mtDNA A1555G 听力损伤 ABR ASSR

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