检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医学报 2024年第9期44卷 1854-1864页

作者：蓝嘉宁卞希一盛豪肖鹏颜焰周继勇廖敏浙江大学动物科学学院浙江杭州310058 浙江大学农业农村部动物病毒学重点实验室浙江杭州310058

旨在为分离鉴定鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)并研究其致病性。从疑似传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)感染的安徽合肥临床送检样品中成功分离到1株IBV(HF210416)。该毒株S1基因测序分析表明HF21041... 详细信息

旨在为分离鉴定鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)并研究其致病性。从疑似传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)感染的安徽合肥临床送检样品中成功分离到1株IBV(HF210416)。该毒株S1基因测序分析表明HF210416属于GI-22基因型,与参考的GI-22型毒株S1基因序列存在较大差异,同源性仅在84.5%~87.8%之间。重组分析结果显示,HF210416为重组毒株,主要亲本为YX10(GI-19型),次要亲本为YN(GI-19型)。2日龄SPF雏鸡感染HF210416分离株表现明显的呼吸困难、精神沉郁、排水样粪便等临床症状;感染鸡发病较急,接种后2 d便出现死亡现象,死亡持续至第5天,病死率为33.33%(5/15);攻毒后14 d,雏鸡恢复健康;攻毒鸡咽肛拭子的RT-PCR检测结果显示,14 d的试验期内能持续检测到攻毒鸡的排毒;剖检死亡和未死亡的感染鸡发现肾脏肿大、苍白,并伴有明显的尿酸盐沉积等病变;组织病理切片HE染色显示气管纤毛脱落,免疫组化结果显示气管、肺脏、肾脏均观察到明显的病毒信号。病毒载量测定结果表明,HF210416在肾脏组织中的载量最高,其次在盲肠扁桃体和气管中也具有较强的复制能力;血清中和试验结果表明,HF210416对GI-22同基因型毒株具有较好的中和效果,但对其他基因型毒株中和效果较差,不适合作为疫苗的候选毒株。总而言之,GI-22型分离株HF210416对雏鸡具有较强的致病性和嗜肾性,其基因组遗传特性与免疫原性与其他毒株均存在较大差异,该研究丰富了IBV毒种资源,为了解GI-22基因型病毒在中国的流行及其致病性提供了参考数据。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒安徽合肥分离株 GI-22型致病性

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鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2013年第10期26卷 1463-1466页

作者：王富妍任雅邹年莉郭明萍吴瑞婷付润饶文心田曹三杰黄勇四川农业大学动物医学院动物预防医学生物工程实验室四川雅安625014 四川省雅安市天全县农业局四川雅安625500

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IB... 详细信息

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体。对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析。结果获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性。结论制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 M蛋白单克隆抗体酶联免疫吸附测定

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鸡传染性支气管炎病毒广西分离株血清型的分析

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中国兽医学报 2010年第2期30卷 183-187页

作者：王秀英韦平陈秋英李孟磨美兰张胜斌韦飞妮广西大学养禽与禽病研究所广西南宁530005

应用病毒感染的鸡胚材料免疫新西兰兔的方法制备抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单因子血清,然后在鸡胚气管环培养(Tracheal organ cultures,TOC)上对广西分离的7个IBV代表性毒株和3个常用疫苗株进行交叉病毒中和试验。结果显示,10个毒株... 详细信息

应用病毒感染的鸡胚材料免疫新西兰兔的方法制备抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)单因子血清,然后在鸡胚气管环培养(Tracheal organ cultures,TOC)上对广西分离的7个IBV代表性毒株和3个常用疫苗株进行交叉病毒中和试验。结果显示,10个毒株被分为6个血清型。根据试验所得的R值,应用聚类分析法分析了各血清型毒株之间的亲缘关系,显示目前在广西流行的IBV野毒株之间以及其与疫苗株间的抗原性存在很大程度的差异,分属不同的血清型。同时还对IBV基因分型和血清分型之间的关系进行了探讨。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒气管环组织培养交叉中和试验血清型抗原变异聚类分析

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鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株S1基因序列测定及同源性分析

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中国预防兽医学报 2002年第1期24卷 1-3页

作者：刘明春江国托康丽娟刘思国赵玉军沈阳农业大学畜牧兽医学院辽宁沈阳110161 大连三仪生物工程研究所辽宁大连116000 大连市畜牧兽医技术服务中心辽宁大连116013 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

通过反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株 (SY株 )的免疫原S1基因cDNA ,将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ /BamHⅠ酶切位点中 ,测定插入片段核苷酸序列 ,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明 ,S... 详细信息

通过反转录_聚合酶链反应 (RT_PCR)扩增出鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株 (SY株 )的免疫原S1基因cDNA ,将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的EcoRⅠ /BamHⅠ酶切位点中 ,测定插入片段核苷酸序列 ,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明 ,SY毒株S1基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M4 1、H12 0 、N1_6 2、Gray、6 / 82、Ark99等毒株的同源百分率都低于 80 %。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 S1基因测序同源性分析

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鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株S1基因序列及致病性分析

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中国动物传染病学报 2021年第6期29卷 22-27页

作者：胡晓苗盛豪郑忠毅卞希一张丹俊周继勇廖敏潘孝成安徽省农科院畜牧兽医研究所安徽省畜禽疫病研究中心畜禽产品安全工程安徽省重点实验室合肥230031 浙江大学农业农村部动物病毒学重点实验室杭州310058

从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为HF200702。分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象;基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示,分离株属于目前流行的QX型,与H120、M41、4/91、Q... 详细信息

从安徽合肥一养殖户送检的临床样品中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为HF200702。分离株在鸡胚盲传3代过程中可引起典型的侏儒胚现象;基于分离株S1基因序列对毒株进行分型结果显示,分离株属于目前流行的QX型,与H120、M41、4/91、QX等疫苗株的同源性分别为76.1%、75.6%、78.3%、95.0%;用分离株第10代鸡胚尿囊液感染1日龄SPF雏鸡,对雏鸡的致死率为41.6%,感染鸡出现精神沉郁、张口呼吸、气管啰音等临床症状以及气管纤毛摆动停滞、肾脏肿大、尿酸盐沉积等病理变化。感染鸡从感染后第2 d开始持续向外界排毒直至感染后28 d。该研究数据表明,从安徽合肥某养鸡场疑似发生传染性支气管炎的鸡群中分离到QX型的IBV,该毒株对雏鸡有较强的致病作用,研究结果为了解该地区IBV的流行情况提供了参考数据。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒合肥分离株 S1基因序列分析致病性

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鸡传染性支气管炎病毒基因型与血清型相关性初步研究

鸡传染性支气管炎病毒基因型与血清型相关性初步研究

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作者：汪洋中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV基因组RNA复制的不连续性以及RNA聚合酶... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病,给养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV基因组RNA复制的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制,基因组十分容易发生点突变、缺失、插入和不同毒株基因组间的同源重组等,使得病毒的基因型、血清型、结构蛋白、免疫原性等容易发生变化,造成病毒临床表现复杂,各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用,从而给本病的防治带来很大的困难。IBV毒株的分型对于实施有效的疫病控制、流行病学调查及研究病毒的演化意义重大。本研究采用基因分型与血清学分型相结合的方法对国内近年来所流行的毒株和疫苗株、检验用毒株进行分型,进而判定两者之间的相关性,更真实地反映其生物学特征,为目前鸡传染性支气管炎病毒的分型提供一定的参考,有助于IB疫苗的正确使用,对今后鸡传染性支气管炎的防治也有着积极的意义。本研究以收集自国内不同地区的17株IBV分离株、2株疫苗生产用毒株(M41、W93)和1株攻毒用强毒株X株为研究对象,采用自行设计特异性引物经RT-PCR技术扩增得到20株IBV的S1蛋白基因片段。将目的基因S1插入到pGEM-T Easy载体,重组质粒经PCR鉴定为阳性后,对插入片段进行测序。应用DNAStar分析软件的Clustal V方法将克隆测序的S1蛋白基因分别与GenBank中的20株国内外参考毒株的S1基因进行序列比较和同源性分析,绘制S1基因系统进化树。结果表明:20株IBV毒株与我国IBV分离株、我国常用疫苗株以及国外参考毒株分为3个基因型。其中,第一个基因型为LX4型,包含了本研究中从我国不同地区收集的14株IBV毒株(BJ-0,BJ-2,BJ-3,BJ-4,BJ-5,333-4,333-5,333-6,333-7,333-8,333-9,333-10,DC07-1,DC07-2),其中BJ-0、BJ-2、BJ-3、BJ-4、BJ-5这5株的亲缘关系均高于99.8%,333-4,333-5,333-6,333-7,333-8,333-9,333-10,DC07-2的亲缘关系均高于99.3%,DC07-1与它们的亲缘关系较远,介于87.3～87.8%;第二个基因型为Mass型,包括本研究中的5株分离株333-1,333-2,333-3,M41,W93,我国常用IB疫苗株H52、H120和国外IBV分离株(西班牙、美国、韩国、日本等)。其中333-1,333-2,333-3这3株之间的亲缘关系均高于99.5%,W93与IBN株亲缘关系较近,M41与Spain-98-308的亲缘关系较近;第三个基因型为X型,本研究中的X株属于该型,且X株与Ark99的亲缘关系很近,同源性达97.8%。根据20株IBV毒株基因分型的结果,从S1基因的系统进化树中的三个基因群中分别选取差异性较大的6株IBV毒株,即X型的X株,Mass型中的M41、W93、333-3,LX4型中的DC07-1、333-7株,进行血清学分型试验。首先对其进行纯净性检验,测定每株IBV的鸡胚半数感染量(EID50),并免疫3周龄SPF鸡制备高免血清,进行血清交叉中和试验,计算IBV各毒株间的抗原性的相关系数(R)。结果表明,6株IBV毒株是纯净的,不含其它微生物,各毒株的EID50均高于106.0EID50/0.1mL。经免疫学方法计算,X型X株与Mass型的M41、W93、333-3的抗原性相关系数分别为:7%、14%、8%(<25%),与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数分别为6%、9%(<25%),说明X型的X株与Mass型的M41、W93、333-3,与LX4型的DC07-1、333-7分别属于不同的血清型,X株与它们之间的抗原交叉较低;Mass型的333-3与同型的M41、W93的抗原性相关系数分别为97%、98%(>80%),与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数分别为8%、13%(<25%),说明Mass型的333-3与同型的M41、W93属于同一个血清型,它们之间的抗原交叉较高,而与LX4型的DC07-1、333-7属于不同的血清型,它们之间的抗原交叉较低;Mass型的M41与同型的W93的抗原性相关系数为35%(>25%),与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数为7%、18%(<25%),说明Mass型的M41与同型的W93属于同一血清型,两者之间的抗原交叉较高,而与LX4型的DC07-1、333-7的抗原交叉较低,属于不同的血清型;Mass型的W93与LX4型的DC07-1、333-7的抗原性相关系数分别为13%、18%(

关键词：鸡传染性支气管炎病毒基因型血清型相关性

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鸡传染性支气管炎病毒纳米PCR和型特异性LAMP诊断技术的建立与初步应用

鸡传染性支气管炎病毒纳米PCR和型特异性LAMP诊断技术的建立与初...

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作者：张文广西大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(infections bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(infections bronchitis virus,IBV)引起的一种严重呼吸道接触性疾病。该病目前呈世界范围流行,主要侵害1-4周龄的幼鸡,是影响养禽业健康发展的重要疾病之一。疫苗... 详细信息

鸡传染性支气管炎(infections bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(infections bronchitis virus,IBV)引起的一种严重呼吸道接触性疾病。该病目前呈世界范围流行,主要侵害1-4周龄的幼鸡,是影响养禽业健康发展的重要疾病之一。疫苗免疫是防控IB的主要措施,目前虽已有多种弱毒活疫苗应用于鸡群,但免疫鸡群仍频繁发生IB,主要由于IBV基因组极易发生变异,导致新基因型甚至新血清型IBV不断出现,而不同基因型/血清型之间的交叉保护作用有限,因此常有免疫失败的现象发生,给本病的防控带来极大的困难,所以快速而准确地诊断病原IBV非常重要,且对IBV基因型的快速鉴别是有效防制该病的主要环节。鉴于此,非常有必要研发灵敏、特异、快速、简捷的IBV诊断技术和及时对IBV基因型进行鉴定。因此本研究进行了IBV纳米PCR检测方法和型特异性LAMP快速诊断技术的建立,并进行了初步的应用。首先,根据鸡IBV的3’端非编码区保守区域,设计并合成一对特异性引物,建立IBV纳米PCR检测方法,并进行了特异性、灵敏性和重复性试验,然后将建立的方法进行初步应用。结果表明,该方法特异性良好,仅能从IBV核酸样品中检测到约346 bp的目的条带,而对禽偏肺病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒、鸭肝炎病毒等其它病原检测结果均为阴性;敏感性试验表明,纳米PCR的最低检测浓度为1.01×10 ng/μL,其敏感性是普通PCR的10倍;重复三次检测提取的IBV核酸病毒,结果均一致。纳米PCR方法的临床应用表明,送检样品及攻毒鸡样品的检出率分别达到50%(10/20)和60%(30/50),与普通PCR方法检测结果符合率为100%。本研究建立的IBV纳米PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性,该方法为IBV的临床诊断、病原检测和流行病学调查提供了新的技术手段。其次,本研究根据Gen Bank中登录的IBV Mass型毒株与4/91型毒株的S1基因序列,分别设计了一套Mass型和4/91型特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,优化其LAMP反应体系及反应条件后,分别建立了Mass型和4/91型特异性LAMP诊断方法,并进行了特异性、灵敏性和重复性试验,然后将建立的方法进行初步应用。结果表明,Mass型和4/91型特异性LAMP诊断方法均能在60 min完成相应基因型IBV的扩增,并与其它基因型IBV、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、马立克氏病病毒、禽白血病病毒无交叉反应;敏感性试验表明,Mass型特异性LAMP诊断方法最低检测浓度为1×10 ng/μL,比普通PCR灵敏度高100倍,4/91型特异性LAMP诊断方法最低检测浓度为9×10 ng/μL,比普通PCR灵敏度高10倍;重复三次检测提取的IBV核酸,结果均一致。用建立的IBV型特异性LAMP诊断方法对本课题组保存的20株IBV进行检测,结果显示其中5份为4/91型,6份为Mass型,与前期本课题组对这些毒株的S1基因分析结果一致。本研究成功首次建立了特异性和敏感性良好的IBV纳米PCR检测方法,为IBV的临床诊断、检测和流行病学调查提供了新的技术手段;同时本研究成功建立了特异、灵敏、快速、简便的IBV Mass型和4/91型特异性LAMP诊断方法,对实施有效的疾病控制、病原研究、流行病学调查等方面都具有重要意义,且该方法成本低、操作简单,不需特殊设备,值得在养殖场和基层业务部门推广应用。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒纳米PCR 环介导等温扩增特异性敏感性

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鸡传染性支气管炎病毒BD株生物学特性鉴定及RT-PCR检测方法的建立

鸡传染性支气管炎病毒BD株生物学特性鉴定及RT-PCR检测方法的建立

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作者：靳芹河北农业大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是由冠状病毒科（Coronaviridae）鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。此病多发于幼年鸡,病鸡的特征性临床症状为... 详细信息

鸡传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis,IB）是由冠状病毒科（Coronaviridae）鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。此病多发于幼年鸡,病鸡的特征性临床症状为咳嗽、喷嚏、气管啰音,蛋鸡产蛋量及蛋品质下降,对鸡的肾脏和生殖系统还可造成一定的损害。IB在世界范围内分布,虽然已广泛应用疫苗,但由于各血清型的分离毒不断出现,其发生仍然十分普遍,给养殖业造成严重的经济损失。目前,我国IB的发生已经遍布全国大部分省、市和自治区,给养鸡业造成了巨大的损害。本研究主要是从河北保定地区某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病鸡病料中分离到一株病毒,命名为BD株,并对其生物学特性进行鉴定,进而建立起一套快速准确地临床检测方法。无菌采集疑似鸡传染性支气管炎病料,将病变明显的肾脏、器官、肺脏制成病毒液,按照常规实验方法经9～11日龄SPF鸡胚传代,鸡胚在接种后2～9天内出现卷曲、侏儒胚等IBV致鸡胚特征性病变。在电镜下可以见到典型的冠状病毒粒子,未见到其他病毒粒子。所见病毒粒子呈圆形,有稀疏排列的纤突。未经胰酶处理的尿囊液对SPF鸡红细胞没有凝集作用。攻毒后,BD株接种鸡仅在1～2d出现轻微的临床症状,表现为病鸡呼吸困难、羽毛松乱、精神沉郁。攻毒后第4d,部分接毒鸡开始死亡,死亡时间在5～11天不等。多数病鸡剖检后,肉眼可见到器官出血、水肿、盲肠扁桃体等器官出血。所有死亡鸡均表现肾脏肿大、苍白,肾脏和输尿管内有白色的尿酸盐沉积,呈典型的“花斑肾”。随着病程延长,肾脏肿大更加明显。将病毒液进一步经致鸡胚矮小化试验、新城疫干扰试验,试验结果都符合IBV生物学特性。以分离病毒的cDNA为模板,通过RT-PCR技术扩增出M基因405bp长的片段,从核酸水平证实了所分离的病毒为IBV。以上鉴定结果表明从该鸡场分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。本试验对BD株进行了理化特性的研究,该病毒经氯仿和乙醚作用后EID50发生明显的变化,表明BD株对二者敏感;耐热性试验表明BD株对热敏感,但二价镁离子可提高此病毒对热的耐受性;酸碱敏感试验表明BD株对PH3.0与PH12.0的酸碱环境均有一定的抵抗力。经双向琼脂扩散试验,兔抗鸡胚毒血清琼扩滴度为1:64;通过半数鸡胚感染量的交叉中和试验鉴定分离株的血清型,结果BD株与M41标准毒株有一定交叉反应,中和试验R值为67%,表明BD株病毒与M41标准毒株为同一血清型不同亚型。根据GenBank已发表的30株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）M基因序列,设计一对引物,扩增出405bp特异性核酸片段,建立了检测IBV的RT-PCR方法。特异性试验结果表明,IBV M41标准株和BD株均能扩增出405bp的核酸片段,而新城疫病毒（NDV）、鸭肝炎病毒（DHV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、正常鸡胚尿囊液无特异性条带出现。敏感性试验结果表明,该方法的最低检出限量为5×10-3EID50的模板。表明本试验所建立的RT-PCR方法具有敏感性高、特异性强的特点。利用建立的RT-PCR方法对从河北省分离的12份临床上疑似的鸡IBV进行检测,结果阳性检出率为83.3%。该方法的建立为IBV的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒鉴定生物学特性 RT-PCR检测方法建立

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鸡传染性支气管炎病毒广西分离株血清型的鉴定及免疫原性的研究

鸡传染性支气管炎病毒广西分离株血清型的鉴定及免疫原性的研究

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作者：孙蓉广西大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的一种高度接触性、急性传染病。IBV血清型众多,不同血清型之间的交叉保护效果存在着差异,以致生产上往往因为使用的疫苗株... 详细信息

鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的一种高度接触性、急性传染病。IBV血清型众多,不同血清型之间的交叉保护效果存在着差异,以致生产上往往因为使用的疫苗株与现地流行毒株血清型不一致而导致免疫失败,给世界各地养禽业带来极大的经济损失。因此,及时鉴定本地IBV流行毒株的血清型,筛选理想毒株作为研制适合本地使用的疫苗之候选种毒,并对其免疫原性和交叉免疫保护性进行研究将是一项重要且非常有意义的工作。首先,在本课题已完成对1985～2008年26个广西IBV分离株进行血清分型并将其分为7个血清型的基础上,从中选择代表6个不同血清型的单因子血清对2009～2011年间的20个广西IBV分离株进行鸡胚气管环中和试验并鉴定血清型。结果表明,20个新分离毒株归属6个血清型：分离株GX-YL0902、GX-NN1009、 GX-NN1013、 GX-YL1019、 GX-NN110034、GX-NN-4共6个毒株归为血清1型；分离株GX-NN1012、 GX-GL2、 GD-KP1033、 GX-NN-14共4个毒株归为血清2型；分离株GX-NN1014、 GX-NN1011、 GX-NN09093、 GX-NN110033、 GX-NN-11共5个毒株归为血清3型；分离株GX-GL1为血清4型；分离株GX-HC1006和GX-NN09032归为血清5型；分离株GX-YL1121与GX-NN-13归为血清6型。第二,在之前研究的基础之上,选择了致病力强、代表不同基因型和血清型的4个IBV广西分离株GX-YL5、 GX-YL9、 GX-NN7和GX-C与目前生产上广泛使用的商品疫苗株H120一起,按照国家IBV灭活联苗中免疫效力试验的规程进行免疫原性和交叉免疫保护性试验。所有试验鸡在14日龄时皮下接种各个毒株制备的单价灭活油乳剂疫苗(OEV),在免疫后21d使用各个毒株经过滴鼻点眼的途径进行攻毒。以攻毒后各疫苗免疫组鸡只的临床发病率、死亡率、抗体水平的动态变化以及在呼吸系统(气管、肺脏)和泌尿系统(肾脏)的病毒重新分离结果,作为评价交叉免疫保护力的指标。结果显示,灭活油乳剂疫苗免疫组采用IBV强毒攻毒后引起鸡只出现轻微的临床症状,发病率为0-10%,死亡率为0-20%,各组间差异不显著(p>0.05)；非免疫攻毒对照组出现比较严重的临床症状,发病率为40%-70%,死亡率为20%-40%,与同一毒株免疫组相比存在极显著差异(p<0.01)或显著差异(p<0.05)；采用间接ELISA方法对5组试验鸡免疫前、免疫后7d、14d、21d的血清样品进行检测,结果显示疫苗免疫后7d即可产生抗体,除GX-NN7疫苗免疫组抗体水平表现出随时间变化略有下降外,其余免疫组抗体水平均具有随时间变化呈直线上升的趋势。至免疫后21d,免疫组鸡的血清样品80%呈抗体阳性。而非免疫对照组抗体水平始终为阴性；攻毒后5d采集的气管、肺脏和肾脏样品混合进行病毒重新分离的结果显示,免疫组样品病毒检出率为0-40%,保护率为60%-100%,各组间交叉保护力差异不显著(p>0.05),极显著高于非免疫攻毒对照组(p<0.01)。H120灭活疫苗免疫组对4个分离株GX-C、 GX-NN7、GH-YL5、GX-YL9组织样品病毒的检出率分别为10%、20%、30%、30%,表明目前常用的商品疫苗株不能对当地流行毒株提供完全的保护；其余4种灭活油乳剂疫苗能对同源或者异源强毒株的攻击提供比较高的保护率(60%-100%),其中GX-YL9的OEV对GX-YL9、 GX-C、 GX-NN7、 GX-YL5的保护率分别为100%、90%、70%、100%,免疫原性最好,可作为研制防制本地IBV的商品疫苗的候选种毒。本课题研究结果表明,广西IBV流行毒株血清型复杂,商品疫苗株H120不能对流行毒株产生完全保护作用,筛选免疫原性好的分离毒株作为研制IBV多价灭活疫苗的候选种毒是防控IBV的一种有效策略。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒血清型免疫原性交叉免疫保护疫苗候选毒株

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鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株的鉴定与M、N基因的遗传变异分析

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作者：吴此玲西北农林科技大学

学位级别：硕士

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统及... 详细信息

鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性的呼吸道疾病,给世界养禽业造成了巨大的经济损失。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异对IB的免疫防控造成了很大的困难,而且引起的疫苗免疫失败的现象越来越多。许多学者认为大量变异株的出现与活毒疫苗的应用有关,但目前我国IBV地方流行株的基因序列还不够完备,分子生物学方面有待更深入研究。因此,对地方分离株的分离鉴定及遗传变异的研究显得尤为重要。本研究从陕西分离到的两毒株进行了M、N基因的克隆及遗传变异分析。主要获得以下结果: 1.从临床疑似鸡传染性支气管炎疾病的发病鸡群中先后分离到2株病毒,经过接种鸡胚、血凝试验、鸡胚矮小试验及动物回归试验,通过鉴定,2毒株均为鸡传染性支气管炎病毒,而且具有很强的嗜肾性和致病力。 2.参照GenBank中收录的IBV M基因序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV SX-H09株和SX-W09株的M基因,扩增产物克隆测序后,测序结果与H52、W118、Ark99等参考毒株进行序列分析。结果表明,SX-H09株M基因全长678 bp,编码225个氨基酸,而SX-W09株M基因全长670 bp,编码222个氨基酸,两毒株与参考毒株的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为86.5%～99.6%和84.5%～99.6%。两毒株都存在碱基的突变、插入和缺失。遗传进化树显示SX-H09株与DY07株亲缘关系较近,SX-W09株与其他毒株亲缘关系均较远。 3.用RT-PCR方法扩增IBV SX-W09株的N基因并测序,与GenBank所收录IBV毒株的N基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,建立N基因系统发育进化树。结果表明, SX-W09株N基因全长1230 bp,编码一条由409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与Ark99、H120、Gray等毒株的相似性为86.5%～89.9%,氨基酸相似性为89.0%～94.1%。SX-W09株存在碱基的突变。SX-W09株与Ark99、H120、Gray等其他参考毒株的亲缘关系均较远。 4.将IBV SX-W09株N基因PCR产物经BamHⅠ和HindⅢ双酶切克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达载体,转化BL21(DE3),经IPTG诱导后纯化蛋白,用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测制备的抗体。结果表明,成功构建原核表达载体,ELISA检测多克隆抗体效价为1:12800,Western blot检测具有良好的反应性,可以特异性识别IBV N蛋白。本研究分离鉴定了2株IBV陕西地方流行毒株,通过对毒株M、N基因核苷酸序列分析、遗传进化关系分析以及N蛋白在原核系统的高效表达,为IBV的防治提供参考。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒 M基因 N基因原核表达

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