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鸡传染性支气管炎病毒东北(DB)流行株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆鉴定与HaeⅢ RFLP分析

鸡传染性支气管炎病毒东北(DB)流行株生物学特性及其免疫原S1基因...

引用

作者：祁贤东北农业大学

学位级别：硕士

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)国外标准株M<,41>、H<,52>和澳大利亚T等为参考,对东北分离株(DB)的生物学特性进行了比较研究.结果表明DB株在抗原性、血凝特性、细胞培养特性和血清型等方面均与IBV标准株有... 详细信息

以鸡传染性支气管炎病毒(IBV)国外标准株M<,41>、H<,52>和澳大利亚T等为参考,对东北分离株(DB)的生物学特性进行了比较研究.结果表明DB株在抗原性、血凝特性、细胞培养特性和血清型等方面均与IBV标准株有所差异.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western blotting)实验表明病毒主要由3条结构蛋白(S、M和N)组成,且DB株S蛋白与鼠抗T株高免血清交叉反应很弱.间接Dot-ELISA表明病毒抗原与美国IBV特异性诊断血清呈阳性反应.IBV无直接血凝活性,但经1%胰蛋白白酶、1%卵磷脂酶C和10%乙醚处理,可不同程度地凝集多种动物和人"O"型红细胞.病毒在单层鸡胚肾细胞上盲传数代后,可引起细胞病变(CPE).气管环组织培养交叉中和试验表明DB株与M<,41>、H<,52>的血清型相差较远,而与T株有一定程度的抗原交叉反应.

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S1基因遗传变异生物学特性支气管炎病毒鸡基因逆转录-聚合酶链反应

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鸡传染性支气管炎病毒核衣壳（N）蛋白的原核表达及其抗原性分析

鸡传染性支气管炎病毒核衣壳（N）蛋白的原核表达及其抗原性分析

引用

作者：齐晓亮新疆农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV核衣壳(N)蛋白是其主要的结构蛋白,具有很强的免疫原性,是IBV诱导体... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。由于IBV核衣壳(N)蛋白是其主要的结构蛋白,具有很强的免疫原性,是IBV诱导体液免疫、细胞免疫应答的重要免疫原,而且比较保守,因此适宜用作检测IBV特异性抗体的抗原。本研究参照GenBank中IBV N基因序列设计一对特异性引物,提取IBV的RNA进行RT-PCR扩增,并克隆至pGEM-T Easy载体中,转化*** DH5α感受态细胞,获得重组质粒pGEM-T-N,进行序列测定。将目的片段经EcoR I和Xho I双酶切,克隆入经同样处理的大肠杆菌原核表达质粒pET-28a(+),转化BL21(DE3)感受态细胞并用IPTG进行诱导表达,通过镍离子亲和树脂对其进行纯化。SDS-PAGE结果表明,IBV N基因在BL21(DE3)成功表达,相对分子质量约为50 kDa,表达的目的蛋白主要以可溶形式表达。经Western blotting分析,表明IBV N蛋白能被IBV阳性血清特异识别,具有良好的反应原性。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白原核表达反应原性

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鸡传染性支气管炎病毒分离株I0317/22的分离鉴定及致病特点研究

鸡传染性支气管炎病毒分离株I0317/22的分离鉴定及致病特点研究

引用

作者：韩佳贝中国农业科学院

学位级别：硕士

2022年内蒙古某鸡场的鸡群发生呼吸道病,表现为咳嗽、喷嚏、脓性鼻涕和气管啰音,该鸡群有同时接种鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)疫苗和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)疫苗的免疫史。为了解MG... 详细信息

2022年内蒙古某鸡场的鸡群发生呼吸道病,表现为咳嗽、喷嚏、脓性鼻涕和气管啰音,该鸡群有同时接种鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)疫苗和鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)疫苗的免疫史。为了解MG疫苗对IBV毒株致病性的影响,本研究对从上述发病鸡群中分离到的IBV I0317/22株的致病特点进行研究,探讨MG疫苗对IBV的致病性是否有协同作用。本研究首先基于S1基因序列对I0317/22株进行遗传演化分析,结果表明,I0317/22株属于欧洲早期GI-19谱系IBV。对其全基因组序列进行遗传演化分析,发现分离株I0317/22与荷兰QX型疫苗株L1148之间亲缘关系较近,而与我国其它GI-19谱系IBV的亲缘关系较远。将分离株I0317/22人工感染1日龄SPF鸡,同时设I0317/22株+MG疫苗共同接种组、MG疫苗单独接种组以及SPF空白对照组。结果显示,I0317/22株人工感染1日龄SPF雏鸡后,可引起鸡出现轻微发病,发病率为100%(10/10),但不引起死亡。I0317/22株具有多组织嗜性,其中对气管和腺胃组织嗜性最强(气管中病毒滴度为10 EID/m L,腺胃中病毒滴度为10EID/m L)。I0317/22株经呼吸道排毒可持续至感染后第20天,经消化道排毒可持续至第24天。在人工感染后12天,感染鸡开始出现抗体,第24天时,中和抗体效价(LogPD)高于6.0。上述结果表明I0317/22株对1日龄雏鸡的致病力较弱,在鸡体内有一定的复制能力。在I0317/22株+MG疫苗同时接种组中,1日龄SPF鸡症状较重,发病率为100%(10/10),死亡率为0。I0317/22株具有广泛的组织嗜性,其中对气管和腺胃组织的嗜性最强(气管中病毒滴度为10 EID/m L,腺胃中病毒滴度为10 EID/m L)。I0317/22株经呼吸道排毒可持续至接种后第20天,经消化道排毒可持续至第12天。在接种后第20天,感染鸡开始出现抗体,第24天时,中和抗体效价(LogPD)高于5.0。与单独接种I0317/22株的结果比较后可知,MG疫苗增加了I0317/22株在鸡体内的病毒滴度,并降低了I0317/22株诱导的体液免疫水平。最后,本研究选择了一株分离自我国的高致病GI-19谱系IBV强毒I0305/19株作为攻毒毒株,对所有组进行攻毒。结果表明,MG疫苗减弱了I0317/22株对I0305/19株的保护作用。具体表现为,在攻毒后,I0317/22株单独接种组和I0317/22株+MG疫苗共同接种组均未有明显的临床症状。单独接种组中IBV经消化道排毒可持续至攻毒后第16天,而共同接种组中IBV经消化道排毒可持续至攻毒后第20天。两组中IBV在多个组织中具有不同的嗜性,其中单独接种组的气管、肺脏和腺胃组织中病毒滴度为0,而肾脏组织中病毒滴度最高,大于10 EID/m L,共同接种组的所有组织均具有嗜性,其中肾脏和盲肠扁桃体组织中的病毒滴度最高,接近10EID/m L。在攻毒后第4天,单独接种组和共同接种组的ELISA抗体阳性率分别为100%(10/10)和80%(8/10)。在攻毒后第24天,单独接种组和共同接种组的中和抗体效价(LogPD)分别接近13.0和12.0。综上所述,IBV分离株I0317/22属于欧洲早期GI-19谱系IBV,对1日龄SPF鸡有轻微的致病力。MG疫苗增加了该分离株在鸡体内的病毒滴度,并减弱了其对I0305/19株的保护作用。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒鸡毒支原体弱毒活疫苗协同致病

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鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及S1蛋白T细胞表位的筛选

鸡传染性支气管炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及S1蛋白T细胞表位的...

引用

作者：范瑾山西农业大学

学位级别：硕士

由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡传染性支气管炎(IB)是一种急性、高度接触性传染病,可引起各日龄鸡感染,是影响养禽业发展的主要疫病之一。IBV属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属,该病毒血清型众多,其基因组RNA特有的先导引物转... 详细信息

由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡传染性支气管炎(IB)是一种急性、高度接触性传染病,可引起各日龄鸡感染,是影响养禽业发展的主要疫病之一。IBV属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属,该病毒血清型众多,其基因组RNA特有的先导引物转录机制使病毒呈高度变异性,给病毒的检测及疫病的防控带来极大的困难。为了探索IBV多表型通用检测方法和表位疫苗的研制,我们开展了如下研究：一、建立一种快速、灵敏、特异的检测鸡传染性支气管炎病毒的逆转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP).针对IBV毒株保守性N蛋白在线设计4对LAMP特异性引物,提取IBV RNA作为模板,在Bst DNA聚合酶作用下恒温反应,对IBV、新城疫病毒、禽流感病毒和鸡毒支原体进行特异性分析,并与普通RT-PCR进行灵敏度比较。结果表明RT-LAMP法在30min就能够检测出IBV毒株(M41株、H52株、H120株、AustraliaT株、4/91株、QX株),特异性良好且灵敏度是普通RT-PCR的107倍,阳性反应结果呈绿色,可眼观判断。是一种快速、灵敏、特异的检测IBV的方法。二、构建IBV M、S1核酸疫苗以及原核表达M、Sl蛋白并评价其免疫效果。真核表达质粒pVAX-M和pVAX-S1转染Hela细胞,Western-bolt和IFA检测结果表明,pVAX-M和pVAX-S1都可以在体外正常表达。分别使用pVAX-M、pVAX-S1以及pET-28a-M、pET-28a-S1免疫2周龄SPF鸡。利用ELISA方法检测体液免疫应答水平,四周后攻毒,排毒情况和病理切片结果表明,p VAX-S1免疫组抗体水平显著高于其他组(P<0.05)并且减少了IBV的排毒,攻毒保护效果更佳。因此选择多种亚型S1蛋白核酸疫苗进行功能性T细胞表位筛选。三、筛选IBV S1蛋白功能性T细胞表位。以IBV S1蛋白氨基酸序列为模板,利用生物信息学方法预测并合成了21条肽,分别以其为刺激物,采用ELIspot法测定不同亚型S1蛋白核酸疫苗免疫SPF鸡诱导脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力,通过3次独立的ELIspot实验,经生物统计分析获得优势表位肽。其中有9号、10号、16号、17号4条短肽可以单独刺激IBV三种不同亚型S1核酸疫苗免疫的鸡淋巴细胞产生IFN-γ(p<0.01),初步确定这些多肽为IBV SI蛋白功能性T细胞抗原表位。为后续研制IBV通用表位疫苗奠定基础。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒逆转录-环介导等温扩增核酸疫苗细胞表位

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鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LDL/97I强弱毒部分生物学特性差异

鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LDL/97I强弱毒部分生物学特性差异

引用

作者：赵飞中国农业科学院

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB）,是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitisvirus, IBV）引起的一种急性、高度感染性的病毒性疾病。IBV是套式病毒目冠状病毒科（Coro?avz>z_t/ae）冠状病毒亚科（Coro?avz>z... 详细信息

鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB）,是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitisvirus, IBV）引起的一种急性、高度感染性的病毒性疾病。IBV是套式病毒目冠状病毒科（Coro?avz>z_t/ae）冠状病毒亚科（Coro?avz>z?ae）的y冠状病毒（gammacoronavims）。为了探索IBV强毒致弱的分子机理，为该病新疫苗的设计以及病毒致病机理研究提供理论依据，本研究以ck/CH/LDL/97I为模式病毒，进行了亲本强毒和鸡胚传代致弱毒之间基因组差异，体内外增殖动态，抗体水平及感染后机体内细胞因子的变化等方面研究。 ck/CH/LDL/97I P5和P115基因组分别由27680和27682个核苷酸组成。基因组结构为：5'-UTR-基因1（ORFla, lb）-S-基因3（ORFs3a,3b, E）-M-基因5（ORFs5a,5b）-N-UTR-3'?系统发育分析显示ck/CH/LDL/97I与美国IBV分离株亲缘关系较近，表明ck/CH/LDL/97I与美国IBV毒株起源相同或具有流行病学联系。本研究对IBV强毒株ck/CH/LDL/97I P5（P5）及其传代致弱毒株ck/CH/LDL/97IP115（P115）全基因组序列进行测序和比对，ck/CH/LDL/97I经115次传代后，nsp5、nsp6、nsp7、nsp8、nsplO,0RF3b和0RF5a基因未发生突变。由于特异性病毒亚群的扩增，nsp4、nsp9、nspll/12、nspl4、nspl5、nspl6和0RF3a基因虽然发生了突变，但是未导致编码氨基酸的改变。与P5相比，P115的5'-和3'-UTRs分别有1处和3处核苷酸突变，M基因和基因5之间有2个核苷酸的插入，P115的S基因存在大量突变，并且一些核苷酸突变导致了氨基酸置换。S2基因比S1基因存在更多的突变，在0RF1编码的nsps基因中，nsp3基因发生的突变最多0 本研究利用突光定量RT-PCR检测P5和P115接种鸡胚后12、24和36h的鸡胚尿囊液中的病毒载量，结果显示P5和P115在鸡胚中的增殖特征相似，病毒载量在接种后24h达到顶峰。为了进一步评价P5和P115的复制能力，本研究利用突光定量PCR检测了P5和P115接种SPF鸡后9个组织中的病毒载量，结果显示:P5和P115接种后4?21天，大部分组织能检测到病毒RNA。但仍有部分组织未检测到病毒RNA，接种后7?21天，P5接种鸡组织中病毒载量高于P115接种鸡，P115接种后4天的气管，肺和哈德氏腺中病毒载量高于P5接种鸡。病毒分离结果显示：P5和P115接种后4和7天的大部分组织能分离到病毒，P5接种组的病毒分离率高于P115接种组。病毒分离和突光定量PCR结果表明P115在一些组织中的复制能力比P5弱。ELISA结果显示，P115接种鸡血清中IBV抗体滴度（0D值）低于P5接种鸡，说明连续鸡胚传代使P115的抗原性减弱。再分离病毒的S1基因序列分析表明P5和P115接种鸡的不同组织中存在病毒亚群。为了进一步研究IBV强弱毒与宿主免疫应答的关系，本研究利用突光定量PCR检测了哈德氏腺，胸腺，盲肠扁桃体，法氏囊，脾中15种细胞因子及调节因子的表达量。结果显示：P5和P115接种鸡不同组织中细胞因子的表达情况各异，P5和P115都能引起脾脏中IFN-a上调表达，表明IFN-a在机体对IBV产生先天性免疫应答的过程中十分重要。P5接种鸡和P115接种鸡脾脏中cMGF的表达量均显著上调表达，并且P5接种鸡cMGF的表达程度高于P115接种鸡，表明cMGF的上调表达可能是由病毒复制引起的。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒全基因组序列病毒载量细胞因子

来源：评论

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鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其鉴定

鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其鉴定

引用

作者：李敏四川农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是一种由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的急性、高度接触传染性呼吸道疾病。它主要引起鸡呼吸道或肾脏感染,蛋鸡的产蛋数量和产蛋品质下降等。... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是一种由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus, IBV)引起的急性、高度接触传染性呼吸道疾病。它主要引起鸡呼吸道或肾脏感染,蛋鸡的产蛋数量和产蛋品质下降等。IBV为冠状病毒(Coronavirus)γ亚群的代表成员,由于其基因组易发生突变和重组,加之不同血清型之间缺乏交叉保护作用,虽然疫苗一直在广泛的使用,但IB仍不断地爆发和流行,给养禽业带来了严重的经济损失。单克隆抗体针对病毒特定的抗原表位结构,具有较强的特异性,对该病的诊断及基因工程疫苗的设计具有重要意义。N蛋白是诱导机体免疫应答和细胞免疫应答的重要免疫原蛋白。本研究以IBV N蛋白作为研究对象,制备了针对N蛋白的单克隆抗体,对IBV的诊断、预防和控制具有一定的意义。实验首先从鸡胚培养的IBV ZY3毒株尿囊液中提取基因组RNA,然后利用软件对其N蛋白抗原表位进行预测分析,设计一对特异性引物对免疫原性好、亲水性强、表位可能性大的保守片段进行了扩增,片段大小为818 bp；将其与表达载体pET-32a(+)连接并转入大肠杆菌BL21中诱导表达,SDS-PAGE检测表达的重组N蛋白大小为50kDa;用Ni-NTA Superflow纯化重组N蛋白后,采用抗鸡IBV血清与之进行Western blot反应以检测其反应原性,结果显示重组蛋白反应原性良好。采用纯化的重组N蛋白加以弗氏佐剂对BALB/c小鼠进行免疫,通过间接ELISA方法检测,发现免疫后的小鼠均能产生高效价的抗体,可用于细胞融合。将SP2/0细胞与免疫小鼠脾细胞进行融合,融合后2周左右用间接ELISA方法对其进行抗体效价检测,将筛选到的阳性细胞孔进行3-4次亚克隆化,最终得了2株能稳定分泌抗重组N蛋白抗体的杂交瘤细胞,分别命名为2833和4E10。经测定,2株单抗亚类分别为IgGl和IgM,轻链均为K链；通过腹水诱导法大量制备的腹水和细胞培养上清抗体效价分别大于106和1：640；这两株单克隆抗体具有良好的特异性,均能与IBV N蛋白发生特异性的反应；经检测,2株杂交瘤细胞均具有良好的传代稳定性。这两株抗IBV N蛋白单克隆抗体研制的成功,对进一步研究IBV N蛋白及建立鸡传染性支气管炎的诊断方法有重要意义。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 N蛋白单克隆抗体鉴定

来源：评论

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鸡传染性支气管炎病毒XT株的分离鉴定及S1基因、M基因的序列分析

鸡传染性支气管炎病毒XT株的分离鉴定及S1基因、M基因的序列分析

引用

作者：孙苗河北农业大学

学位级别：硕士

本研究从北京某集团公司邢台地区的肉鸡场,采集疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡病料,从中分离得到一株病毒,命名为XT株,并对其理化及生物学特性进行鉴定,最终通过基因的测序、对比,来分析它的遗传变异性。无菌采集疑似患传染性支气管炎病... 详细信息

本研究从北京某集团公司邢台地区的肉鸡场,采集疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡病料,从中分离得到一株病毒,命名为XT株,并对其理化及生物学特性进行鉴定,最终通过基因的测序、对比,来分析它的遗传变异性。无菌采集疑似患传染性支气管炎病鸡的气管、肾脏、腺胃等,研磨制成病毒液,在10日龄SPF鸡胚上传代,并收集尿囊液。尿囊液对鸡红细胞无直接血凝性,经1%胰酶处理后出现血凝现象;新城疫干扰试验显示XT株F5代尿囊液对新城疫Lasota株在鸡胚中的复制具有干扰作用,使其血凝效价下降了2～3个值;将XT株F5代尿囊液接种10日龄鸡胚144 h后,与对照组相比,试验组鸡胚发育迟缓,经SPSS V17分析两组鸡胚体重差异极显著,说明XT株对鸡胚具有致矮小作用;病毒回归试验动物后,鸡只出现了典型的IBV临床及解剖症状,且采集所有鸡只病料分离得到的病毒液,经IBV RT-PCR诊断试剂盒检测,对照组均为阴性,试验组绝大多数为阳性,说明试验鸡不同程度的感染了IBV。XT株理化特性试验表明:该病毒对酸（p H 3.0）碱（p H 11.0）均敏感,并且病毒对酸的耐受力要比对碱的耐受力略强;经56℃,1 h水浴加热,毒力下降了3个滴度,而添加Mg2+组毒力下降不到2个滴度,说明病毒对热敏感,Mg2+能提高其耐热性;病毒对有机溶剂乙醚、氯仿均敏感,处理后毒力均下降了2～3个滴度,以上特性均符合传染性支气管炎病毒的相关特性。经测定,XT株F5代病毒液的EID50为10-5.69/0.1ml;血清交叉中和试验结果显示:XT株与传支疫苗株H120、W93的关系系数分别为77.98%、44.88%,依据判定标准（R>80%,两毒株为同一亚型;25%77%,而与山东分离株WF同源率较高,核苷酸同源率为91.3%,氨基酸同源率为90.9%,M基因序列对比结果与S1基因基本一致,但M基因与各参考毒株序列同源性总体较S1基因高,说明M基因较S1基因保守。序列对比结果显示:XT株与当前国内广泛使用的疫苗株同源性较低,与一株山东分离株WF同源性较高。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 XT株 S1基因 M基因同源性

来源：评论

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鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

引用

作者：张秀文中国农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Avian Infection Bronchitis，简称IB)是由冠状病毒科的鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infection Bronchitis virus，简称IBV)引起鸡的一种急性高度接触性传染病。此病在世界各地均有发生，给全球养禽业造成巨大的经济... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Avian Infection Bronchitis，简称IB)是由冠状病毒科的鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infection Bronchitis virus，简称IBV)引起鸡的一种急性高度接触性传染病。此病在世界各地均有发生，给全球养禽业造成巨大的经济损失。最近几年，在我国很多地区IB爆发性流行，尤其是在中部和南方造成较大的危害。因此，对IB的发生、流行和病原变异的分析和研究，将为该病的综合防控提供有用的参考依据。\n 本研究，对来自三个省区的疑为传染性支气管炎的病料进行了实验室病毒分离和鉴定。结果表明，4株分离株均能引起胚体发育不良，个体小，头、爪合抱，呈蜷缩现象；胚体和胚腹腔有明显尿酸盐沉积的典型肉眼变化；其尿囊液不凝集鸡红细胞；在鸡胚内对NDV-Ⅱ有干扰作用：动物回归试验复制出的病例表现出的临床症状、病理变化和较高的死亡率与自然发病的病例相同。为了进一步证明4株病毒为鸡传染性支气管炎病毒，我们对4株IBV的毒株进行了分子生物学鉴定，PCR结果表明，4株病毒均能扩增出1569bp预期大小的S1片段，证实所分离的毒株为传染性支气管炎病毒。\n 传染性支气管炎病毒血清型较多且抗原易发生变异，给该病的诊断和防治造成了困难。S1蛋白是IBV主要的免疫原蛋白，能介导细胞融合，刺激机体产生病毒中和抗体和血凝抑制抗体；S1蛋白基因具有较强的型特异性，但很容易发生变异，使IBV不断的出现新的血清型。为了解病毒变异情况，对4个IBV分离株的S1基因进行了测序，应用生物学软件将所测S1基因序列进行了同源性比较，绘制了系统进化树。序列分析结果表明，S1基因和国内外标准毒株存在着不同程度的差异；而所有分离株有较近的亲缘关系，形成了一个进化分支，从而说明IBV病毒的发生和进化与地域有一定的相关性。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定 S1基因基因序列分析冠状病毒科

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鸡传染性支气管炎病毒（IBV）结构蛋白基因的克隆、表达及应用研究

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）结构蛋白基因的克隆、表达及应用研究

引用

作者：杨叶民南昌大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，已成为养鸡业中危害最大的病毒性传染病之一。IBV不具有血凝性，因此无法利用血凝抑制试验来检测感染或免疫后动物体内IBV抗体。鸡体内IBV抗体的检... 详细信息

鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病，已成为养鸡业中危害最大的病毒性传染病之一。IBV不具有血凝性，因此无法利用血凝抑制试验来检测感染或免疫后动物体内IBV抗体。鸡体内IBV抗体的检测具有以下作用：1、对鸡体内IBV母源抗体的检测可以为确定适当的免疫时间提供依据；2、对免疫后鸡群血清IBV抗体水平检测可以评估免疫效果；3、对鸡血清IBV抗体水平的检测也可以作为IB诊断的辅助手段。有报道利用气管环中和试验检测IBV抗体，但该试验费时、费力，难以广泛推广。酶联免疫吸附实验(ELISA)以其敏感、客观、成本低廉等优点，在传染病的诊断、抗体检测等方面得到了广泛地运用。目前，国外已有商品化的IBV抗体检测试剂盒，但该试剂盒是以灭活IBV为包被抗原，需要大量地培养IBV病毒，存在散毒的潜在危险，而且有关的IBV纯化试验表明，IBV在离心纯化过程中，病毒粒子容易破碎，冠极易丢失，不易得到完整的IBV病毒抗原。为解决以上问题，本实验设计通过基因工程方法表达病毒结构蛋白基因，利用重组结构蛋白代替全病毒作为ELISA检测包被抗原，建立检测IBV血清IgG抗体和眼泪IgA抗体的方法，为检测IBV抗体提供依据。 1．克隆了IBV M41毒株N基因和IBV H52毒株S1基因，对它们进行了序列测定和与GenBank中收录的IBV N基因、S1基因序列进行了比较分析，并用Clustal X和Mega软件将N基因、S1基因与公布的标准序列做同源性比较和系统进化分析。 2．在原核系统中表达了IBV N结构蛋白基因和S1结构蛋白基因的一个抗原表位片断基因，并利用纯化得到的重组蛋白建立间接ELISA方法，对雏鸡血清和眼泪中的母抗和对人工感染IBV M41雏鸡血清和眼泪中的抗体进行了检测，通过相关性分析，表明重组N蛋白是理想的检测用抗原，具有较好的特异性和敏感性，S1多肽的一个片断也可做检测用抗原，但特异性较差。 3．许多病原体通过胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道粘膜侵入动物机体，因此，有效的粘膜免疫在抵抗这类病原时具有重要的地位。本实验通过对眼泪中粘膜抗体的检测，建立了检测IBV感染后粘膜抗体水平的方法。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 N蛋白 S1蛋白酶联免疫吸附实验粘膜免疫

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鸡传染性支气管炎病毒H120、W93、H52、M41疫苗株鸡胚肾细胞培养及生物学特性的研究

鸡传染性支气管炎病毒H120、W93、H52、M41疫苗株鸡胚肾细胞培养...

引用

作者：樊晓旭中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成巨人的经济损失。由于鸡传染性支气管炎病毒的宿主范围... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由冠状病毒属鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成巨人的经济损失。由于鸡传染性支气管炎病毒的宿主范围窄,较难适应细胞培养,病毒主要使用鸡胚培养制备,而很少使用细胞培养方法。而且,目前对IBV在细胞上培养及其生物学特性方面的研究还比较少,因此,对IBV特别是疫苗株进行这方面的研究是非常必要的。本实验对IBV疫苗株在鸡胚肾(CEK)细胞上进行了培养及生物学特性鉴定,建立了鸡传染性支气管炎病毒荧光定量PCR(IBV FQ-PCR)快速检测方法,用于病毒含量的快速检测。首先,将IBV H120、W93、H52和M41疫苗株在鸡胚肾(CEK)细胞、鸡胚成纤维(CEF)细胞、Vero细胞、添加TPCK胰酶培养的Vero细胞和添加D-氨基葡萄糖培养的Vero细胞上进行了传代培养,经RT-PCR检测发现用CEK细胞培养IBV疫苗株生长效果最好。将H120、W93、H52和M41株在CEK细胞上继续培养传代至25代,进行细胞毒致CEK细胞病变和感染鸡胚病变的观察、血凝试验、病毒含量的测定、S1基因序列测定比对分析及血清学试验,研究IBV疫苗株CEK细胞毒的生物学特性。结果表明,IBV疫苗株CEK细胞毒能够引起CEK细胞圆缩、聚团,产生特异性细胞病变；病毒接种鸡胚后,感染鸡胚出现失水、蜷缩、生长发育小等病变；尽管经产气荚膜梭菌上清液处理,但IBV疫苗株细胞毒不表现血凝性；用EID50方法测定的细胞毒病毒含量比鸡胚尿囊液毒低约1个滴度；IBV细胞毒S1基因突变与病毒含量变化有关,少数氨基酸的改变(即点突变)可能引起毒力的改变。此外,在培养过程中发现,M41株在CEK细胞上传代至第3代即出现细胞病变,适应性要比其他3株快；M41 E11P18细胞毒病毒滴度最高,为106.87EID50/0.1mL,M41病毒滴度平均值高于其他3个疫苗株细胞毒；在CEK细胞传代过程中,IBV H120和H52株S1基因变异比W93株和M41株活跃；用ELISA方法将相同毒株细胞毒和鸡胚尿囊液毒免疫鸡产生的抗体S/P值(大于0.2判为阳性)进行比较发现,H120细胞毒抗体S/P值在免疫后14天为-0.01,与鸡胚尿囊液毒相同,在免疫后21、28天为0.153、0.282,略大于鸡胚尿囊液毒的0.071、0.216,而免疫后35天为0.31,小于后者的0.385；W93细胞毒的抗体S/P值在免疫后14、21、35天为-0.02、0.02、0.261,均小于鸡胚尿囊液毒的-0.001、0.039、0.37,而在免疫后28天,两者抗体值相等,均为0.141；H52细胞毒的抗体S/P值在免疫后14、21、35天为0.246、0.815、1.044,均低于鸡胚尿囊液毒的0.307、0.964、1.154,而在免疫后28天前者为1.269,略高于后者的1.128；免疫后14、21、28、35天,M41株细胞毒的抗体S/P值分别为0.108、0.189、0.544、0.828,均高于鸡胚尿囊液毒-0.03、0.011、0.34、0.808抗体S/P值。通过上述结果发现,M41株病毒适应细胞较快,细胞毒的病毒含量高、遗传变异相对稳定,免疫鸡产生的ELISA抗体均高于同期M41鸡胚尿囊液毒,显示了较好的细胞适应性和免疫原性。本实验通过构建重组质粒作为定量标准品、优化反应体系、建立标准曲线,建立了鸡传染性支气管炎病毒荧光定量检测方法(IBV FQ-PCR),分析与鸡胚半数感染量(EID50)方法的相关性,并用该方法监测IBV疫苗株H120、W93、H52和M41在鸡胚肾(CEK)细胞传代过程中病毒含量的变化,研究不同接毒量和不同收毒时间细胞毒病毒含量的差异。结果表明,IBV FQ-PCR标准曲线相关系数为0.995；重复性试验的变异系数小于0.0805；可检测到初始模板中2.916×10拷贝/μL的病毒核酸,检测灵敏度为常规PCR检测灵敏度的10倍；与其他禽源病毒如鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊炎病毒(IBDV)、网状内皮组织增生病毒(REV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)均无交叉反应；证明IBV FQ-PCR具有良好的稳定性、灵敏性和特异性。通过对IBVFQ-PCR方法与EID50方法进行相关性分析,发现两种方法所得数据之间的相关系数为r=0.748,相关系数显著性检验(t检验)t值为4.653,大于t0.01(20-2)的3.922,说明两者相关性极显著；同时建立两种方法检测病毒含量的平行关系并得到回归方程。使用该方法检测病毒在CEK细胞传代过程中病毒含量的变化

关键词：鸡传染性支气管炎病毒鸡胚肾细胞生物学特性荧光定量PCR方法

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