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主题

1 篇 e2转化
1 篇 偶联机制
1 篇 hrms
1 篇 trametes hirsuta...
1 篇 漆酶
1 篇 13c-稳定同位素

机构

1 篇 安徽农业大学

作者

1 篇 刘庆竹
1 篇 司友斌
1 篇 孙凯

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1 篇 中文

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一株高产漆酶真菌Trametes hirsuta La-7的筛选及其在17β-雌二醇转化中的应用

一株高产漆酶真菌Trametes hirsuta La-7的筛选及其在17β-雌二醇...

引用

2019年中国土壤学会土壤环境专业委员会、土壤化学专业委员会联合学术研讨会

作者：孙凯刘庆竹司友斌安徽农业大学资源与环境学院农田生态保育与污染防控安徽省重点实验室

畜禽粪便中雌激素经过农田地表径流释放到水生态系统,能够加剧环境中雌激素的污染风险。雌激素进入水生生物体内,可以通过模拟、干扰或对抗机体内激素的正常合成、转运和释放,导致有机体的内分泌系统失衡和紊乱,进而引发水生物种雌性化... 详细信息

畜禽粪便中雌激素经过农田地表径流释放到水生态系统,能够加剧环境中雌激素的污染风险。雌激素进入水生生物体内,可以通过模拟、干扰或对抗机体内激素的正常合成、转运和释放,导致有机体的内分泌系统失衡和紊乱,进而引发水生物种雌性化。真菌漆酶是一类胞外含铜多酚氧化酶,其可以利用水中溶解氧作为电子接受体,催化雌激素的单电子氧化偶联反应生成聚合产物,从而降低雌激素的生物可利用性和生态毒性。能否从畜禽粪便污染土壤中分离筛选出高产漆酶真菌,通过大规模发酵培养获得粗漆酶,并利用其解决水生环境中雌激素风险隐患?本文采用传统微生物培养方法,分别以愈创木酚和单宁酸作为漆酶指示剂,从受畜禽粪便污染的表层土壤中分离筛选出一株高产漆酶真菌;研究pH、温度、碳源、氮源和cu～（2+）浓度等因素对该菌株产漆酶能力的影响,优化其发酵培养工艺参数;通过盐析、透析浓缩和葡聚糖G-100层析柱分离纯化粗漆酶液,探讨纯化后的漆酶对17β-雌二醇（E2）转化的影响;利用高分辨质谱（HRMS）结合～（13）c-稳定同位素比值,揭示漆酶介导E2转化的产物分布和作用机理。研究结果有望形成一整套利用真菌漆酶规避水体中雌激素污染的技术体系,为准确评估环境雌激素污染风险、指导农业安全生产和保障人群健康等提供理论依据和技术指导。从安徽省安庆市受畜禽粪便污染的表层土壤中共筛选出15株产漆酶真菌,其中菌株La-7分别在含有0.05%愈创木酚和0.5%单宁酸的固体平板上出现明显红褐色和褐色显色圈,表明菌株La-7具有高产漆酶特性。菌株La-7菌落呈白色,圆形,表面干燥,有丝状体和孢子,营养菌丝嵌入培养基中,不易挑起。将菌株La7的r DNA-ITS序列在GenBank数据库中进行比对,结果表明菌株La-7与多株Trafetes hirsuta的序列相似性高达100%。结合该菌的形态学特征和r DNA-ITS序列同源性分析,初步将菌株La-7鉴定为Trametes hirsuta。菌株La-7产漆酶的最佳发酵培养工艺参数为:10.0 g·L～（-1）葡萄糖、20.0 g·L～（-1）麦芽浸粉、0.5mmol·L～（-1） cu～（2+）、pH 3.0和30℃。在上述条件150 r·min～（-1）避光培养3 d后,粗酶液中漆酶活性高达65.4U·mL～（-1）。来源于Trametes hirsuta La-7浓缩的粗漆酶(ThLac,5 U·mL～（-1）)在酸性条件下（pH 4.0-6.0）能够有效地催化E2的转化,其表观假一级动力学参数（k）和半衰期(t)分别为0.0268～0.0547 min～（-1）和25.86～12.67 min （R～2> 0.98）。采用HRMS结合～（13）c-稳定同位素比值,基于精确的分子质量、同位素标记差值（△MW）和产物相对强度比值等理论,鉴定ThLac介导E2的转化产物。例如,产物1的单一同位素分子质量与其同位素标记物分子质量分别为270.1642和273.1725 （△MW=3.0101）,两者峰强度的相对比值为1:1.09,证实产物1可能是雌酮（E1）。同理,产物2-5分别为E2二聚体、三聚体、四聚体和E1-E2交叉偶联产物。该类产物主要通过ThLac催化E2单电子氧化形成苯氧活性自由基中间体,随后这些活性中间体随机的发生自我/交叉偶联反应形成c-c或c-O-c聚合产物。聚合产物的形成显著地降低了E2的雌激素活性和生态毒性。

关键词： Trametes hirsuta La-7 漆酶 E2转化 HRMS 13c-稳定同位素偶联机制

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