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中国畜牧兽医 2005年第3期32卷 24-26页

作者：孙丽娜江勇胡建民沈阳农业大学畜牧兽医学院沈阳110161

鸡传染性支气管炎 (IB)目前已成为养鸡业中危害最大的病毒性传染病之一。病毒基因组 RNA的点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组所导致的病毒血清型、基因型和组织嗜性的改变是造成现用疫苗免疫失败的主要原因。病毒的变异... 详细信息

鸡传染性支气管炎 (IB)目前已成为养鸡业中危害最大的病毒性传染病之一。病毒基因组 RNA的点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组所导致的病毒血清型、基因型和组织嗜性的改变是造成现用疫苗免疫失败的主要原因。病毒的变异已成为当前对 IBV病原学及本病免疫防制研究中的热点 ,作者重点就 IBV变异机制及其变异株的来源等方面作一综述。

关键词： IBV 鸡传染性支气管炎病毒免疫防制组织嗜性分子变异毒株病毒基因组改变点突变机制

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表面展示鸡传染性支气管炎病毒M41株S1蛋白的重组假型杆状病毒的构建

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华南农业大学学报 2012年第3期33卷 398-402页

作者：陈筱薇樊惠英林文耀程晓亮叶昱陈春丽廖明华南农业大学兽医学院农业部动物疫病防控重点实验室广东广州510642 四川农业大学动物医学院四川雅安625000

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp6... 详细信息

以鸡传染性支气管炎病毒M41毒株基因序列为模板,利用PCR方法扩增膜定位信号缺失的S1基因(dS1),将其亚克隆入杆状病毒表面展示质粒pBACsurf-1中,再次将S1及gp64的基因片段克隆到杆状病毒转移质粒pFastBacTMDual,得到重组质粒pFastBac-gp64-dS1.将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,获得重组穿梭载体Bacmid-gp64-dS1,提取重组Bacmid质粒,以PCR验证其正确性.将阳性重组Bacmid质粒利用脂质体转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒BV-dS1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以Sf9昆虫细胞膜表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白.

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 M41 表面展示 S1蛋白重组杆状病毒

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抗鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体的构建及初步鉴定

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中国预防兽医学报 2009年第10期31卷 800-803,832页

作者：徐佳韩宗玺杨光邵昱昊李慧昕孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 吉林省四平市动物疫病预防控制中心吉林四平136000

为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBVN蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链... 详细信息

为了构建鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(N)单链抗体(scFv),本研究通过提取杂交瘤细胞株6H3的总mRNA,采用RT-PCR法扩增出抗IBVN蛋白抗体的重链和轻链可变区基因,利用重叠延伸PCR将其重链和轻链通过一条寡核苷酸链连接起来扩增了单链抗体基因,并将其克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组质粒,转化***21(DE3),经IPTG诱导表达。对表达产物进行纯化复性后,用夹心ELISA和westernblot检测表明scFv可与传染性支气管炎病毒核蛋白发生特异性结合。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒核蛋白单链抗体原核表达

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中国鸡传染性支气管炎病毒基因型变迁与H120株重组疫苗载体构建

中国鸡传染性支气管炎病毒基因型变迁与H120株重组疫苗载体构建

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作者：封柯宇华南农业大学

学位级别：博士

鸡传染性支气管炎(IB)是由禽γ-冠状病毒引起的一种急性接触性传染病,该病给养禽业带来极大的危害并造成严重的经济损失。长期流行病学监控及针对流行毒株的疫苗研发对于该病的防控具有重要的意义。本论文旨在研究中国不同时期鸡传染性... 详细信息

鸡传染性支气管炎(IB)是由禽γ-冠状病毒引起的一种急性接触性传染病,该病给养禽业带来极大的危害并造成严重的经济损失。长期流行病学监控及针对流行毒株的疫苗研发对于该病的防控具有重要的意义。本论文旨在研究中国不同时期鸡传染性支气管炎病毒(IBV)分离株基因型构成及其发生、发展变迁规律与趋势;构建IBV H120疫苗株感染性克隆并进行基因替换、插入等修饰及病毒拯救,快速制备针对流行毒株的IB疫苗候选毒株及开发IBV载体疫苗。第一部分:中国鸡传染性支气管炎病毒基因型变迁规律2016-2019年本实验室从15个省份黄羽肉鸡和种鸡群中分离鉴定IBV203株并进行S1基因测序。将所得序列与Gen Bank中下载的中国IBV分离株S1基因1700条一起整理,划分为5个时间段进行进化分析,构建系统发生树。通过不同时期分离株基因型比较和分析,研究发现中国大陆地区IBV广泛流行始于1980年之后,流行史上至少出现了13个进化分支和少量变异株进化分支。这些进化分支中,GI-19、GI-22、GI-7、GVI-1分支起源于我国。GI-19分支毒株出现时间不晚于1993年,2000年以后成为中国最主要的优势基因型,占分离毒株50%以上,在各省及不同年份均有分离,在时间和地理分布方面没有明显的倾向。GI-22分支是我国早期出现的进化分支,早期毒株出现于1995-1999年间,近年来该分支毒株分离数量和所占比例出现了下降趋势。GI-7分支起源于我国台湾地区,早期毒株可追溯至1964年,1990年后分化为TW I和TW II两个亚分支,2009年之前,大陆地区仅分离少数TW II型,2009年后,大量TW I型毒株被分离鉴定,并成为主要流行基因型。GVI-1分支毒株于2007年首次分离,该型毒株S1与其他分支毒株差异较大,虽持续分离,但分离总数量少,地理分布范围局限。GI-1和GI-13分支源自广泛使用的国外引入的Mass型疫苗株和4/91型疫苗株,这两个分支毒株在我国广泛分布,也是我国主要的流行基因型。GI-4、GI-5、GI-6、GI-9、GI-16、GI-18和GI-23型毒株均起源于国外,其中国分离株数量稀少,仅在局部地区或某个时期分离,并未引起广泛爆发与流行。研究提示我们我国IBV流行处于不断动态变化中,应加强IBV分子流行病学监控,掌握基因变异变化趋势;疫苗研发应立足于本土流行毒株,迫切需要快速有效的新技术和方法。第二部分:传染性支气管炎病毒H120株感染性克隆构建与病毒拯救利用RED/ET重组工程技术成功构建基于中拷贝质粒载体p BR322的IBV疫苗H120株感染性克隆p BR322-H120及其病毒拯救系统。利用该系统成功拯救病毒r H120,拯救病毒传代稳定,经鉴定生物学特性与母本病毒H120一致。第三部分:传染性支气管炎病毒H120株感染性克隆修饰与重组病毒拯救本研究利用RED/ET重组技术结合ccd B反向筛选对感染性克隆p BR322-H120进行同源S1、S和N基因替换,外源基因EGFP、H9N2 AIV HA基因、ILTV g D基因的插入/替换修饰。同源基因替换采用QX型IBV GL15株和TW I型IBV GZ14株作为基因供体,设计三种S1基因、两种S基因、两种N基因长度及位置替换方式,在此基础上设计了GZ14 S1和N双基因替换,GL15株和疫苗4/91株嵌合S基因替换,构建成功14种重组质粒,成功拯救出9株重组病毒。外源基因替换/替换方面,利用IBV复制非必须区5ab、3ab和IR区作为外源基因替换/插入位点,以绿色荧光蛋白EGFP基因、ILTV g D基因和截短的H9N2 AIV HA基因(900 bp)作为基因供体,对感染性克隆p BR322-H120进行替换/插入修饰,成功构建出9种重组质粒,经病毒拯救,获得重组病毒r H120-△5ab/EGFP、r H120-△IR/EGFP、r H120-△IR/Flag-ILTV g D和r H120-△5ab/Flag-h H9HA(900 bp)。对拯救病毒的生物学特性研究发现,9株同源基因替换的重组病毒传代稳定,病毒滴度与母本病毒H120株无显著性差异(P>0.05)。4株替换/插入外源基因的重组病毒均可表达外源蛋白,但病毒滴度低于亲本毒株。九株同源基因替换的重组病毒进行动物实验,筛选出两株TW I型疫苗候选毒株:r H120-△S1p/GZ14和r H120-△S1z-△Nz/GZ14,三株QX型疫苗候选毒株:r H120-△S1p/GL15、r H120-△Sp/GL15和r H120-△Sp/GL15-4/91。本研究对我国IBV流行情况进行回溯,总结我国各时期IBV主要流行基因型及其起源、发生和发展,为IBV分子流行病学研究和防控提供参考。本研究成功构建IB

关键词：鸡传染性支气管炎病毒基因型感染性克隆反向遗传病毒拯救

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检测鸡传染性支气管炎病毒GVI-1基因型毒株的实时荧光定量PCR方法建立

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中国兽医学报 2021年第11期41卷 2121-2125,2131页

作者：陈淑琴杜旭彬鄢坤廖凯张成成郭梦娇吴艳涛张小荣扬州大学兽医学院江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为快速鉴别GVI-1基因型鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)毒株与其他基因型毒株,根据IBV不同基因型毒株S1基因序列差异较大的区域设计特异性引物和探针,建立了检测GVI-1基因型毒株的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。... 详细信息

为快速鉴别GVI-1基因型鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)毒株与其他基因型毒株,根据IBV不同基因型毒株S1基因序列差异较大的区域设计特异性引物和探针,建立了检测GVI-1基因型毒株的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。该方法在1.0×10^(1)~1.0×10^(10)拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.999;对质粒标准品的检测下限可达1.0×10^(1)拷贝/μL;与GI-1、GI-7、GI-13、GI-19和GI-28等其他基因型毒株和疫苗株均无交叉反应;组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%;应用该方法和常规PCR方法对人工感染雏鸡的口腔和泄殖腔棉拭子进行检测,2种方法的符合率为96.7%,且qPCR方法敏感性更高。结果表明,本研究建立的GVI-1基因型IBVqPCR检测方法灵敏度高,特异性强,可重复性好,可应用于GVI-1基因型IBV流行病学监测和临床分离株的快速筛查。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 GVI-1基因型实时荧光定量PCR 鉴别检测

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上海地区鸡传染性支气管炎病毒流行株检测分析及siRNA的干扰效应

上海地区鸡传染性支气管炎病毒流行株检测分析及siRNA的干扰效应

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作者：刘惠莉南京农业大学

学位级别：博士

鸡传染性支气管炎病毒（Infecfious bronchitis virus,IBV）可引起鸡呼吸道、生殖道和肾脏病变及腺胃肿大,传染性强、致死率高,呈世界范围分布,是危害养禽业的重要疫病之一。IBV编码6种蛋白,位于病毒囊膜表面的纤突蛋白（S）是病毒主要... 详细信息

鸡传染性支气管炎病毒（Infecfious bronchitis virus,IBV）可引起鸡呼吸道、生殖道和肾脏病变及腺胃肿大,传染性强、致死率高,呈世界范围分布,是危害养禽业的重要疫病之一。IBV编码6种蛋白,位于病毒囊膜表面的纤突蛋白（S）是病毒主要的免疫原,S是由S1、S2亚单位组成。S1主要功能是结合细胞膜上受体,但只有在与S2的共同作用下,才能启动病毒与细胞膜融合。由于S1亚单位与病毒组织嗜性、致病性和免疫原性密切相关,对其研究较多,但作为协同作用启动IBV感染的S2片段,决定着IBV能否进入易感细胞而产生致病作用,因而明确S2亚单位生物学地位,以及S2与S基因进化间的关系,能更客观地分析IBV进化规律和致病分子基础。 IBV具有高度变异性,血清型众多,并且不同血清型之间交叉保护非常小或没有保护作用,因而对IBV的控制是个难点。探讨利用新技术控制IBV成为预防该病的一个重要课题。 RNA干扰（RNAi）是近年来发展起来的一项新技术,由于其具有强大的抗病毒效应,很快就成为控制病毒性疾病的新手段,尤其是一些重要病毒性疾病,现有药物和疫苗无法提供较好保护作用时,RNAi技术无疑提供了非常有前景的手段。RNAi已成功应用于多种病毒感染治疗,如脊髓灰质病毒、轮状病毒、呼吸道合胞体病毒、流感病毒、人严重急性呼吸道疾病。但对禽病毒方面却没有研究,有鉴于此,我们对利用siRNA技术控制IBV增殖的效果进行了研究。 1 上海地区IBV分离鉴定及S2基因检测、分析对临床发病疑似IB的鸡群,采集病料,接种9日龄SPF鸡胚,24h-48h收集尿囊液,盲传3代,RT-PCR检测、测序为IBV阳性的,取尿囊液电镜观察病毒粒子,部分在电镜下观察到典型的冠状病毒粒子,共分离到10株上海地区IBV流行株。根据GenBank中发表的IBV S基因序列,设计合成了一对引物,模拟PCR表明,该引物对能扩增现有已发表的所有IBV的S2基因核酸序列,扩增片段493bp。分别以本室保存的IBV疫苗株H52和IBV分离株建立了检测S2基因片段的RT-PCR体系,检测体系灵敏度达10-50ELD50,检出限量为0.1ng。对上海地区疑似IBV样品（肾、喉、气管）34份进行检测,阳性为32份。将扩增片段克隆入pMD18-T载体,经PCR鉴定和序列分析表明均为肾变型IBV S2基因片段。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S2片段分子特性小干扰RNA RNAi效应

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鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白克隆表达与免疫原性检测

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四川畜牧兽医 2017年第4期44卷 24-27页

作者：李敏李俐睿岳建国周立新黄勇成都市动物疫病预防控制中心四川成都610041 四川农业大学四川温江611130

本文以IBV N蛋白为研究对象,首先从鸡胚培养的IBV ZY3毒株尿囊液中提取基因组RNA,然后利用软件对其N蛋白抗原表位进行预测分析,设计一对特异性引物对免疫原性好、亲水性强、表位可能性大的保守片段进行扩增,片段大小为818 bp;将扩增产... 详细信息

本文以IBV N蛋白为研究对象,首先从鸡胚培养的IBV ZY3毒株尿囊液中提取基因组RNA,然后利用软件对其N蛋白抗原表位进行预测分析,设计一对特异性引物对免疫原性好、亲水性强、表位可能性大的保守片段进行扩增,片段大小为818 bp;将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接并转入大肠杆菌BL21中诱导表达,用SDS-PAGE检测表达的重组N蛋白大小为50 kDa;用Ni-NTA Superflow纯化重组N蛋白后,采用抗鸡IBV血清与之进行Western blot反应,检测其免疫原性,结果显示重组蛋白免疫原性良好。该结果对进一步研究IBV N蛋白及建立鸡传染性支气管炎的诊断方法有重要意义。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 N基因原核表达 Western blot

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鸡传染性支气管炎病毒M41株、HN99株免疫交叉保护试验

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兽医导刊 2018年第18期 214-215页

作者：阮武营仲伟平开封市动物疫病预防控制中心河南开封470002

将试验鸡分为免疫组和对照组，分别用IBV M41、HN99株等毒株滴鼻、气管内注入、点眼等途径攻毒，每种病毒各攻毒10只，攻毒剂量为10 5.0 EID50。同时从对照组取10只，同时攻毒。结果表明，M41株乳化抗原免疫组能够对M41株和Hb株攻毒提... 详细信息

将试验鸡分为免疫组和对照组，分别用IBV M41、HN99株等毒株滴鼻、气管内注入、点眼等途径攻毒，每种病毒各攻毒10只，攻毒剂量为10 5.0 EID50。同时从对照组取10只，同时攻毒。结果表明，M41株乳化抗原免疫组能够对M41株和Hb株攻毒提供保护、HN99株乳化抗原免疫组能够对HN99株攻击提供保护，而M41株＋HN99株联合乳化抗原免疫组能够对M41株和HN99株、Hb株的攻毒提供100％保护，对照组发病。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 M41株 HN99株交叉保护试验

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腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒(IBV-D971株)致弱的研究

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中国预防兽医学报 2001年第6期23卷 466-469页

作者：荣骏弓谷守林胡守萍王成梅付德霞曲亚美中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001 哈尔滨市农场局

将IBV_D971株病毒在SPF鸡胚上连续传至 12 0代 ,培育出了一株毒力明显减弱 ,并且具有良好免疫原性的腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒弱毒株 (IBV_D971株 )。IBV_D971F10 5代毒力明显下降 ,以 10 9.2 5EID50 接种 1日龄SPF鸡 5 / 5无不... 详细信息

将IBV_D971株病毒在SPF鸡胚上连续传至 12 0代 ,培育出了一株毒力明显减弱 ,并且具有良好免疫原性的腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒弱毒株 (IBV_D971株 )。IBV_D971F10 5代毒力明显下降 ,以 10 9.2 5EID50 接种 1日龄SPF鸡 5 / 5无不良反应。IBV_D971F10 5代毒连续通过 1日龄SPF鸡体 5代 ,未见毒力返强。以 10 3EID50 免疫 1日龄SPF鸡 ,攻毒后 5 / 5保护 ,对照 5 /

关键词：鸡传染性支气管炎病毒腺胃病变型弱毒株致弱

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鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因的克隆及序列测定

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上海交通大学学报（农业科学版） 2003年第4期21卷 281-285页

作者：孙涛王欣陆苹上海交通大学农业与生物学院上海201101

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物,经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物;将目的条带纯化并回收以后,克隆到pMD18-T质粒载体中,对插入片段进行序列测定,并与已发表... 详细信息

根据IBV病毒的已报道基因序列设计了用于扩增鸡传染性支气管炎病毒M41株S1基因和T株核衣壳蛋白基因(N)的引物,经RT-PCR得到了预期大小的扩增产物;将目的条带纯化并回收以后,克隆到pMD18-T质粒载体中,对插入片段进行序列测定,并与已发表的IBVS1、N基因序列进行了比较和分析,表明具有高度同源性。证明我们克隆了IBVS1和N结构蛋白基因。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白基因克隆序列测定

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