检索结果-内蒙古大学图书馆

西南农业学报 2023年第2期36卷 419-426页

作者：廖健淇谢芝勋张民秀张艳芳罗思思李孟谢志勤谢丽基邓显文范晴曾婷婷黄娇玲王盛广西大学动物科学技术学院南宁530004 广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)—东盟跨境动物疫病防控重点实验室南宁530001

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和p... 详细信息

【目的】原核表达鸡细小病毒(ChPV)的NS1和VP2蛋白,制备其多克隆抗体,为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立血清学诊断方法提供物质基础。【方法】通过合成ChPV GX-Ch-PV-21毒株的NS1和VP2蛋白基因序列,构建原核重组表达载体pET-32a-NS1和pET-32a-VP2,将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌transsetta感受态细胞进行原核表达,优化表达条件,以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和免疫印迹(Western-blotting)方法鉴定NS1和VP2蛋白的表达情况。将表达产物免疫无特定病原体(SPF)鸡获得多克隆抗体,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法测定其效价,以Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对多克隆抗体进行鉴定。【结果】SDS-PAGE分析显示,NS1和VP2蛋白条带大小分别约为104和87 kD,与预期条带大小相符。对重组质粒pET-32a-VP2和pET-32a-NS1进行最佳诱导条件筛选,结果显示NS1蛋白表达的最佳诱导条件为异丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)终浓度1.0 mmol/mL,16℃诱导表达过夜;VP2蛋白表达的最佳诱导条件为IPTG终浓度0.8 mmol/mL,20℃诱导表达过夜。可溶性分析显示,NS1和VP2蛋白主要以包涵体形式存在;间接ELISA检测NS1和VP2蛋白的多克隆抗体效价均为1∶10 240 000;Western-blotting鉴定表明,His标签蛋白和相对应的鸡多克隆抗体均能与NS1和VP2蛋白特异性结合;IFA分析显示,VP2和NS1蛋白多克隆抗体均能与ChPV特异性结合。【结论】本研究成功表达ChPV的NS1和VP2蛋白和制备的鸡多克隆抗体,可作为深入探究ChPV蛋白结构功能及建立ChPV血清学诊断方法的基础材料。

关键词：鸡细小病毒原核表达 NS1蛋白 VP2蛋白多克隆抗体

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鸡细小病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

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动物医学进展 2023年第4期44卷 25-30页

作者：张艳芳谢芝勋谢志勤张民秀曾婷婷邓显文谢丽基罗思思黄娇玲李孟广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室南宁530001

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列,筛选了特异性探针引物组,采用不同探针引物浓度组合和退火温度... 详细信息

旨在建立一种可定量检测鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)的微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)新型检测方法。引物设计参考了GenBank中ChPV的NS基因保守序列,筛选了特异性探针引物组,采用不同探针引物浓度组合和退火温度梯度对反应条件进行优化,并通过使用该方法与荧光定量PCR(qPCR)和普通PCR方法进行灵敏度比较,同时对其他常见禽病病原体进行检测,以及对40份临床样品进行检测,评估了该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最佳引物浓度均为900 nmol/L,最佳探针浓度为600 nmol/L;最佳退火温度为54.0℃;灵敏度比qPCR和普通PCR分别高10倍和1000倍,最低检测限为4.5 copies/μL;对其他常见禽病病原体进行ChPV微滴式数字PCR检测,结果均为阴性;批内和批间重复性较好,变异系数小。结果表明,所建立的ddPCR方法具有更高的敏感性和准确性,可成功用于快速定量检测ChPV感染。

关键词：鸡细小病毒微滴式数字PCR 敏感性特异性

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鸡细小病毒研究进展

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黑龙江畜牧兽医 2019年第23期 30-32,36页

作者：于天飞孙婉姝谢鹏宇尹海畅黎明于志丹齐齐哈尔大学生命科学与农林学院黑龙江齐齐哈尔161006 黑龙江省抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室黑龙江齐齐哈尔161006 齐齐哈尔大学计算机与控制工程学院黑龙江齐齐哈尔161006

鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)发现于20世纪80年代早期,普遍存在于患有发育障碍与矮小综合征(Runting stunting syndrome,RSS)病鸡的肠道内。RSS以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、饲料消耗增加为主要特征,给养鸡业造... 详细信息

鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)发现于20世纪80年代早期,普遍存在于患有发育障碍与矮小综合征(Runting stunting syndrome,RSS)病鸡的肠道内。RSS以腹泻、精神沉郁、体温调节障碍、生长迟缓、饲料消耗增加为主要特征,给养鸡业造成较大的经济损失。用于ChPV检测的方法包括PCR、real-time PCR、ELISA、高通量测序技术等,目前还没有可用于防治ChPV的特效疫苗和药物。文章综述了目前关于ChPV在分子生物学、流行病学、发病机制和诊断方法方面的最新研究进展,以期为我国ChPV相关方面的研究提供借鉴。

关键词：鸡细小病毒鸡发育障碍与矮小综合征分子生物学流行病学发病机制诊断方法

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一例鸡细小病毒、鸡传染性贫血病毒及鸡传染性支气管炎病毒共感染病例的检测

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福建农业学报 2021年第9期36卷 1033-1041页

作者：张龙林裕胜江锦秀张靖鹏黄潇航胡奇林福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 福建农林大学动物科学学院福建福州350002

【目的】对福建省南平市某肉鸡场不明病因造成肉鸡死亡的病原进行确诊。【方法】通过对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、腺病毒(Fowl adenovirus, FadV)、鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)、新城疫病毒(Ne... 详细信息

【目的】对福建省南平市某肉鸡场不明病因造成肉鸡死亡的病原进行确诊。【方法】通过对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)、腺病毒(Fowl adenovirus, FadV)、鸡细小病毒(Chicken parvovirus,ChPV)、新城疫病毒(Newcastlediseasevirus, NDV)、鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectiousanemiavirus,CIAV)、传染性法氏囊病毒(InfectiousbursalDiseasevirus, IBDV)、喉气管炎病毒(Laryngotracheitisvirus,LTV)、禽肾炎病毒(Avian nephritis virus,ANV)等病原进行PCR检测,并对扩增片段进行克隆测序,利用生物信息学软件对测序结果进行分析。【结果】PCR检测结果及测序结果显示:鸡细小病毒ChPV、鸡传染性支气管炎病毒IBV、鸡传染性贫血病病毒CIAV为阳性,其余病原检测结果均为阴性。同源性分析结果显示分离株与ChPV的同源性为92.17%~100%,与IBV的同源性为76.9%~84.3%,与CIAV的同源性为91.19%~92.14%;遗传进化树分析结果显示分离到的IBV毒株及CIAV毒株均独处于一个单独的分支,分离到的ChPV毒株与广西参考株亲缘关系较近。【结论】从南平市某鸡场检测到ChPV、IBV、CIAV等3种病原的共感染病例,分离到的IBV毒株的S1基因及CIAV毒株的VP1基因可能已经发生变异。

关键词：鸡传染性贫血病毒传染性支气管炎病毒鸡细小病毒共感染

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2株鸡细小病毒全基因组序列测定与分析

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中国兽医杂志 2020年第9期56卷 15-19,I0002页

作者：高倩文王君娜张宇名尹燕博徐守振青岛农业大学动物医学院山东青岛266109

为了解近年来鸡细小病毒(ChPV)流行毒株的全基因组基因特征和分子进化规律,本研究对2018年从山东潍坊和河南濮阳肠炎综合征病例中检测到的2株ChPV-SDWF和ChPV-HNPY进行了基因组克隆和序列测定。应用MEGA 5.02、SimPlot 3.5.1、Phyre 2... 详细信息

为了解近年来鸡细小病毒(ChPV)流行毒株的全基因组基因特征和分子进化规律,本研究对2018年从山东潍坊和河南濮阳肠炎综合征病例中检测到的2株ChPV-SDWF和ChPV-HNPY进行了基因组克隆和序列测定。应用MEGA 5.02、SimPlot 3.5.1、Phyre 2等生物信息学软件对基因结构、遗传变异、重组情况及VP2蛋白3D结构进行了分析。结果显示,2株分离株基因组序列长度均为4615 bp,核苷酸同源性为96.9%;ChPV-SDWF株和ChPV-HNPY株与不同参考株的核苷酸同源性分别为80.6%~95.7%、80.1%~95.4%。2株分离株与美国火鸡细小病毒参考株TuPV-260株和匈牙利ChPV参考株ChPV-ABU-P1亲缘关系较近,属于同一个分支。分离株没有出现重组现象,核苷酸同源性由高到低依次为NS1基因、VP1基因、VP2基因。VP2蛋白3D结构含有8条反向平行的β折叠围成的桶,表面存在4个Loop,其中Loop3和Loop4变异最大。本研究可进一步了解我国ChPV的基因特征和遗传变异情况,为ChPV的监测及防控提供理论依据。

关键词：鸡细小病毒基因组遗传进化

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鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒三重PCR检测方法的建立及应用

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南方农业学报 2019年第11期50卷 2576-2582页

作者：奉彬谢芝勋邓显文张艳芳谢丽基谢志勤范晴曾婷婷罗思思黄娇玲广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、C... 详细信息

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix TaqTM 12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。

关键词：鸡新城疫病毒鸡细小病毒禽流感病毒三重PCR 特异性敏感性

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鸡传染性贫血病毒与鸡细小病毒双重PCR检测方法的建立

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中国兽医杂志 2021年第4期57卷 21-24页

作者：张艳芳谢芝勋邓显文谢志勤张民秀罗思思谢丽基范晴曾婷婷黄娇玲王盛刘加波广西壮族自治区兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室广西南宁530001

为研究一种可同时检测鸡传染性贫血病毒(CIAV)和鸡细小病毒(ChPV)的双重PCR方法,本试验根据GenBank中CIAV的VP基因和ChPV的NS1基因的保守序列,设计筛选了扩增片段大小分别为219 bp和384 bp的特异性引物,通过对反应条件的优化,特异性和... 详细信息

为研究一种可同时检测鸡传染性贫血病毒(CIAV)和鸡细小病毒(ChPV)的双重PCR方法,本试验根据GenBank中CIAV的VP基因和ChPV的NS1基因的保守序列,设计筛选了扩增片段大小分别为219 bp和384 bp的特异性引物,通过对反应条件的优化,特异性和敏感性试验,建立和评价双重PCR检测方法。结果显示,该方法最佳引物比例为CIAV上下游引物各0.4μL(20μmol/L),ChPV上下游引物各0.6μL(20μmol/L);最佳退火温度为56.1℃;灵敏度可达到66 fg(CIAV)和78 fg(ChPV);对常见鸡病病原体进行检测,结果全为阴性。结果表明,本试验所建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速、稳定等优点和优势,可用于同时快速鉴别诊断CIAV和ChPV的混合感染。

关键词：鸡传染性贫血病毒鸡细小病毒多重PCR

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鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重PCR检测方法的建立

鸡细小病毒和鸡新城疫病毒二重PCR检测方法的建立

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作者：谢芝勋奉彬邓显文张艳芳谢丽基谢志勤范晴曾婷婷罗思思黄娇玲王盛刘加波

鸡细小病毒(ChPV)是引起鸡肠道病毒最重要的病原体之一，可导致鸡群出现急性或慢性肠道性疾病，如矮小综合症和营养不良征。新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种急性烈性传染病。当鸡群感染NDV时，常出现高热、黏膜出血、呼吸... 详细信息

鸡细小病毒(ChPV)是引起鸡肠道病毒最重要的病原体之一，可导致鸡群出现急性或慢性肠道性疾病，如矮小综合症和营养不良征。新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种急性烈性传染病。当鸡群感染NDV时，常出现高热、黏膜出血、呼吸困难及下痢等症状，发病急，病情重，且引起较高的病死率。ND是中国大型养鸡场中的主要疾病之一，被列入中国的一类动物疫病。ChPV和NDV临床上呈现出混合感染，给临床诊断带来困难。常规的检测方法难以同时对它们进行快速检测和鉴别诊断，不能对这些疾病进行有效的防制，严重地制约了现代养禽业的发展。鉴定病毒的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验和ELISA等，但是这些方法通常具有耗时费力且敏感性不高等弊端，相反PCR方法则具有操作简单快速、特异性强、敏感性高、重复性好等特点。临床检测中经常会出现多种的病原体混合感染的情况，因此，急切需要一种低成本、高效率的检测手段对批量临床进行快速的检测鉴别。该试验建立的二重PCR技术能够对ChPV和NDV两种家禽肠道传染病病原进行快速的鉴别诊断，与常规的检测技术相比，极大地缩短了检测时间，节省了大量的人力物力等资源，有利于此类疫病的预防、控制和扑灭。二重(或多重)PCR方法利用两对(或多对)引物同时扩增两个(或多个)模板，弥补了常规PCR的不足。但是，二重(或多重)PCR的同一体系中存在引物对和多种模板，扩增反应中引物对之间、不同模板之间、引物对与模板之间都可能存在竞争性抑制。因此，试验中应该对各种条件分别进行优化，避免引物对和模板之间的非特异性结合，防止出现非特性扩增，同时要尽可能的避免引物二聚体的产生。此外，扩增的目的片段需要有合适的退火梯度，使得各引物对退火条件尽可能保持一致，以保证其扩增产物量的相对平衡。该试验通过设计合成了ChPV和NDV的特异性引物，成功扩增出453bP和687bP目的片段。每对引物都具有很强的扩增效率和特异性。ChPV和NDV双重PCR检测方法可同时检测样品中ChPV和NDV核酸，对了解鸡群感染ChPV和NDV后的排毒状况十分重要，也利于临床上ChPV和NDV流行病学的调查。在鉴定双重PCR的敏感性时，将双重PCR与单项PCR的核酸最低检测限进行对比，前者与后者相比，相应降低了10～100个数量级，但是仍高度敏感(ChPV和NDV核酸的最低检测限分别为2.5Pg和6.4Pg)，满足当代动物疫病检测的要求。为了降低临床样品出现假阴性的概率，建议临床样品及时处理，且样品运输和保存时要低温条件。对ChPV和NDV混合感染的临床病料的检测结果与各病毒单项PCR检测结果相符。结果显示，广西鸡群存在ChPV和NDV的混合感染，因此在鸡场养殖中要注意防控ChPV和NDV的混合感染。ChPV和NDV双重PCR能够在一份样品中同时检测出ChPV和NDV，该方法对ChPV和NDV引起的混合感染的诊断具有广阔的应用前景。

关键词：鸡细小病毒鸡新城疫病毒诊断方法

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鸡细小病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR检测方法的建立

鸡细小病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR检测方法的建立

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作者：谢芝勋奉彬邓显文张艳芳谢丽基谢志勤范晴曾婷婷罗思思黄娇玲王盛刘加波

鸡细小病毒(ChPV)是引起鸡肠道病毒最重要的病原体之一，可导致鸡群出现急性或慢性肠道性疾病，如矮小综合症和营养不良征。禽流感(AI)又称为欧洲鸡瘟，是由A型流感病毒引起的禽类传染病综合症，其病程初始表现为突然发病且无明显临床... 详细信息

鸡细小病毒(ChPV)是引起鸡肠道病毒最重要的病原体之一，可导致鸡群出现急性或慢性肠道性疾病，如矮小综合症和营养不良征。禽流感(AI)又称为欧洲鸡瘟，是由A型流感病毒引起的禽类传染病综合症，其病程初始表现为突然发病且无明显临床症状，病程稍长则有明显的神经系统、消化道系统、呼吸道系统和生殖道系统等症状，伴随采食量减少、产蛋量下降，且易感染并发其他疾病，给养鸡产业带来重大经济损失。新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种急性烈性传染病。当鸡群感染NDV时，常出现高热、黏膜出血、呼吸困难及下痢等症状，发病急，病情重，且引起较高的病死率。ND是中国大型养鸡场中的主要疾病之一，被列入中国的一类动物疫病。因NDV、ChPV和AIV引起的疾病给中国养禽业带来极大经济损失，因此，亟待建立一种能同步检测NDV、ChPV和AIV的诊断方法，为临床病原监测及防控提供技术支持。鉴定病毒的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验和ELISA等，但是这些方法通常具有耗时费力且敏感性不高等弊端，相反PCR方法则具有操作简单快速、特异性强、敏感性高、重复性好等特点。临床检测中经常会出现多种的病原体混合感染的情况，因此，急切需要一种低成本、高效率的检测手段对批量临床进行快速的检测鉴别。二重及二重以上的多重PCR主要用于鉴定某些病原微生物或同时检测多种病原体，在临床应用中具有高效性、系统性和经济简便性等特点，未见针对ChPV、AIV和NDV三重PCR检测方法的建立。该研究通过设计合成NDV、ChPV和AIV的特异性引物，成功扩增出NDV(453 bP)、ChPV(687 bP)和AIV(239 bP)的特异性目的片段，表明每对引物都具有很强的扩增效率和特异性。NDV、ChPV和AIV三重PCR检测方法可同时检测样品中的NDV、ChPV和AIV核酸，对掌握鸡群感染NDV、ChPV和AIV后的排毒状况十分重要，也有利于临床上NDV、ChPV和AIV流行病学的调查。在检验三重PCR的敏感性时，将三重PCR与常规PCR的最低检测下限进行对比，发现前者与后者相比相应降低1×10²～1×10³个数量级，但仍然高度敏感(NDV、ChPV、AIV核酸的最低检测下限分别为2.5Pg、6.4Pg和2.0Pg)，能满足临床上动物疫病检测的要求。应用建立的NDV、ChPV和AIV三重PCR检测方法对临床样品进行检测，并与常规PCR进行比较，结果发现三重PCR检测方法的检测结果与常规PCR检测结果一致，有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品，其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品，1份ChPV和NDV均呈阳性的样品，表明建立的NDV、ChPV与AIV三重PCR检测方法在混合感染病例的鉴别诊断方面具有广阔的应用前景，同时说明广西鸡群已存在NDV、ChPV与AIV混合感染的现象，各养鸡场应给予重视并加强防控。

关键词：鸡细小病毒禽流感病毒新城疫病毒检测方法

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一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组及其应用

一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组及其应用

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作者：谢芝勋奉彬邓显文张艳芳黄娇玲王盛范晴谢志勤黄莉谢丽基曾婷婷罗思思刘加波

鸡的肠道类疾病严重危害养鸡业的发展，由ChPV和ARV引起鸡肠道传染病较为常见，临床症状较相似，且在临床上呈现出混合感染，给临床诊断带来困难。常规的检测方法难以同时对它们进行快速检测和鉴别诊断，不能对这些疾病进行有效的防制... 详细信息

鸡的肠道类疾病严重危害养鸡业的发展，由ChPV和ARV引起鸡肠道传染病较为常见，临床症状较相似，且在临床上呈现出混合感染，给临床诊断带来困难。常规的检测方法难以同时对它们进行快速检测和鉴别诊断，不能对这些疾病进行有效的防制，严重地制约了现代养禽业的发展。鉴定病毒的方法主要依靠传统的病毒分离、琼脂扩散试验和ELISA等，但是这些方法通常具有耗时费力且敏感性不高等弊端，相反PCR方法则具有操作简单快速、特异性强、敏感性高、重复性好等特点。临床检测中经常会出现多种的病原体混合感染的情况，因此，急切需要一种低成本、高效率的检测手段对批量临床进行快速的检测鉴别。该试验建立的二重PCR技术能够对ChPV和ARV两种家禽肠道传染病病原进行快速的鉴别诊断，与常规的检测技术相比，极大地缩短了检测时间，节省了大量的人力物力等资源，有利于此类疫病的预防、控制和扑灭。二重(或多重)PCR方法利用两对(或多对)引物同时扩增两个(或多个)模板，弥补了常规PCR的不足。但是，二重(或多重)PCR的同一体系中存在引物对和多种模板，扩增反应中引物对之间、不同模板之间、引物对与模板之间都可能存在竞争性抑制。因此，试验中应该对各种条件分别进行优化，避免引物对和模板之间的非特异性结合，防止出现非特性扩增，同时要尽可能的避免引物二聚体的产生。此外，扩增的目的片段需要有合适的退火梯度，使得各引物对退火条件尽可能保持一致，以保证其扩增产物量的相对平衡。该试验针对ChPV NS1基因和ARVσC基因保守序列设计引物，扩增出2段特异性片段，长度分别为204 bP和405 bP，目的片段之间具有明显的长度差异(>100 bP)，在同一体系中便于鉴别，且每一对引物的扩增效率高、特异性强。该试验建立的方法能够检测到样本中ChPV和ARV核酸，因此，可用于监控鸡群感染ChPV和ARV后的排毒情况及临床上ChPV和ARV流行病学的监测。核酸质量的好坏是直接影响PCR灵敏度的另一重要因素。在临床检测中往往以粪便(棉拭子)为样品，但是由于粪便中含有多种抑制PCR反应因子，因此建议使用商品化的核酸提取试剂盒以获得较好质量的核酸。此外，为了减少样品的假阴性，采样后应对样品尽快进行处理，且将样品置于低温条件下运输、保存。该试验根据ChPV和ARV的保守基因序列，设计合成用于检测ChPV和ARV的两对特异性引物，同时鉴别出两种病毒，其优化后的反应体系为：2×PCR mix 12.5μL，其中ChPV上、下游引物各1.0μL，ARV上、下游引物各1.0μL，混合模板ChPV和ARV各1.0μL共2.0μL，DDH₂O补足至25.0μL;最佳的反应程序为：95℃5 miN;95℃1 miN;56.1℃1 miN，72℃1 miN，共35个循环;最后72℃延伸10 miN。退火温度优化过程中，在50.0℃～60.0℃均能成功扩增出特异性目的片段，表明优化的ChPV和ARV二重PCR能够确保一定温度范围内扩增效率的相对平衡。特异性试验和敏感性试验表明，该ChPV和ARV二重PCR能够成功扩增出ChPV和ARV的特异性片段，相反，对AIV-H9、NDV、MDV、IBV、AILTV等不敏感，具有良好的特异性;该ChPV和ARV二重PCR能同时检出58 fg的ChPV和53 fg的ARV核酸模板，敏感性较高，能够在临床上满足ChPV和ARV的混合感染检测的要求。该研究用建立的二重ChPV和ARV PCR方法对来自广西壮族自治区内的50份病料进行检测，采用一步法扩增对临床病料进行了二重PCR检测对比，结果两者的符合率为94%以上。该方法可以在一份样品中同时检测出两种病原体，符合临床上对多种疾病的同步诊断的要求，对于这两种疫病的鉴别诊断和混合感染检测具有重要的临床应用价值。

关键词：鸡细小病毒禽呼肠孤病毒肠道类疾病

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