检索结果-内蒙古大学图书馆

肿瘤防治研究 2016年第12期43卷 1039-1042页

作者：刘润田安聪静白云郑建兴河北医科大学第二医院肝胆外科石家庄050000 河北医科大学第二医院体检中心石家庄050000 河北省人民医院消化内科石家庄050057 唐山市工人医院肝胆外科唐山063000

目的探讨过表达/沉默GSTP1基因对人肝癌细胞系HepG2增殖及侵袭能力的影响。方法采用腺病毒载体转染人肝癌细胞系HepG2,获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞。实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞中GSTP1 mRNA表达水平;CCK-8法和Transwell... 详细信息

目的探讨过表达/沉默GSTP1基因对人肝癌细胞系HepG2增殖及侵袭能力的影响。方法采用腺病毒载体转染人肝癌细胞系HepG2,获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞。实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞中GSTP1 mRNA表达水平;CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞的细胞活力和侵袭能力;免疫印迹法(Western blot)检测细胞中akt、mtor、p-akt和p-mtor的蛋白表达。结果经腺病毒载体转染后,成功获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞;过表达GSTP1基因后,HepG2细胞的细胞活力和侵袭能力显著降低(P<0.05),而沉默GSTP1基因后,HepG2细胞的细胞活力和侵袭能力则显著增高(P<0.05);过表达GSTP1基因后,p-akt和p-mtor的蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而沉默GSTP1基因的结果则相反。结论过表达GSTP1基因可抑制HepG2细胞的增殖和侵袭能力,沉默GSTP1基因则促进HepG2细胞的增殖和侵袭能力,其作用机制可能与akt/mtor信号通路有关。

关键词： GSTP1 HepG2细胞增殖侵袭 akt/mtor信号通路

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千金藤素对胰腺癌细胞作用及其机制的研究

千金藤素对胰腺癌细胞作用及其机制的研究

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作者：梁瑞华湖北科技学院

学位级别：硕士

目的探讨千金藤素(Cepharanthine,CEP)对人胰腺癌细胞As PC-1、Bx PC-3增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法将2.1875、4.375、8.75、17.5、35μmol·L千金藤素作用于As PC-1细胞48 h,1.875、3.75、7.5、15、30μmol·L作用于Bx ... 详细信息

目的探讨千金藤素(Cepharanthine,CEP)对人胰腺癌细胞As PC-1、Bx PC-3增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法将2.1875、4.375、8.75、17.5、35μmol·L千金藤素作用于As PC-1细胞48 h,1.875、3.75、7.5、15、30μmol·L作用于Bx PC-3细胞48 h,采用MTT法检测细胞增殖率;17.5、35μmol·L千金藤素作用于As PC-1细胞48 h,15、30μmol·L作用于Bx PC-3细胞48 h后,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,台盼蓝染色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9及信号通路相关蛋白akt、m TOR的表达量的变化。结果与空白对照组相比,不同浓度千金藤素作用于As PC-1、Bx PC-3细胞48 h后,其细胞增殖均受到抑制,其差异有统计学意义(p<0.05),且随千金藤素剂量的增加,As PC-1、Bx PC-3细胞的增殖率均逐渐下降;低、高浓度千金藤素作用As PC-1、Bx PC-3细胞48 h后,细胞形态学发生了明显变化;台盼蓝染色结果显示,随着剂量的增大,细胞存活率明显降低(p<0.05);流式细胞检测结果显示,与空白对照组相比,千金藤素给药组细胞凋亡率均升高,且剂量越大,凋亡率升高越显著(p<0.05);Western Blot结果显示千金藤素处理后凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9均有所上调;信号通路相关蛋白p-akt、p-m TOR均有所下调(p<0.05)。结论千金藤素能抑制人胰腺癌As PC-1、Bx PC-3细胞增殖,并诱导其发生凋亡,其抑制增殖和凋亡的机制可能与抑制akt/m TOR信号通路有关。

关键词：千金藤素胰腺癌细胞细胞凋亡 akt/mtor信号通路

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黄连解毒汤对急性UC小鼠akt/mtor通路的调控机制

黄连解毒汤对急性UC小鼠Akt/mTOR通路的调控机制

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作者：肖思萌广西中医药大学

学位级别：硕士

目的:考察黄连解毒汤(HLJD)对DSS诱导的急性UC小鼠结肠损伤的作用和对akt/m TOR通路的调控机制。方法:(1)HLJD提取物的质量控制采用HPLC法建立10批HLJD提取物的指纹图谱,通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行指纹特征峰相似性分... 详细信息

目的:考察黄连解毒汤(HLJD)对DSS诱导的急性UC小鼠结肠损伤的作用和对akt/m TOR通路的调控机制。方法:(1)HLJD提取物的质量控制采用HPLC法建立10批HLJD提取物的指纹图谱,通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行指纹特征峰相似性分析,通过SPSS 19.0软件进行聚类分析。采用HPLC法测定10批HLJD提取物中盐酸小檗碱的含量,并制订HLJD提取物中盐酸小檗碱的含量限度。(2)HLJD对DSS诱导的急性UC小鼠结肠损伤的影响BALB/c小鼠随机分成空白对照组(Control)、模型组(Model)、HLJD组(24.66、12.33、6.17g/kg/d)和美沙拉嗪阳性药组(0.31g/kg/d)(USAN),每组10只。除Control组小鼠外,其它各组小鼠自由饮用DSS水溶液(2.5%)制备急性UC模型,连续8d,造模同时灌胃给予相应药物干预。实验期间对小鼠的体重变化,粪便性状以及粪便隐血情况记录与评价,进行疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分。剖取结肠后进行结肠宏观检查以及HE染色,进行结肠损伤指数(Colon Macroscopic Damage Index,CMDI)评分,考察HLJD对DSS诱导的急性UC结肠损伤的缓解作用。(3)HLJD对急性UC小鼠结肠组织akt/m TOR通路的调控机制BALB/c小鼠随机分成空白对照组(Control)、模型组(Model)、雷帕霉素组阻断剂(0.5g/kg/d)(RAPA)、干扰组(RAPA0.5g/kg/d+HLJD24.66g/kg/d)和HLJD组(24.66g/kg/d),每组10只。采用2.5%DSS诱导小鼠急性UC模型。RAPA组和RAPA+HLJD组在造模前2d腹腔注射RAPA,其他组在造模同时灌胃给予相应药物干预。同法进行HE评分、DAI评分和CMDI评分。Western Blot检测小鼠m TOR、p-m TOR、akt和p-akt蛋白表达,并通过免疫组化法(Immunohistochemistry,IHC)测定m TOR蛋白下游p4E-BP1、p70S6K1的表达和Masson染色检测结肠粘膜胶原蛋白表达,进一步验证HLJD对akt/m TOR通路的调控作用。(4)统计学分析用SPSS统计软件进行数据处理,计量资料以均数标准差(Mean±SD)表示,数据符合正态性和方差齐性时,多组间比较采用方差分析,否则采用Kruskal-Wallis秩和检验。两组间比较采用t检验(数据符合正态性和方差齐性)或Wilcoxon秩和检验(数据不符合正态性和/或方差齐性)。组内前后比较采用配对t检验(数据符合正态性和方差齐性)或符号秩和检验(数据不符合正态性和/或方差齐性)。计数资料的组间比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)HLJD提取物的质量控制色谱条件:色谱柱:C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);以乙腈(A)-0.1%磷酸(每100m L加0.1g十二烷基硫酸钠)(B)为流动相,梯度洗脱(0-15min,10%-20%A;15-30min,20%-30%A;30-60min,30%-50%A;60-75min,50%A;75-80min,0%-10%A;80-110min,10%A);流速:1.0m L/min;柱温:30℃;检测波长:277nm;进样量:10μL。理论板数按盐酸小檗碱计算应不低于4000。在上述色谱条件下确定22个指纹特征峰,10批HLJD样品峰与对照色谱峰的相似度值在0.879～0.997,聚类分析结果可见10批HLJD提取物被分为3类。10批HLJD提取物中盐酸小檗碱的含量13.36～46.59mg/g。HLJD提取物中盐酸小檗碱含量不能低于19.90mg/g。(2)HLJD缓解DSS诱导的急性UC小鼠结肠损伤与Control组比较,Model组小鼠出现明显便血、腹泻、体重下降等急性UC症状,CMDI和DAI评分显著升高(P<0.05),HE染色结果显示Model组结肠损伤严重,主要表现为粘膜层上表皮发生大面积脱落,粘膜层腺体出现严重损伤,残存的腺体中杯状细胞存在裂解与消失的现象,大量炎症细胞浸润,炎症渗透至粘膜层与粘膜下层,局部炎症浸润至肌层,HE评分极显著升高(P<0.01)。与模型组比较,经HLJD和USAN治疗后,HLJD组、USAN组小鼠DAI评分降低、CMDI和HE评分显著下降(P<0.01),HE染色结果显示HLJD和USAN组小鼠结肠组织损伤情况相较于Model组得到了有效缓解,表现为结肠粘膜结构较为完整,除粘膜肌出现小部分的炎症损伤外,大部分结肠区域包括腺体杯细胞均未观察到病变,炎性细胞仅于粘膜层局部分布。HLJD高剂量缓解急性U

关键词：黄连解毒汤葡聚糖硫酸钠急性溃疡性结肠炎 akt/mtor信号通路雷帕霉素

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气阴两虚2型糖尿病的病症研究

气阴两虚2型糖尿病的病症研究

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作者：鲁娜新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:探究气阴两虚2型糖尿病(T2DM)患者血液和尿液中氨基酸代谢物谱，并探讨氨基酸与临床指标的相关性;观察蛋白干预气阴两虚T2DM大鼠肾脏中akt/mtor信号通路的变化，为T2DM中医辨证分型和治疗提供科学依据。方法:1.收集308例志愿者的... 详细信息

目的:探究气阴两虚2型糖尿病(T2DM)患者血液和尿液中氨基酸代谢物谱，并探讨氨基酸与临床指标的相关性;观察蛋白干预气阴两虚T2DM大鼠肾脏中akt/mtor信号通路的变化，为T2DM中医辨证分型和治疗提供科学依据。方法:1.收集308例志愿者的血、尿液样本，(1)运用高效液相色谱法(HPLC)检测其血液和尿液中的氨基酸，(2)运用BS-120全自动生化仪检测血清中的生化指标。2.苏木精-伊红染色(HE)染色观察大鼠肾组织的形态结构，蛋白质免疫印迹(WB)检测蛋白干预对气阴两虚T2DM大鼠肾脏中的蛋白表达水平。结果:1.蛋氨酸(Met)是气阴两虚T2DM患者血液和尿液的共同氨基酸特征性代谢物。2.血液和尿液的气阴两虚T2DM组的Met、异亮氨酸(Ile)水平与体重指数(BMI)、甘油三酯(TG)水平具有显著的相关性(p＜0.05)。3.血液和尿液的气阴两虚T2DM组的BMI水平与TG水平具有显著的相关性(p＜0.05)。***结果显示，在大鼠肾组织中，气阴两虚T2DM组与正常组、大豆蛋白组、黄连素组相比，akt、akt/p-akt、mtor、p-mtor、mtor/p-mtor蛋白表达升高(p＜0.05)，气阴两虚T2DM组与正常组、大豆蛋白组相比，p-akt蛋白表达升高(p＜0.05)，气阴两虚T2DM组与正常组、大豆蛋白组、黄连素组相比，TSC2蛋白表达降低(p＜0.05)，正常组、T2DM模型组、大豆蛋白组、黄连素组的P70s6k、p-P70s6k蛋白表达升高(p＜0.05)，正常组、T2DM模型组、大豆蛋白组、牛奶蛋白组、黄连素组的P70s6k/p-P70s6k蛋白表达升高(p＜0.05)。结论:Met是气阴两虚2型糖尿病证候判断的重要的标志性氨基酸，且Met、Ile与BMI、TG具有显著的相关性;与对照组相比，气阴两虚T2DM组大鼠肾脏中akt/mtor信号通路被激活，大豆蛋白可以通过抑制其活化来发挥肾脏保护作用。

关键词： 2型糖尿病气阴两虚证氨基酸代谢物 akt/mtor信号通路蛋白干预

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基于akt/mtor通路研究小干扰RNA沉默ROR1抑制肺腺癌转移和侵袭的分子机制

基于AKT/mTOR通路研究小干扰RNA沉默ROR1抑制肺腺癌转移和侵袭的...

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作者：龙明鹏成都中医药大学

学位级别：硕士

实验背景和目标肺癌是目前全球癌症发病率和死亡率最常见且对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。吸烟是肺癌发生最主要的原因,其次是空气污染、职业致癌因子、电离辐射以及某些癌基因的活化和抗癌基因的丢失等。肺癌主要分为非... 详细信息

实验背景和目标肺癌是目前全球癌症发病率和死亡率最常见且对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。吸烟是肺癌发生最主要的原因,其次是空气污染、职业致癌因子、电离辐射以及某些癌基因的活化和抗癌基因的丢失等。肺癌主要分为非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,非小细胞肺癌约占肺癌的80%。肺腺癌是非小细胞肺癌中的一种,其占所有肺癌类型的40%,占非小细胞肺癌的55%左右。由于肿瘤侵袭和转移,肺腺癌的5年生存率较差[2],传统疗法的治疗效果不理想。受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）是I型表面跨膜蛋白,有助于胚胎发育过程中胎儿器官的发育和迁移[3]。ROR1已被证明可抑制细胞凋亡,增强EGFR信号传导,诱导增殖,因此与肿瘤细胞的进展密切相关[4-6]。本实验旨在研究ROR1对肺腺癌转移与侵袭的作用机制,旨在为肺腺癌的治疗提供新的靶点。实验方法（1）利用肿瘤细胞体外培养技术,用小干扰RNA（siRNA）检测ROR1被干扰后在肺腺癌细胞株PC9、PC9erlo、NCI-H1975和NCI-H358中的抑制效果。（2）采用细胞划痕实验检测ROR1被干扰后肺腺癌细胞株PC9和PC9erlo细胞的迁移率。（3）采用细胞侵袭实验检测ROR1被干扰后肺腺癌细胞株PC9、PC9erlo和NCI-H1975细胞的侵袭情况。（4）采用免疫荧光实验检测PC9、PC9erlo和NCI-H1975细胞株的上皮间质转化标志蛋白的荧光表达情况。（5）采用免疫蛋白印迹技术检测ROR1被干扰后PC9、PC9erlo、NCI-H1975和NCI-H358细胞株的上皮间质转化转录因子蛋白和akt信号通路中关键蛋白的表达变化。实验结果（1）在四种不同的肺腺癌细胞株PC9、PC9erlo、NCI-H1975和NCI-H358中,流式细胞术检测得出:用siRNA干扰后,siROR1组（ROR1 siRNA）的ROR1的表达水平与siNC组（Negative ControlsiRNA）相比有着明显的下降。（2）在两种不同的肺腺癌细胞株PC9和PC9erlo中,细胞划痕实验得出:用siRNA干扰48小时后,siROR1组细胞的迁移与siNC组相比明显被抑制。（3）在三种不同的肺腺癌细胞株PC9、PC9erlo和NCI-H1975中,细胞侵袭实验得出:用siRNA干扰48小时后,siROR1组细胞的侵袭与siNC组相比明显被抑制。（4）在三种不同的肺腺癌细胞株PC9、PC9erlo和NCI-H1975中,细胞免疫荧光实验得出:用siRNA干扰48小时后,检测与肿瘤间质相关的Vimentin和与肿瘤上皮相关的E-cadherin的荧光表达水平,siROR1组的Vimentin荧光水平比siNC组表达下降,而siROR1组的E-cadherin荧光水平比siNC组表达上升。（5）在四种不同的肺腺癌细胞株PC9、PC9erlo、NCI-H1975和NCI-H358中,免疫蛋白印迹实验得出:用siRNA干扰48小时后,检测EMT相关蛋白,siROR1组的Snail、Slug和Vimentin比siNC组表达下降,而E-cadherin比siNC组表达上升,进一步检测akt/mtor信号通路中的关键蛋白,发现在NCI-H1975和NCI-H358细胞株中siROR1组的p-mtor、p-akt、p-p70S6K和p-Raptor比siNC组表达下降;在PC9和PC9erlo细胞株中siROR1组的p-mtor、p-akt和p-p70S6K比siNC组表达下降。实验结论体外实验的结果显示:利用siRNA干扰ROR1的表达后,人肺腺癌细胞株的迁移和侵袭能力明显得到一定程度的抑制,其机制可能是通过调控akt/mtor信号通路关键信号分子的活性来达到。本研究为肺腺癌的治疗提供新思路,为肺腺癌的转移和治疗提供了一个新的靶点。

关键词：肺腺癌 ROR1 EMT 转移侵袭 akt/mtor信号通路

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参仙升脉口服液抑制akt/mtor通路磷酸化激活自噬改善SSS小鼠窦房结纤维化

参仙升脉口服液抑制AKT/mTOR通路磷酸化激活自噬改善SSS小鼠窦房...

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作者：陈晨辽宁中医药大学

学位级别：硕士

目的:探究参仙升脉口服液对病态窦房结综合征(Sick sinus syndrome,SSS)小鼠窦房结纤维化的改善作用,并进一步探究其作用机制,为参仙升脉口服液治疗SSS提供进一步的证据支持。材料与方法:在体内实验中,将15只小鼠采用随机数表法分为3组... 详细信息

目的:探究参仙升脉口服液对病态窦房结综合征(Sick sinus syndrome,SSS)小鼠窦房结纤维化的改善作用,并进一步探究其作用机制,为参仙升脉口服液治疗SSS提供进一步的证据支持。材料与方法:在体内实验中,将15只小鼠采用随机数表法分为3组:假手术组(SHAM,n=5)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)构建的病态窦房结综合征模型组(SSS,n=5)和参仙升脉口服液治疗组(SXSM,n=5)。通过微渗透压泵缓慢泵入AngⅡ的方式构建SSS模型,于术后第二天开始以灌胃方式给药,SXSM组给予参仙升脉口服液,其余组给予等量纯净水。连续给药28天后,用生物信号采集处理系统记录并分析小鼠肢体导联心电图评估心率改变;Masson病理染色及纤维化标志蛋白免疫荧光染色评估纤维化程度。在体外实验中,应用小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3细胞系模拟窦房结成纤维细胞。细胞分为四组:CON、AngⅡ、SXSMs以及SC79组。其中CON为空白对照组,不给予任何干预措施。其余组细胞在培养12小时后给予AngⅡ处理48小时,同时SXSMs组给与参仙升脉口服液,SC79组给予参仙升脉口服液和akt磷酸化激动剂SC79。CCK-8检测细胞活力确定参仙升脉口服液最适浓度;纤维化标志蛋白免疫荧光染色评估纤维化程度;MDC自噬染色及透射电镜观察自噬小体共同评估细胞自噬水平;Western-Blot检测检测akt/m TOR信号通路相关蛋白akt、p-akt、m TOR、p-m TOR、及自噬相关蛋白Beclin-1、p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的表达水平。结果:1.体内实验(1)小鼠心率改变:小鼠肢体导联心电图显示,与SHAM组相比,SSS组小鼠的心率显著下降并伴有R-R间期的延长(##P<0.01);而SXSM组小鼠心率以及R-R间期均得到了显著改善(**P<0.01)。(2)小鼠窦房结纤维化改变:MASSON染色及免疫荧光染色显示,SSS组中在AngⅡ的作用下,小鼠窦房结纤维化显著增加,同时伴有窦房结区域Fibronectin、Collagen I等纤维化标志性蛋白的大量表达(#P<0.05,##P<0.01);而参仙升脉口服液处理后能显著改善小鼠窦房结纤维化,同时减少该区域Fibronectin、Collagen I等纤维化标志性蛋白的表达(**P<0.01)。2.体外实验(1)参仙升脉口服液最适浓度筛选:将参仙升脉口服液浓度为0 ml/L时的细胞活力默认为100%,使用不同浓度的参仙升脉口服液处理12h、24h、48h的NIH-3T3细胞系均未观察到细胞毒性,且在1ml/L时细胞活力最大。(2)参仙升脉口服液抑制akt磷酸化改善NIH-3T3细胞纤维化:免疫荧光显示,与CON组相比,经过AngⅡ处理的NIH-3T3细胞α-SMA、Fibronectin和Collagen I等纤维化蛋白的荧光强度明显增加(△P<0.05,△△P<0.01)。同时与AngⅡ组相比,参仙升脉口服液可以改善AngⅡ诱导的NIH-3T3细胞α-SMA、Fibronectin和Collagen I等纤维化蛋白的过度表达(##P<0.01),并且参仙升脉口服液的这种改善作用可以被akt磷酸化激动剂SC79阻断(**P<0.01)。(3)参仙升脉口服液抑制akt磷酸化激活NIH-3T3细胞自噬:MDC自噬染色结果表明,经过AngⅡ处理后NIH-3T3细胞的自噬水平显著降低(△△P<0.01),而参仙升脉口服液可使AngⅡ组中NIH-3T3细胞的自噬率显著增加(##P<0.01),且参仙升脉口服液对自噬的激活作用可被akt磷酸化激动剂SC79阻断(**P<0.01)。透射电镜结果显示:AngⅡ处理后NIH-3T3细胞内自噬小体的数量显著减少(△△P<0.01),而AngⅡ组中的NIH-3T3细胞在参仙升脉口服液处理下自噬小体数量显著增加(#P<0.05),并且该趋势在加入SC79后被逆转(**P<0.01),自噬小体数量再次减少,结果与MDC自噬染色的结果一致。(4)参仙升脉口服液抑制akt/m TOR信号通路磷酸化激活NIH-3T3细胞自噬:与CON组相比,AngⅡ组p-akt、p-m TOR表达水平明显明显增加(△P<0.05,△△P<0.01),同时Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平显著降低且伴随自噬底物p62消耗减少(△P<0.05,△△P<0.01),提示NIH-3T3细胞系的akt/m TOR磷酸化被激活,且自噬活性受到抑制。然而参仙升脉口服液可显著降低AngⅡ诱导的p-akt、p-m TOR的过度表达(#P<0.05),同时Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达增加伴有自噬底物p62消耗增多(##P<0.01,#P<0.05

关键词：病态窦房结综合征纤维化参仙升脉口服液自噬 akt/mtor信号通路

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低氧人肺动脉内皮细胞自噬和凋亡的机制探究

低氧人肺动脉内皮细胞自噬和凋亡的机制探究

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作者：宁红娟锦州医科大学

学位级别：硕士

目的对人肺动脉内皮细胞(hPAECs)进行正常氧及低氧处理,观察细胞的迁移、增殖、凋亡及自噬水平变化;研究β-Arrestins1对低氧诱导的hPAECs的自噬和凋亡的潜在作用,并进一步对其相关信号通路进行初步的研究及分析。方法将hPAECs分别给予... 详细信息

目的对人肺动脉内皮细胞(hPAECs)进行正常氧及低氧处理,观察细胞的迁移、增殖、凋亡及自噬水平变化;研究β-Arrestins1对低氧诱导的hPAECs的自噬和凋亡的潜在作用,并进一步对其相关信号通路进行初步的研究及分析。方法将hPAECs分别给予正常氧以及低氧24 h、48 h、72 h处理,观察细胞的迁移、增殖、凋亡及自噬水平;进一步干预自噬,探究其对细胞迁移、增殖、凋亡抵抗的影响。进一步通过干预β-Arrestins1来探究其对自噬和凋亡的影响。采用透射电镜检测自噬的形成;光学显微镜观察细胞迁移情况。然后,CCK-8检测hPAECs的增殖情况。同时,TUNEL染色观测hPAECs的凋亡情况。另外,通过Western Blotting检测自噬相关蛋白,例如LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、P62、ATG12-5,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,增殖核心抗原(PCNA)以及信号通路相关蛋白,例如p-akt、akt、p-mtor、mtor、p-p70S6 K、p70S6 K,p-S6、S6的表达。结果与正常氧组相比,低氧使hPAECs出现高增殖及迁移改变,低氧增加了hPAECs的自噬及凋亡抵抗(P<0.05)。另外,低氧抑制β-Arrestins1及VEGFR3的蛋白表达水平(P<0.05)。而且,低氧也下调了akt/mtor信号通路的磷酸化水平(P<0.05)。另外,自噬抑制剂3-MA降低低氧细胞的增殖、迁移及凋亡抵抗(P<0.05)。进一步,我们干预β-Arrestins1后发现敲低β-Arrestins1加重低氧hPAECs的高增殖、迁移及凋亡抵抗;相反,过表达β-Arrestins1改善hPAECs的高增殖、迁移及凋亡抵抗。机制层面,我们发现β-Arrestins1通过akt/mtor信号通路抑制低氧hPAECs的自噬和凋亡抵抗。结论β-Arrestins1可能通过akt/mtor信号通路抑制低氧hPAECs的迁移、增殖、自噬和凋亡抵抗,这可能为肺动脉高压(PAH)的治疗提供了潜在的治疗靶点。

关键词：低氧肺动脉高压人肺动脉内皮细胞(hPAECs) β-Arrestins1 VEGFR3 自噬凋亡 akt/mtor信号通路

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IFN-γ调控MACC1-AS1/MACC1/akt/mtor轴抑制胰腺癌进展的分子机制探索

IFN-γ调控MACC1-AS1/MACC1/AKT/mTOR轴抑制胰腺癌进展的分子机制...

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作者：石小燕广西医科大学

学位级别：硕士

胰腺癌的发病率及死亡率在世界范围内不断上升。近年来多学科的发展及协作模式,胰腺癌诊断水平有所提高。随着腹腔镜技术、机器人等外科手术的发展,立体定向放射治疗等局部治疗手段、各种化疗药物及靶向抗肿瘤药物的应用等,胰腺癌患者... 详细信息

胰腺癌的发病率及死亡率在世界范围内不断上升。近年来多学科的发展及协作模式,胰腺癌诊断水平有所提高。随着腹腔镜技术、机器人等外科手术的发展,立体定向放射治疗等局部治疗手段、各种化疗药物及靶向抗肿瘤药物的应用等,胰腺癌患者的治疗水平也不断进步,但病人长期生存率并未随之发展而明显提高。因此,寻找胰腺癌有效的诊断和新的治疗靶点具有非常重要的意义。IFN-γ是一种多效细胞因子,具有多样的抗肿瘤机制,目前其抗癌作用在许多临床及动物实验中都得到证实。本研究,旨在探讨IFN-γ在胰腺癌发展中的作用及其相关机制,为胰腺癌新的治疗模式提供新思路。第一部分IFN-γ在胰腺癌细胞中的生物学作用及其对MACC1的调控作用目的:干扰素γ(IFN-γ)是一种多效细胞因子,具有促癌及抑癌两面性;文献报道结肠癌转移相关1(MACC1)在多种实体瘤中高表达,与肿瘤生长和侵袭相关,但它们在胰腺癌发生、发展中的作用均尚未阐明。本研究将探讨IFN-γ在人胰腺癌细胞中的生物学作用及是否对MACC1具有调控作用。材料与方法:人胰腺癌细胞(BXPC-3、Capan-1、CFPAC-1)用含有不同浓度梯度的IFN-γ(0、1、10、100 ng/m L)的培养基进行培养,随后收集24小时及48小时的细胞,通过CCK8、Ed U、集落形成实验、Transwell(有或无基质凝胶)和细胞划痕实验检测细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化。通过qRT-PCR及western blot实验检测细胞中MACC1的基因及蛋白表达水平变化。结果:***8、Ed U及集落形成实验结果提示,与对照组相比,IFN-γ明显抑制胰腺癌细胞的增殖能力;细胞划痕实验、Transwell(无基质凝胶)实验结果提示IFN-γ明显抑制细胞的迁移能力;Transwell(有基质凝胶)实验结果提示IFN-γ可以明显抑制细胞的侵袭能力。***-PCR及western blot结果均表明,与对照组相比,IFN-γ组中MACC1的表达水平明显下降,呈浓度及时间梯度依赖性。48小时,100ng/m L的IFN-γ抑制效果最明显。结论:IFN-γ抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并以浓度梯度及时间依赖性抑制MACC1的表达。第二部分体外探索IFN-γ通过MACC1-AS1/MACC1轴抑制胰腺癌的分子机制目的:在第一部分研究基础上,本部分通过慢病毒转染、si RNA及体外功能实验等探索IFN-γ在胰腺癌中激活的下游信号通路。材料与方法:1.用IFN-γ(100 ng/m L)干预CFPAC-1、Capan-1和BXPC-3细胞株48小时,用qRT-PCR检测IFN-γ组和对照组中MACC1、MACC1-AS1的基因水平变化,用western blot检测两组中的MACC1、akt、p-akt、m TOR、p-m TOR蛋白水平的变化。2.通过慢病毒转染构建MACC1-AS1过表达的稳转株,qRT-PCR检测过MACC1-AS1基因转染后的表达变化以验证转染效率。3.通过qRT-PCR检测IFN-γ组、IFN-γ+MACC1-AS1过表达组、MACC1-AS1过表达组及对照组中的MACC1表达情况。Western blot检测上述各组细胞中的MACC1、akt、p-akt、m TOR、p-m TOR蛋白水平的变化。4.用si MACC1敲减CFPAC-1、BXPC-3细胞中MACC1表达水平,通过qRT-PCR、western blot进行验证敲减效率并筛选出效果最好的si RNA用于后续实验。用si RNA敲减MACC1-AS1过表达细胞中的MACC1,qRT-PCR检测si MACC1组、si MACC1+MACC1-AS1过表达组、对照组中MACC1的基因水平表达情况。通过western blot检测MACC1、akt、pakt、m TOR、p-m TOR蛋白水平变化。5.通过Ed U、集落形成实验检测si MACC1组、si MACC1+MACC1-AS1过表达组和对照组的细胞增殖能力变化。应用细胞划痕实验、Transwell实验分别检测细胞的迁移、侵袭能力变化。结果:***-PCR实验结果显示:与对照组相比,IFN-γ处理组(100 ng/m L)中MACC1、MACC1-AS1的基因表达水平明显下调;Western blot结果显示IFN-γ组中的MACC1、p-akt、p-m TOR蛋白水平较对照组明显降低。2.通过慢病毒转染的方法成功构建了MACC1-AS1过表达的稳转株,MACC1-AS1表达水平较对照组显著升高。3.与对照组相比,IFN-γ明显下调MACC1表达水平,同时减弱MACC1-AS1过表达诱导的MACC1表达,并伴随p-akt、p-m TOR表达水平降低。4.沉默MACC1可失活akt/

关键词： IFN-γ 胰腺癌 MACC1 MACC1-AS1 akt/mtor信号通路

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PGRN在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及其机制的研究

PGRN在上皮性卵巢癌发生发展中的作用及其机制的研究

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作者：潘文莹山东大学

学位级别：硕士

研究背景：最新癌症调查报告显示：2000-2011年之间,卵巢癌在国内癌症相关死亡率中位于第二位,仅次于乳腺癌,居于生殖系统首位。其中,上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)占所有卵巢癌的90%。目前,上皮性卵巢癌主要的治疗方法... 详细信息

研究背景：最新癌症调查报告显示：2000-2011年之间,卵巢癌在国内癌症相关死亡率中位于第二位,仅次于乳腺癌,居于生殖系统首位。其中,上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)占所有卵巢癌的90%。目前,上皮性卵巢癌主要的治疗方法是肿瘤细胞减灭术,并辅以铂类为主的化疗,但是其五年生依旧为30%左右。主要是因为目前对于卵巢癌缺乏有效的筛查手段,以至于大部分卵巢患者初诊时已发生远处、多发转移,处于临床晚期。现已证实恶性肿瘤发生远处转移与肿瘤细胞获得侵袭、浸润能力密切相关,因此,阐明上皮性卵巢癌发生、发展过程中的分子改变,以及探讨上皮性卵巢癌细胞获得浸润、转移能力的机制对于上皮性卵巢癌的早期诊断、治疗以及预后有着重要的意义。颗粒蛋白前体(PGRN)是上世纪90年代初发现的一种分泌性生长因子,又称granulin/epithelin precursor(GEP)、proepithelin(PEPI)、PC cells-derived growth factor (PCDGF)或acrogranin,可在不同组织中提取,根据提取组织的不同给予不同命名。颗粒蛋白前体编码大小为68.5 kDa的蛋白,高度糖基化的PGRN蛋白分子量为90-kDa。颗粒蛋白前体具有多种生物学功能,在炎症反应、胚胎发育、损伤修复、神经营养及胰岛素抵抗等方面发挥重要作用。此外,在多种肿瘤中PGRN表达上调,与乳腺癌、肝癌、宫颈癌、肾上腺癌等肿瘤的增殖、耐药、侵袭转移及肿瘤干细胞特性密切相关,这些生物学过程中可有PI3K/akt,ERK等信号通路分子的参与。此外,还有研究证实,颗粒蛋白前体可上调GSK3β及cyclinD1,进而参与一系列生物学过程。最近有研究报道颗粒蛋白前体的表达水平与肿瘤的预后密切相关,可以作为预测肿瘤患者预后的关键指标。上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)可以使上皮细胞获得间质细胞的表型,赋予细胞侵袭、转移的能力,在肿瘤的发生、发展过程中起着举足轻重的作用。目前,颗粒蛋白前体对上皮性肿瘤细胞发生上皮间充质转化方面的影响尚未见报道,其影响及其作用机制需要进一步阐述。目的：1.研究颗粒蛋白前体在良性上皮性卵巢肿瘤、上皮性卵巢癌中的表达差异；2.研究颗粒蛋白前体对上皮性卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响；3.研究颗粒蛋白前体在上皮性卵巢癌细胞发生上皮间充质转化方面的影响,在蛋白水平检测颗粒蛋白前体过表达前后,上皮间充质转化相关分子的表达变化。4.探讨颗粒蛋白前体促进上皮性卵巢癌发生上皮间充质转化的分子机制。方法：1.利用免疫组织化学的方法检测在良性上皮性卵巢肿瘤组织(34例)与上皮性卵巢癌组织(42例)中,颗粒蛋白前体是否存在表达差异：并且探讨在上皮性卵巢癌中颗粒蛋白前体与Snail的表达是否具有相关性。2.应用慢病毒转染的方法,构建稳定过表达PGRN的上皮性卵巢癌细胞系(A2780、HO8910);应用CCK8试剂盒检测颗粒蛋白前体对细胞增殖能力的影响；应用transwell、室的方法检测颗粒蛋白前体对细胞迁移、侵袭能力的影响。3.利用Western Blot的方法,在蛋白水平检测在上皮性卵巢细胞中过表达颗粒蛋白前体后上皮表型标志物(E-cadherin、ZO-1),间质表型标志物(N-cadherin、Vimentin、Slug、Snail)的表达变化。4.利用Western Blot的方法,在蛋白水平检测在上皮性卵巢细胞中过表达颗粒蛋白前体后Wnt/β-catenin、akt/mtor信号通路的活化状态。结果：1.免疫组化结果显示：上皮性卵巢癌组的免疫组化染色评分为3.2941±1.0317,上皮性卵巢癌组的免疫组化评分为8.5500±0.7014,统计学分析发现上皮性卵巢癌中颗粒蛋白前体的表达显著高于良性上皮性卵巢肿瘤p<0.01)；并且在上皮性卵巢癌中,颗粒蛋白前体的表达与Snail的表达呈正相关p<0.001)。2.在上皮性卵巢癌细胞(A2780、H08910)中过表达颗粒蛋白前体后,与对照组相比,细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著增高(p<0.05),说明颗粒蛋白前体增强了上皮性卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。3.在上皮性卵巢癌细胞(A2780、H08910)中过表达颗粒蛋白前体后,与对照组相比,上皮表型标志物(E-cadherin、 ZO-1)的表达显著下调,间质表型标志物(N-cadherin、Vimentin)及调节上皮间质转化的转录因子(Snail及Slug)的表达明显上调,说明PGRN促进上皮性卵巢癌细胞由上皮表型向间质表型转化。4.在上皮性卵巢癌细胞(A2780、HO8910)中过表达颗粒蛋白前体后,与对照组相比,β-catenin表达

关键词：颗粒蛋白前体上皮性卵巢癌上皮间充质转化 Wnt/β-catenin信号通路 akt/mtor信号通路

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mtor通路抑制剂GDC-0349对急性T淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞增殖和凋亡的作用及机制研究

mTOR通路抑制剂GDC-0349对急性T淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞增殖...

引用

作者：李川中国医科大学

学位级别：硕士

目的:急性T淋巴细胞白血病(Acute T lymphocytic leukemia,T-ALL)是骨髓内T淋巴细胞异常增殖的恶性肿瘤。尽管化疗缓解率可达80%,但仍有50%患者复发,因此急性T淋巴细胞白血病的治疗仍是一大难题,寻找高效及高特异性的治疗药物也成为近... 详细信息

目的:急性T淋巴细胞白血病(Acute T lymphocytic leukemia,T-ALL)是骨髓内T淋巴细胞异常增殖的恶性肿瘤。尽管化疗缓解率可达80%,但仍有50%患者复发,因此急性T淋巴细胞白血病的治疗仍是一大难题,寻找高效及高特异性的治疗药物也成为近年来的研究热点。PI3K/akt/mtor信号通路异常激活可引起T细胞的分化异常以及白血病干细胞形成,从而诱导急性T淋巴细胞白血病的发生。GDC-0349是mtor信号通路的ATP竞争性抑制剂,能阻断mtorC1和mtorC2活化,诱导细胞凋亡。目前GDC-0349在急性T淋巴细胞白血病中的作用尚未见报道。因此本研究的目的是明确GDC-0349对急性T淋巴细胞白血病细胞系CCRF-CEM细胞的增殖和凋亡的影响及其作用机制。研究方法:1、急性T淋巴细胞白血病细胞株CCRF-CEM细胞培养;2、CCK8法检测0.1%DMSO和10、25、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞12、24、48及72h后CCRF-CEM细胞的增殖活性;3、AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测0.1%DMSO和10、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后的细胞凋亡率;4、Western blot检测0.1%DMSO和10、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后凋亡相关蛋白Bcl2、Caspase3及Cleaved Caspase3的表达情况;5、Western blot检测0.1%DMSO和10、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后akt/mtor通路相关蛋白akt、p-akt、mtor、p-mtor及4EBP1的表达情况;6、统计方法:所有数据均以均数±标准差来表示。使用SPSS 22.0分析软件进行统计学分析,独立样本t检验分析两样本均数的差异,One-way Anova方法分析多组均数的差异,P<0.05认为具有统计学差异。结果:1、0.1%DMSO和10、25、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞12、24、48及72h后,结果显示GDC-0349对CCRF-CEM细胞增殖具有抑制作用,并呈时间剂量依赖性,组间比较具有显著差异(P<0.05);2、0.1%DMSO和10、25、50及100μM浓度的GDC-0349分别培养CCRF-CEM细胞48 h后,加入AnnexinⅤ-FITC/PI双染,应用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示GDC-0349促进CCRF-CEM细胞凋亡,并呈浓度依赖性。细胞凋亡率分别为(8.74±3.23)%、(13.84±2.48)%、(19.66±1.73)%及(35.98±5.87)%。各组的凋亡率与对照组比较均具有统计学差异(P<0.05);3、Western blot结果显示GDC-0349(浓度为10、50及100μM)促进细胞凋亡,随着浓度增加,凋亡蛋白Caspase3表达和抗凋亡蛋白BCL2逐渐减少,Cleaved Caspase3逐渐增多(P<0.05);4、Western blot结果显示CCRF-CEM细胞加入GDC-0349(浓度为10、50及100μM)培养48h后,akt/mtor通路相关蛋白akt、mtor、4EBP1及磷酸化蛋白p-akt和p-mtor均逐渐减少,呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:1、mtor通路抑制剂GDC-0349能够抑制CCRF-CEM细胞增殖,并呈时间及浓度依赖性;2、mtor通路抑制剂GDC-0349能够促进CCRF-CEM细胞凋亡,并呈浓度依赖性;3、mtor通路抑制剂GDC-0349通过抑制akt/mtor通路相关蛋白的磷酸化来抑制CCRF-CEM细胞的增殖和促进其凋亡。

关键词： mtor通路抑制剂 GDC0349 增殖凋亡分子机制 akt/mtor信号通路

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