检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：王婧扬州大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA),旧称塞内卡谷病毒,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属。SVA是a型塞内卡病毒相关水疱病(SVA-associated vesiculardisease,SAVD)的病原体,其感染会引起病猪鼻部、口腔和蹄冠处出现特征性水疱病变,同时伴有... 详细信息

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA),旧称塞内卡谷病毒,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属。SVA是a型塞内卡病毒相关水疱病(SVA-associated vesiculardisease,SAVD)的病原体,其感染会引起病猪鼻部、口腔和蹄冠处出现特征性水疱病变,同时伴有抑郁、食欲不振、嗜睡、跛行等症状。2014年以来,美国、巴西、泰国、哥伦比亚、越南、中国等多个国家相继报道了 SAVD的发生。2018年,巴西出现了第二次SAVD爆发,其特点是传播迅速,临床表现严重。该疫情的再次发生,提示猪群中持续存在SVA可能会导致病毒进化,使其具有更强的致病性和传播能力。SVA作为猪新发传染病的病原体,我们急需了解该病的发病机制以及病毒早期与宿主细胞之间的相互作用等方面的信息。鉴于此,本研究首先通过转录组学技术分析SVA感染后,宿主细胞在转录水平上的变化情况。随后,运用CRISPR/Cas9技术构建了一组天然免疫基因缺失的猪细胞系,并研究了 SVA、萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)以及盖塔病毒(Getahvirus,GETV)在这些细胞系上的生长特性。1.a型塞内卡病毒感染的转录组学分析本研究从病毒与宿主细胞相互作用的角度出发,用SVAGD05毒株感染猪肾上皮细胞(LLC-PK1)。感染后6 h和12 h收集样本,进行高通量测序以分析细胞的转录组变化情况。结果显示,与对照组相比,SVA感染后6h,共发现1584个差异表达基因(different expression genes,DEGs),包括1072个表达上调的基因和512个下调基因。在SVA感染后12 h,发现9785个DEGs,其中表达上调的有5238个,下调的有4547个。GO功能注释和KEGG通路富集分析发现,SVA感染能够引起LLC-PK1细胞中天然免疫、细胞凋亡等多条信号通路发生改变。其中,天然免疫相关信号通路出现显著变化,提示在SVA感染过程中免疫调控机制发挥了重要作用。随后,我们选取了 28个重要的DEGs进行RT-qPCR验证。结果显示,所有DEGs的相对表达倍数变化与RNA-seq结果基本一致。其中,I型干扰素(包括IFN-α和IFN-β)呈现最大幅度上调,其次是RSAD2、DDX58、MX1等抗病毒天然免疫基因。相反,ID2等6个DEGs表达下调或不变。上述结果提示,Ⅰ型干扰素在宿主细胞早期抗病毒感染中起到关键作用,而其他免疫相关基因也发挥了重要功效。2.天然免疫基因及病毒受体缺失细胞系的构建与应用病毒与细胞受体结合是病毒入侵宿主细胞的首要步骤,对于病毒实现成功感染至关重要。先前研究发现,ANTXR1是SVA入侵人源细胞的细胞受体,但猪源ANTXR1是否作为SVA入侵猪源细胞的受体有待鉴定。此外,本研究转录组部分结果显示,SVA入侵宿主细胞之后,显著激活I型干扰素和MX1、RSAD2等的转录表达水平,提示这些抗病毒因子在宿主抵抗SVA感染中发挥了重要功效。Ⅰ型干扰素的产生需要多种天然免疫蛋白的参与,包括RIG-I、IRF3、IRF7、NF-κB、TRIF、MAVS 等。鉴于此,我们首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了敲除ANTXR1和过表达ANTXR1的ST-R细胞。随后,将SVA报告病毒感染上述细胞,通过观察荧光蛋白和测定荧光素酶活性,检测病毒对细胞的感染情况。结果显示,猪源ANTXR1是SVA入侵猪源细胞的细胞受体。其次,我们挑选了 I型干扰素信号通路中几个重要的免疫基因RIG-I、IRF3、IRF7、TRIF及抗病毒因子RSAD2、MX1,利用CRISPR/Cas9技术构建了一组天然免疫基因缺失细胞系。然后将三种猪源病毒(SVA,PSV,GETV)分别感染上述细胞,测定其生长曲线。结果显示,SVA病毒滴度在STRIG-IKO(knockout),ST IRF7 KO和ST IRF3/IRF7 KO细胞系上显著提升,提示RIG-I和IRF7在宿主细胞拮抗SVA生长复制过程中发挥重要作用。与转录组结果略有不同,SVA病毒滴度在STRSAD2KO、STMX1 KO等细胞系上无明显变化。我们推测基因在细胞水平上抑制SVA生长增殖的能力不仅取决于其在转录水平上的变化幅度,还与它的功能、在免疫信号通路中所处的位置密切相关。同时,运用免疫基因缺失细胞系测定的PSV和GETV生长曲线结果显示,TRIF和IRF7对于抑制PSV和GETV的生长复制具有重要意义。该研究工作旨在从细胞水平上通过敲除单个基因,研究病毒的生长情况,从而阐述基因个体在宿主拮抗病毒生长复制中的作用。同时,本研究为猪源病毒感染提供了切实可用的细胞材料,也为病毒致病机理的研究提供了理论支持。

关键词： a型塞内卡病毒转录组分析 CRISPR/Cas9技术天然免疫基因 ANTXR1受体

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a型塞内卡病毒的分离鉴定及其感染性克隆的构建

A型塞内卡病毒的分离鉴定及其感染性克隆的构建

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作者：王敏敏扬州大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的猪水疱病的病原体,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员。病猪表现食欲不振、嗜睡、厌食并伴有跛行及蹄部病变,新生仔猪发生急性死亡。2015年我国广东省首次暴发SVA疫情,此后在我... 详细信息

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是近年来新发现的猪水疱病的病原体,属于小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员。病猪表现食欲不振、嗜睡、厌食并伴有跛行及蹄部病变,新生仔猪发生急性死亡。2015年我国广东省首次暴发SVA疫情,此后在我国湖北、黑龙江、河南、福建、广西、山东、四川和广东等省份陆续发生SVA感染病例,给养猪业造成一定的经济损失。然而,关于SVA的病毒学基础和应用研究还不充分,且市面上也没有相应的疫苗和抗病毒药物。鉴于此,本研究首先通过细胞培养的方法分离出5株SVA,并对分离毒株进行了序列测定及病毒增殖特性鉴定等研究。进一步,利用反向遗传学技术构建出SVA GD05/2107株病毒感染性克隆。然后,将外源基因插入到SVA感染性克隆病毒基因组中,拯救出能够表达外源基因的重组SVA,并进行了相关病毒学特性研究。1.a型塞内卡病毒的分离鉴定及序列测定2017-2018年,广东某些猪场的猪只口蹄部出现水疱、嗜睡、跛行和体温升高等临床症状,1-4日龄仔猪出现一定数量的死亡。为了确诊该疾病的病原,本研究从患病猪只中采集了 20份样品,经RT-PCR检测有5份样品为SVA阳性。将阳性病料分别研磨处理后感染ST-R细胞,进行病毒分离。经RT-PCR、1FA及WB分析鉴定,确认本研究分离得到5株SVA毒株,并将其分别命名为GD01/2017、GD03/2017、GD05/2017、GD06/2017、GD-S1/2018。序列分析显示,本研究分离毒株基因组全长约7.2 kb,由5’UTR、3’UTR带有PolyA及编码一个2181 aa多聚蛋白的开放阅读框组成。遗传系统发生树显示,SVA中国分离株主要形成9个分支,其中本研究分离的5个毒株位于Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ分支上,揭示了 SVA中国分离株的进化多样性。***05/2017株全长感染性克隆的构建及病毒拯救利用反向遗传学技术,构建SVA GD05/2017株病毒感染性克隆。依次利用酶切连接和同源重组方法将病毒全长基因组片段插入到pEGFP-C3载体中,得到该毒株的全长cDNA克隆质粒pC3-SVA-GD05。将pC3-SVA-GD05转染BHK-21细胞,3 d后再取上清接种ST-R细胞,60-72 h后收获病毒液。用RT-PCR、IFA及WB检测,结果表明成功拯救SVA感染性克隆病毒,并将其命名为V-GD05-clone。3.构建表达报告基因的重组SVA为了能够快速且直观地检测病毒在细胞上的生长情况,本研究将3种不同大小的外源基因分别插入SVA感染性克隆病毒基因组中,并成功拯救出能够表达外源基因的感染性克隆病毒V-GD05-iLOV、V-GD05-RFP、V-GD05-Nluc。报告病毒的遗传稳定性分析显示,V-GD05-iLOV能够在细胞上维持最高水平的稳定传代,而V-GD05-RFP、V-GD05-Nluc传至3-5代后,报告基因出现大量的缺失,表明外源基因在病毒基因组中不稳定。IFA及流式细胞术结果显示,V-GD05-iLOV感染细胞能检测到中等强度的荧光信号,V-GD05-RFP感染细胞能检测到高等强度的荧光信号;荧光素酶活性测定显示,V-GD05-Nluc可通过检测荧光素酶活性来定量检测病毒的复制水平。同时,本研究将三种SVA报告病毒感染ST-R ANTXR1 KO细胞系,初步证明了 ANTXR1是SVA入侵猪源细胞的受体,为后续病毒与受体相互作用的研究奠定了良好的基础。

关键词： a型塞内卡病毒猪水疱病病毒分离报告基因感染性克隆

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a型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及血清学检测方法的建立

A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及血清学检测方法的建立

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作者：申珊河北农业大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒(Seneca VriusA,SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,对猪具有传染性和致病性。症状类似于口蹄疫、猪传染性水疱病和猪水泡性口炎,成年猪感染初期出现嗜睡、厌食和发热,随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出现大小不一的... 详细信息

a型塞内卡病毒(Seneca VriusA,SVA)属于小RNA病毒科塞内卡病毒属,对猪具有传染性和致病性。症状类似于口蹄疫、猪传染性水疱病和猪水泡性口炎,成年猪感染初期出现嗜睡、厌食和发热,随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位出现大小不一的水疱,严重者造成溃烂和跛行。7日龄以内的仔猪死亡率高达70%,偶尔伴有腹泻症状。2014-2015年SVA给巴西养猪业造成严重经济损失,同年SVA首次出现在我国广东地区,属于新型外来病。常用检测方法有病毒的分离鉴定、常规RT-PCR、荧光定量RT-PCR、病毒中和试验、利用表达SVA蛋白构建ELISA等。SVA只有一个阅读框,VP1、VP2和VP3构成该病毒的衣壳蛋白。研究表明,以VP2蛋白作为包被抗原的ELISA检测方法其特异性和灵敏度优于包被抗原为VP1蛋白或VP3蛋白。本试验利用构建的SVA-VP2蛋白作为抗原,建立SVA血清抗体间接ELISA和均相光激化学发光免疫技术(AlphaLISA)检测方法,为SVA-VP2蛋白的免疫原性的研究及SVA血清学检测试剂盒和基因工程疫苗研究奠定基础。本试验根据SVA分离株GD01/2017中的VP2基因,利用pet-30a载体特性和蛋白特点进行引物设计与合成。用RT-PCR成功扩增出大小为870 bp的VP2基因片段,经过克隆转化得到阳性质粒并名为pet30a-VP2重组质粒。随后将重组质粒转入Rosetta(DE3)大肠杆菌中,经过优化诱导温度和时间,在18℃ 12 h成功表达出大小为47KDa的VP2蛋白,同时蛋白质属于部分可溶性蛋白,利用Ni柱亲和层析法进行非变性蛋白纯化,得到高纯度VP2蛋白质,应用Western-blot方法检测VP2蛋白具有免疫反应原性。以纯化后VP2蛋白作为包被抗原,构建间接ELISA方法。用方阵滴定法确定VP2蛋白包被量为2 μg/ml,标准阳性血清最适稀释倍数为1:20。反应条件优化结果,最佳封闭液为2%BSA封闭液,酶标IgG最适稀释度为1:5 000,TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。该方法检测灵敏度为1:160;特异性试验结果显示,同猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胸膜肺炎(APP)的阳性血清均无交叉反应;批间、批内重复性试验结果,变异系数均小于10%;对200份临床血清样本检测结果显示,该方法同中和试验(VNT)的符合率为95.5%。将纯化的VP2蛋白经过生物素标记,并建立AlphaLISA方法。对反应条件优化结果显示,总反应体系为25μL,总反应时间为2h。该方法检测灵敏度为1:320;特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV、APP和PEDV 阳性血清均无交叉反应;重复性试验结果,变异系数均小于10%。本试验成功表达出可溶性VP2蛋白,初步建立检测SVAVP2抗体的间接ELISA和AlphaLISA血清学方法,均有较好的特异性、灵敏性和稳定性。

关键词： a型塞内卡病毒 VP2蛋白间接酶联免疫吸附试验均相酶联免疫分析

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a型塞内卡病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

A型塞内卡病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

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作者：罗愿西南大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)属于小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属,是一种无囊膜的单股、正链RNA病毒。SVA基因组全长约为7.2 kb,包含5’非编码区、3’非编码区和一个开放阅读框。SVA衣壳蛋白主要由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和... 详细信息

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)属于小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属,是一种无囊膜的单股、正链RNA病毒。SVA基因组全长约为7.2 kb,包含5’非编码区、3’非编码区和一个开放阅读框。SVA衣壳蛋白主要由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成,而非结构蛋白包括2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。猪是SVA的自然宿主,猪只感染SVA 3至5天之后会出现鼻镜、口腔上皮、舌和蹄冠等部位的皮肤和黏膜水疱性病变等临床症状。自2015年被证实在我国传播以来,SVA已经给我国养猪业造成了巨大的经济损失。由于SVA感染临床症状与包括口蹄疫、水疱性口炎、水疱性皮炎和猪水疱病在内的水疱性疾病较为相似,且目前尚无商品化疫苗可用于SVA感染的预防和控制,因此对SVA进行临床病理学特征研究、流行病学调查、基因特征分析和检测方法建立的系统性研究对于SVA的防控具有重要意义。本研究将重庆某猪场分离的一株SVA进行了基因组测序,将其命名为SVA/CH-CQ/2019,并参考GenBank中11株已发表的SVA VP1序列对SVA/CH-CQ/2019 VP1基因进行核苷酸序列比对分析、系统进化分析和蛋白质分析。使用重组质粒pET-32a(+)-SVA-VP1转化*** BL21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达重组VP1蛋白。本研究利用BHK-21细胞对SVA分离毒株进行增殖,浓缩病毒液与弗氏完全佐剂研磨乳化后免疫家兔制备了多克隆抗体。为建立SVA抗体检测ELISA方法,本研究以重组蛋白作为包被抗原,以制备的多克隆抗体作为阳性血清,建立基于SVA VP1的间接ELISA检测方法,优化ELSIA反应条件,进行了特异性、敏感性、重复性和临床样品检测试验,并将ELISA检测结果与PCR检测结果进行比较。序列分析表明SVA/CH-CQ/2019 VP1核苷酸序列与GenBank中11株已发表的SVA VP1序列同源性在91.8%～98.8%,其中与国内SVA/GXHZH-91324/2018分离株同源性达98.8%,二者处于进化树同一分支,进化关系最近;与原始分离株SVA/US/SVV-001-P3/2002同源性为91.8%,进化关系最远。VP1为稳定的结构蛋白,含有4个疏水簇,具有一定的疏水性,不存在跨膜区结构。重组质粒pET-32a(+)-SVA-VP1经双酶切鉴定正确。SDS-PAGE及Western Blot实验结果显示,IPTG成功诱导表达SVA VP1蛋白,且VP1蛋白主要以包涵体形式存在,经溶解复性后重组蛋白具有良好的免疫原性。琼脂扩散实验显示,SVA病毒凝缩液成功诱导家兔产生免疫应答。重组SVA VP1蛋白具有良好免疫原性,可以与多克隆抗体特异性结合。本研究基于SVA VP1建立了间接ELSIA检测方法,通过对反应条件进行优化确定最佳抗原包被浓度为0.4μg/mL,最佳封闭液为2%BSA,最佳血清稀释比例为1:2 000,最佳血清孵育时间为1.5 h,酶标IgG最佳稀释比例为1:10 000,最佳二抗孵育时间为30 min,最佳显色时间为15 min。批内重复试验变异系数在1.66%～3.30%,批间重复试验变异系数在1.82%～5.59%,重复性较好;与常见的猪病原体猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的阳性血清无交叉反应,特异性良好;对SVA阳性血清在稀释倍数为6 400倍时仍能检出,具有较好敏感性。本研究通过原核表达系统获得了具有良好免疫原性的SVA VP1蛋白,将其作为包被抗原,以自制的多克隆抗体作为阳性血清,成功建立了特异性、敏感性、重复性良好的SVA抗体间接ELISA检测方法。本研究对我国SVA的防治具有重要应用价值,为SVA中国流行毒株ELISA检测试剂盒的研发打下了基础,为SVA VP1蛋白的深入研究及亚单位疫苗的研制提供了理论基础。

关键词： a型塞内卡病毒 VP1 原核表达多克隆抗体间接ELSIA检测方法

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a型塞内卡病毒的分离鉴定及检测方法的建立

A型塞内卡病毒的分离鉴定及检测方法的建立

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作者：王晨西南大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)作为一种可以引起猪水泡样症状的外来病原,已经在世界范围内对猪业养殖造成了严重的经济损失。近年来,国内外众多学者对中国SVA的感染及流行情况开展调查,结果显示我国SVA感染情况较为严重且有上升趋势... 详细信息

a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)作为一种可以引起猪水泡样症状的外来病原,已经在世界范围内对猪业养殖造成了严重的经济损失。近年来,国内外众多学者对中国SVA的感染及流行情况开展调查,结果显示我国SVA感染情况较为严重且有上升趋势,避免猪群因大规模感染SVA造成巨大损失极为重要。重庆作为我国西部地区养猪业规模化较高的地区,亟需深入进行当地规模化猪场SVA感染情况调查及猪群SVA检测方法的建立。1.重庆地区一株a型塞内卡病毒的分离鉴定为了解近年来重庆地区规模化猪场SVA流行情况、掌握SVA流行毒株,通过采集2021～2022年重庆地区规模化猪场疑似SVA感染的病料进行分离鉴定和全基因组测序,同时另外选取国内外具有代表性的毒株25个,根据ORF区进行同源性比对和建立进化树。结果显示,本试验成功分离一株SVA并将其命名为SVA/CH-CQ(Gen Bank登录号:OP696593);通过与国内外代表性毒株的同源性比对发现,SVA与国内外地区流行毒株存在差异。其中,SVA/CH-CQ与HS-01株同源性最高,为99.95%;与SVV-001同源性最低,为93.51%;进化树分析,CH-CQ株与HS-01株亲缘关系最近,与IN＿Purdue＿4914-26和GO3株亲缘关系最远。结果表明,重庆地区规模化猪场存在SVA流行情况,并且SVA在流行过程中存在进化与变异,应采取相应措施对该病进行综合防控。2.a型塞内卡病毒VP2蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立为建立a型塞内卡病毒(SVA)抗体间接ELISA检测方法,本研究根据分离的SVA/CH-CQ株VP2基因设计特异性引物,将扩增片段与p ET32a(+)载体双酶切后连接并鉴定,使用大肠杆菌原核表达系统,通过优化蛋白表达温度、时间和IPTG浓度找到最佳表达条件,利用尿素变性复性法恢复包涵体蛋白活性,经SDS-PAGE及Western-blot鉴定正确后作为ELISA包被抗原。对影响ELISA试验的各个因素进行方阵优化,对特异性、敏感性、重复性进行试验,并利用Western-blot对ELISA检测结果进行验证。结果显示,经酶切鉴定和测序验证,p ET32a(+)-VP2质粒构建成功,SVA VP2蛋白最佳表达条件为IPTG 0.6 m M,30℃,6 h。蛋白复性后经SDS-PEGE和Western-blot验证可以作为ELISA包被液使用。ELISA方阵优化后的条件为:1μg/m L抗原包被后4℃过夜,5%马血清封闭时间1 h,1:500稀释一抗孵育2 h,1:5 000稀释二抗孵育1 h;本方法阴阳差异显著,特异性、灵敏性及重复性良好,与Western-blot验证结果一致。结果表明,本试验构建了一种高效表达SVA VP2蛋白的表达系统,并且利用表达的VP2蛋白建立了一种特异性、灵敏性及重复性良好的SVA抗体间接ELISA检测方法,为SVA防控及临床检测提供一种有效工具。3.a型塞内卡病毒荧光定量PCR检测方法的建立为建立SVA荧光定量PCR检测方法,本研究根据分离的SVA/CH-CQ株VP2基因设计特异性引物,将扩增片段与p MD-19T载体双酶切后连接并鉴定,使用标准质粒经倍比稀释后进行荧光定量PCR并绘制标准曲线,通过对反应程序和体系的优化,建立SVA荧光定量PCR检测方法并使用普通PCR方法与本方法进行对比。结果显示,p MD-19T-VP2质粒构建成功,本研究建立的荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.0×10～2～1.0×10～8 copies/μL的范围内线性关系良好,相关系数为0.9988。且用该方法对PEDV、TGEV等猪常见的疾病样品检测时无扩增,表明其特异性良好;该方法检测下限可达到1.0×10～2 copies/μL,比常规RT-PCR敏感性高100倍;变异系数始终小于2%,说明该检测方法重复性较好。结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法可以作为SVA的重要诊断技术,可为SVA临床快速检测提供帮助,有利于SVA的防治。

关键词： a型塞内卡病毒遗传进化分析间接酶联免疫吸附实验荧光定量PCR

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a型塞内卡病毒的演化分析及其L蛋白的功能研究

A型塞内卡病毒的演化分析及其L蛋白的功能研究

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作者：姬永琛扬州大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,近年来被鉴定为猪特发性水疱病（Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD）的病原体。SVA主要感染各个年龄段的猪,引起皮肤、口鼻部和冠状动脉带上的水疱... 详细信息

a型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）是小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员,近年来被鉴定为猪特发性水疱病（Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD）的病原体。SVA主要感染各个年龄段的猪,引起皮肤、口鼻部和冠状动脉带上的水疱和糜烂等特征性症状,尤其1～4日龄的仔猪可出现急性死亡,死亡率可达30%～70%。SVA早期在美国、英国、澳大利亚、意大利等国家零星爆发,因当时并未查明病因,未能引起养猪业的足够重视。直至2014年末2015年初,SVA在巴西多个区域的养猪场暴发,随后形成全球流行的态势,主要分布在北美洲、南美洲、欧洲、亚洲等地区,对全球养猪业造成了较大的经济损失。现如今,中国超过半数的省市都已有SVA感染的相关报道。尽管SVA是在20年前发现的,但关于SVA的演变和传播历史仍不十分清晰。因此,本研究对SVA的重组、系统发育、自然选择和演化动力学进行了综合分析,以说明SVA的起源、演化和时空格局。 L蛋白作为SVA基因组编码的第一个蛋白,与其他小RNA病毒的L蛋白差异性较大,且高度可变。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）、脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）等的L蛋白是一种多功能蛋白,可发挥拮抗宿主抗病毒反应、抑制应激颗粒的组装等多种关键的生物学功能。然而,因L蛋白巨大的序列差异性,目前还不清楚SVA L蛋白的生物学功能。因此,本研究利用原核表达系统和细胞融合技术制备了L蛋白的单克隆抗体,为L蛋白的功能研究提供强有力的免疫学工具。此外,进一步对SVA感染性克隆质粒L蛋白中相对保守的氨基酸位点进行突变,并利用复制子技术对L蛋白的功能进行初步探究。 1.a型塞内卡病毒的演化分析为更进一步了解SVA的演化特征以及传播历史,本研究对其进行了综合分析,包括重组检测、系统发育、选择分析、演化动力学和系统地理学分析。选用下载的238株SVA全基因组序列进行重组检测,共鉴定出5株重组毒株且均来自于中国。去除重组毒株后,利用贝叶斯推断（BI）法进行系统发育分析表明,SVA分为两个主要分支:分支Ⅰ（2007年之前的毒株）和分支Ⅱ（2007年之后的毒株）,遗传距离为0.0713±0.0030。进一步分析SVA分支Ⅰ和分支Ⅱ的遗传多样性,发现共存在544个特异性氨基酸替代,77个Shannon熵差异位点,表明两个分支间存在明显的演化差异。选择压力分析发现,SVA的绝大多数位点处于负选择,仅存在27个正选择位点,表明正选择和负选择共同驱动SVA的演化。SVA演化动力学分析的结果显示,SVA的最近共祖时间（TMRCA）为1986年（分支Ⅰ和Ⅱ的TMRCA分别为1986和2004年）,全基因组的演化速率是3.3522×10-3核苷酸替代每位点每年（nucleotide substitutions/site/year）。群体历史规模分析表明,SVA的有效种群数量呈逐渐增加的趋势,在2017年之前略有波动,随后急剧下降。值得注意的是,系统地理学分析推断巴西可能是2015年以来SVA全球传播的源头。总之,这些数据为SVA演变和传播历史的基本理解提供了新的思路。 2.a型塞内卡病毒L蛋白的单抗制备和功能研究单克隆抗体可作为有力的免疫学研究工具。本研究针对SVA L蛋白全长进行原核表达,并纯化得到L重组蛋白免疫原。将重组蛋白免疫小鼠,随后经细胞融合、IFA筛选和亚克隆得到一株分泌L蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为36-B3。将其扩大培养并注射小鼠腹腔,大量制备L单抗腹水。后续的生物学鉴定结果表明,该单克隆抗体适用于IFA试验以及外源性L蛋白的Western Blot检测。此外,利用L单克隆抗体进行亚细胞定位发现,SVA L蛋白主要定位于内质网中。 L蛋白序列在小RNA病毒科中的巨大差异性提示其功能保守性较差,而目前尚不清楚SVA L蛋白在其生命周期中发挥的具体功能。本研究首先对小RNA病毒中部分的L蛋白氨基酸序列进行比对,选取了13个相对保守位点。在SVA感染性克隆质粒（pC3-SVA-GD05）的基础上对L蛋白的这些位点进行突变,随后拯救病毒并测定其滴度。结果发现,唯有SVA L蛋白（L70A）突变使病毒致死,而其余突变位点对病毒滴度的影响较小。为进一步探究L蛋白的功能,选取了本实验室先前发现的使病毒致死或使病毒滴度明显减弱的突变和缺失位点（H42A、Q79A、Δ42H、Δ56R）以及本研究中发现的L70A突变位点替换到SVA复制子质粒（SVA-GD05-Rep）中,进行荧光定量PCR以及双荧光素酶报告基因检测,以研究L蛋白突变或缺失对于SVA复制和转录翻译的影响。结果表明,SVA L蛋白突变（H42A、

关键词： a型塞内卡病毒演化分析 L蛋白单克隆抗体转录和翻译

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a型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立及亚单位疫苗候选抗原研究

A型塞内卡病毒SYBR Green Ⅰ qPCR检测方法的建立及亚单位疫苗候...

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作者：孟媛延边大学

学位级别：硕士

2007年,在加拿大首次报告了 a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA),有感染猪群的情况,随后在美国、巴西、哥伦比亚、中国、泰国、越南均有相关报道。2015年,广东某猪场分离出一株SVA,从而确定了 SVA在我国的流行,SVA在我国的流行给养猪产... 详细信息

2007年,在加拿大首次报告了 a型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA),有感染猪群的情况,随后在美国、巴西、哥伦比亚、中国、泰国、越南均有相关报道。2015年,广东某猪场分离出一株SVA,从而确定了 SVA在我国的流行,SVA在我国的流行给养猪产业带来了巨大的经济损失。目前,我国境内存在许多亚临床感染现象,并且缺乏获批的商品化疫苗可以使用,这种情况增加了我国对a型塞内卡病毒病的防控难度。因此,需要开发一种具有高安全性的SVA新型疫苗。本研究目的是建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并且将其运用于SVA的检测;使用原核表达系统来表达纯化SVA VP1与SVA VP3的重组蛋白,将纯化复性后的SVA VP1与SVA VP3蛋白与佐剂联合免疫小鼠,对小鼠免疫效果进行评估。结果如下:*** Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立:SVA 2C基因标准品的拷贝数在1.99× 107-1.99× 100copies/μL范围内。2C基因标准品的相关系数为0.994,其斜率为3.736,2C检测方法的灵敏性为1.99×100,高于普通PCR 10000倍,2C组间变异系数在0.76～0.93%之间,组内变异系数在0.35～0.66%之间;SVA 3D基因标准品的拷贝数在2.18 × 107-2.18 × 100 copies/μ L范围内,3D基因标准品的相关系数为1.000,其斜率为3.589;3D检测方法灵敏性为2.18 × 100拷贝/μ L,高于普通PCR 1000倍;3D组间变异系数在0.60～1.06%之间,组内变异系数在0.51～0.89%之间;两种基因构建的检测方法均具有良好的特异性,SVA与PCV2、PCV3、FMDV、PRRSV、PEDV、TGEV均不产生交叉反应。采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测了 49份样品,2C检测出阳性率81.6%、3D检测出阳性率85.7%,使用普通PCR方法检测出的阳性率为55.1%。表明建立的SVA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR较普通PCR方法,具有更高的敏感性与更强的特异性,可以考虑用于SVA的快速检测。2.原核表达SVA VP1蛋白与VP3蛋白:扩增SVA VP1与VP3目的基因片段分别为792bp与717bp,与预期相符;并将SVA VP1与VP3克隆至pET-28a载体,然后,成功构建了 pET-28a-VP1重组质粒和pET-28a-VP3重组质粒,转化至*** BL21(DE3)pLySs感受态,再经IPTG诱导表达,分别约35KDa、29KDa的目的蛋白;温度为37℃,0.8mmol/L为诱导剂浓度、4h为诱导时间时,VP1蛋白表达量最高。温度为37℃,***/L为诱导剂浓度、6h为诱导时间时,VP3蛋白表达量最高。这两种重组蛋白均是呈现包涵体形式。用His标签Ni2+-NTA金属螯合蛋白质纯化柱纯化蛋白,薄层扫描结果显示VP1重组蛋白与VP3重组蛋白是纯度分别为85%、84%。*** VP1及VP3蛋白联合佐剂小鼠免疫评价:使用VP1浓度为0.56mg/mL、VP3浓度为0.23mg/mL的蛋白,联合氢氧化铝佐剂与弗式佐剂进行小鼠免疫试验,小鼠试验组的免疫抗原剂量是50 μ g/只,其中进行腿部肌肉注射,每只100 μL,首次免疫14d后,进行第二次免疫。并且分别从体液免疫与细胞免疫对小鼠的免疫效果进行评估。结果表明,VP1亚单位疫苗各免疫组的特异性抗体一免后7d均呈上升趋势,于二免后14d时VP1-FCA组特异性抗体效价达到最高值(1:163840);于二免后14d时VP1-AL组特异性抗体效价达到最高值(1:5120);中和抗体效价在二免后7d时极显著高于PBS组,VP1-FCA组达到最高值(1:512),在二免后14d时VP1-AL组达到最高值(1:1024);小鼠T淋巴细胞亚群CD3+CD4+与CD3+CD8+在二免后VP1-FCA组显著升高(p<0.05),VP1-AL组极显著升高(p<0.01);淋巴细胞增殖实验表明VP1-AL组与VP1-FCA组均呈现显著升高(p<0.05);对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明IL-4的分泌显著升高(p<0.05),IL-2与IFN-γ的变化不明显。VP3亚单位疫苗各免疫组组的特异性抗体一免后7d均呈上升趋势,于二免后14d时,VP3-FCA组特异性的抗体效价,已经达到最高值为(1:163840)。VP3-AL组特异性的抗体效价,已经达到最高值为(1:81920);中和抗体在二免后7d时,效价极显著高于PBS组,在二免后14d,VP3-AL组与VP3-FCA组同时达到最高值,分别是(1:128)、(1:32);淋巴细胞增殖实验表明VP

关键词： a型塞内卡病毒荧光定量PCR 原核表达 VP1蛋白与VP3蛋白亚单位候选抗原

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a型塞内卡病毒2B蛋白拮抗DDX23抗病毒反应机制研究

A型塞内卡病毒2B蛋白拮抗DDX23抗病毒反应机制研究

引用

作者：周易安徽农业大学

学位级别：硕士

a型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）作为一种新发猪源病原,自发现以来在全球范围内广泛流行,目前没有有效的防控手段。鉴于本病的发生发展已影响了我国的生猪养殖行业,因此深入解析该病原的致病机制及逃避宿主抗病毒机理具有切实意义。... 详细信息

a型塞内卡病毒（Senecavirus A,SVA）作为一种新发猪源病原,自发现以来在全球范围内广泛流行,目前没有有效的防控手段。鉴于本病的发生发展已影响了我国的生猪养殖行业,因此深入解析该病原的致病机制及逃避宿主抗病毒机理具有切实意义。DDX23属于DEAD-box（DDX）家族成员之一,大量报道证实该宿主因子可抑制多种病毒在胞内增殖。前期本课题组已经阐明DDX23可靶向SVA-3A蛋白发挥其抗病毒作用,但SVA在感染过程中是否拮抗其抗病毒活性的研究尚未揭示。为此,本研究从SVA致病机制入手,聚焦揭示SVA拮抗DDX23的相互作用机理,为进一步加深SVA的感染认知及其拮抗机制提供新见解。具体研究内容如下: 一、SVA感染后内源DDX23表达水平的测定。选用前期构建的鼠源DDX23真核表达载体为扩增模板,通过PCR扩增后将其克隆至pET-28a原核表达载体。经诱导表达分离纯化后,将目的蛋白免疫兔体,制备后续试验所需的多克隆抗体。此外将SVA以剂量依赖方式（0.01、0.05和0.1 MOI）接种BHK-21细胞或以0.1 MOI SVA接种BHK-21细胞后以时间依赖方式（8、16、24和48 h）分别收取上述两者试验样本,通过Western blot和RT-q PCR方法分别测定内源DDX23变化情况。结果表明,SVA感染期间DDX23的蛋白表达量呈剂量依赖方式下调,但DDX23的转录水平呈上升趋势。二、降解DDX23的病毒蛋白筛选及作用通路研究。将SVA病毒蛋白表达质粒分别与真核表达质粒p CAGGS-DDX23-FLAG共转染至293T细胞,24h后收取样本进行Western blot鉴定,结果显示SVA-2B和3C均能够降解DDX23。随后将不同剂量的重组质粒p CA-2B-FLAG与p CA-DDX23-HA进行共转染并重复上述试验,结果表明DDX23被2B剂量依赖性降解,此外内源DDX23的表达变化也与其保持一致。通过分子模拟、Co-IP及激光共聚焦试验证实二者在BHK-21细胞内存在互作和共定位现象。为了进一步探明SVA-2B降解DDX23的作用通路,本研究将蛋白降解通路抑制剂（MG-132、Ac-DEVD-CHO和CQ）介导至2B与DDX23的共转染试验中,结果发现降解的DDX23在Ac-DVDE-CHO处理组中发生了回补,说明2B蛋白通过半胱天冬酶途径靶向抑制DDX23的表达。继而,我们同样采用抑制剂处理方式,将Caspase-2/-3/-6/-8/-9抑制剂（Z-VDVAD-FMK、Z-DEVD-FMK、Z-VEID-FMK、Z-IETD-FMK和Z-LEHD-FMK）再次作用本试验,最终发现Caspase-2/-3抑制剂缓解了2B降解DDX23的作用。表明SVA-2B通过半胱天冬酶途径中的Caspase-2/-3发挥降解DDX23的功能。三、SVA-2B降解DDX23的功能位点鉴定及2B突变病毒的拯救。为了探明SVA-2B降解DDX23的关键位点,本研究利用截断体和突变体构建技术,获得了一系列SVA-2B的截断体和突变体,进一步通过重组质粒共转染方式发现SVA-2B第44、45位的色氨酸和脯氨酸突变后丧失了降解DDX23的功能,表明该降解过程中上述两个氨基酸发挥了关键作用。随后针对这两个位点,在本试验室保存的SVA感染性克隆质粒p CMV-r SVA的基础上,通过反向遗传技术构建并成功拯救了2B双位点突变重组病毒r SVA-2BW44A、P45A及回复突变病毒r SVA-2BW44A、P45A（D）。生物学特性鉴定显示重组病毒较野生型其复制能力降低,且重组病毒降解DDX23的能力也明显减弱。综上所述,本研究首次阐明SVA-2B利用第44、45位的色氨酸和脯氨酸通过宿主Caspase-2和Caspase-3靶向降解了DDX23,并以此帮助SVA拮抗DDX23的抗病毒活性。该结果丰富了SVA-2B的生物学功能,为后续研究抗SVA药物和防控手段提供了新的方向和潜在靶点。

关键词： a型塞内卡病毒 SVA-2B DDX23 拮抗机制

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基于a型塞内卡病毒VP3蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2021年第2期49卷 23-30页

作者：申水莹闫若潜雷从从王淑娟马震原刘影赵雪丽谢彩华吴志明河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 河南省兽药饲料监察所河南郑州450002

【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中a型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴... 详细信息

【目的】建立基于VP3蛋白检测血清中a型塞内卡病毒(SVA)抗体的间接ELISA方法,为临床上猪群SVA感染及未来疫苗免疫效果评价提供有效手段。【方法】克隆SVA的VP3基因,将其与pQE-30表达载体连接,并进行原核表达,对表达的蛋白进行纯化和鉴定。用纯化的重组VP3蛋白(rVP3)作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,通过对已知背景的200份SVA阴阳性血清进行检测以确定临界值,并对该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性进行验证。将采自SVA灭活疫苗免疫猪不同时期的160份血清,分别用该试验建立的方法及本课题组前期建立的基于VP1蛋白的间接ELISA方法进行检测,对比两者检测结果。【结果】成功克隆717 bp的VP3基因,表达出分子质量约为32 ku的VP3重组蛋白(rVP3)。Western Blot试验结果表明,纯化的rVP3蛋白具有良好的反应原性。建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,当样本OD 450(S)/阳性对照OD 450(P)>0.138时判定为SVA抗体阳性。该方法特异性强,与FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原阳性血清均无交叉反应;敏感性较好,检测出的阳性血清最高稀释倍数与中和试验基本一致;重复性和稳定性好,批内变异系数小于4%,批间变异系数小于9%。160份血清检测结果表明,两种方法在不同时期的抗体阳性检出率略有差异。【结论】建立了基于VP3蛋白的SVA间接ELISA检测方法,该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。

关键词： a型塞内卡病毒 VP3蛋白间接ELISA 病毒检测

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猪a型塞内卡病毒分离鉴定及其VP1基因变异分析

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畜牧兽医学报 2019年第9期50卷 1747-1752页

作者：李秀博刘存崔玉东梁琳张建伟崔尚金黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193 农业部兽用药物与兽医生物技术北京科学观测实验站北京100193 北京市畜牧总站北京100107

2017年7月,南方某猪场发生不明病原引起的猪水疱性疾病。为了确诊本次水疱性疾病的病因及了解病原的遗传演化关系,笔者通过RT-PCR方法对引起该场水疱性疾病的病原进行检测,利用BHK21细胞分离病毒,RT-PCR、电镜观察等方法对分离病毒进行... 详细信息

2017年7月,南方某猪场发生不明病原引起的猪水疱性疾病。为了确诊本次水疱性疾病的病因及了解病原的遗传演化关系,笔者通过RT-PCR方法对引起该场水疱性疾病的病原进行检测,利用BHK21细胞分离病毒,RT-PCR、电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定,同时对其主要的抗原基因VP1进行比对分析。RT-PCR检测结果表明导致该猪场发生水疱性疾病的病原为a型塞内卡病毒(Senecavirus A, SVA),将利用BHK21细胞分离并经鉴定的病毒命名为CH/FuJ1/2017株。同源性分析结果显示,CH/FuJ1/2017株与报道的SVV-001株的相似性最低,与分离自美国的USA-GBI29-2015株的相似性最高。基于SVA VP1基因氨基酸序列的分析结果表明,SVA分离株形成一个独立的小分支,与SVV-001株相比,SVA分离株在VP1蛋白的59、62、63、93、97、172位氨基酸存在突变,且位于VP1蛋白的B-C环上和CD-Ⅱ环上,这可能与SVA的细胞嗜性改变有关。综上表明我国SVA分离株具有遗传多样性,部分国内分离株与国外SVA分离株间具有密切的相关性。

关键词： a型塞内卡病毒分离 VP1 遗传演化

来源：评论

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