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112 篇 中文

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牙龈卟啉单胞菌下调BMAL1诱导血管内皮间充质转化的实验研究

牙龈卟啉单胞菌下调BMAL1诱导血管内皮间充质转化的实验研究

引用

作者：马亦薇中国医科大学

学位级别：硕士

目的:内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)是内皮细胞发生转化,失去内皮细胞的功能和特征,转而获得间充质细胞的功能和特征的过程。多种系统性刺激,如炎症、缺氧、氧化应激等,都可以诱导EndMT的发生。牙龈卟... 详细信息

目的:内皮间充质转化(endothelial-to-mesenchymal transition,EndMT)是内皮细胞发生转化,失去内皮细胞的功能和特征,转而获得间充质细胞的功能和特征的过程。多种系统性刺激,如炎症、缺氧、氧化应激等,都可以诱导EndMT的发生。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,***)被认为是慢性牙周炎的重要病原体,它与包括动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)在内的多种系统性疾病密切相关。目前有少量研究发现,***感染可以促进血管内皮细胞发生EndMT,破坏血管内皮稳态,从而促进AS的发生。但***具体通过何种途径诱导EndMT发生,其潜在机制尚不明确。此外,有研究发现***可以抑制内皮细胞中脑和肌肉arnt样蛋白-1(brain and muscle Arnt-like protein-1,BMAL1)的表达,进而加重氧化应激和炎症反应。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,bmps)是调控EndMT的通路之一,也可以由炎症反应所激活。本研究拟在探索***感染是否通过下调BMAL1影响EndMT进程,以及bmp信号通路在EndMT中的作用,旨在为***促进AS病变的研究提供新思路。方法:1.验证***感染导致血管内皮细胞发生EndMT以及BMAL1表达下调。实验分组:***926细胞分为control组、*** ATCC33277(MOI=500)组、*** W83(MOI=500)组和LPS(4 mg/m L)组。培养72 h后,倒置荧光镜下观察细胞形态变化。免疫荧光染色双标实验检测细胞表面内皮标记物CD31和间充质标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化。蛋白印迹法检测CD31、CD144、α-SMA、波形蛋白(VIMENTIN),以及BMAL1的表达变化。2.通过沉默和过表达Bmal1基因来验证Bmal1对***感染诱导的EndMT的作用。实验分组:Negative control组、Bmal1基因沉默组、***感染Negative control组、***感染Bmal1基因沉默组、***感染空白质粒组和***感染Bmal1基因过表达组。采用蛋白印迹法检测CD31、CD144、α-SMA、VIMENTIN表达的变化。3.验证BMAL1表达对bmp通路的影响。实验分组同前。RT-PCR检测bmp配体的激活情况,蛋白印迹法检测bmp信号下游p-SMAD1/5的蛋白表达。4.利用bmpⅠ型受体抑制剂LDN-193189阻断bmp信号通路来验证其参与调控***感染诱导的EndMT过程。实验分组:***+DMSO(0.5μL/m L)组和***+LDN-193189(0.5μM)组。用蛋白印迹法检测CD31、CD144、VIMENTIN的变化。数据采用均数±标准差(mean±SD)的方式来表示,并用SPSS 27.0软件进行数据分析。当P<0.05时,认为差异具有统计学意义。结果:*** ATCC33277组、*** W83组和LPS组细胞在刺激72 h后,形态发生变化,由鹅卵石样变为纺锤状。内皮细胞标记物CD31、CD144表达降低,间充质细胞标记物α-SMA、VIMENTIN表达增加。同时BMAL1表达降低(P<0.05)。***1基因沉默组和***感染Bmal1基因沉默组细胞均发生EndMT,CD31、CD144表达降低,α-SMA、VIMENTIN表达增加。而过表达Bmal1减弱***诱导的EndMT,即CD31、CD144表达增加,α-SMA、VIMENTIN表达降低(P<0.05)。3.沉默Bmal1后,bmp2、bmp4、bmp9 m RNA表达水平增加,p-SMAD1/5表达也增加。***感染Bmal1沉默细胞进一步加重了bmp2、bmp4、bmp9 m RNA和p-SMAD1/5表达的增加。而过表达Bmal1抑制***对bmp通路的激活,即bmp2、bmp4、bmp9m RNA表达水平降低,p-SMAD1/5表达降低(P<0.05)。4.用LDN-193189预处理***926细胞以阻断bmp信号通路,再用***感染,CD

关键词：牙龈卟啉单胞菌内皮间充质转化生物钟基因Bmal1 bmp信号通路动脉粥样硬化

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小鼠闭合型骨折模型的建立与Smurf1抑制剂对骨折愈合的作用研究

小鼠闭合型骨折模型的建立与Smurf1抑制剂对骨折愈合的作用研究

引用

作者：王小璐军事科学院

学位级别：硕士

骨折作为高发性的创伤疾病,严重影响人们的日常生活。目前临床上采用的治疗方法主要包括骨移植、物理辅助性疗法、全身注射甲状旁腺激素以及局部注射人源重组bmp等。尽管经过治疗,绝大多数骨折患者可以愈合,但由于骨折处血液供应减弱、... 详细信息

骨折作为高发性的创伤疾病,严重影响人们的日常生活。目前临床上采用的治疗方法主要包括骨移植、物理辅助性疗法、全身注射甲状旁腺激素以及局部注射人源重组bmp等。尽管经过治疗,绝大多数骨折患者可以愈合,但由于骨折处血液供应减弱、骨折断端活动性强、骨膜受损、受伤部位感染等,每年仍有5%-10%的患者无法愈合。bmps是从骨基质中分离提纯的一类能高效诱导骨、软骨组织发生的酸性糖蛋白,在胚胎发生、个体形成,尤其是在骨和软骨的修复过程中具有重要作用。目前,人源重组bmp-2(rh bmp-2)是用于骨折治疗、脊柱融合和种植牙愈合的最有效的生长因子。但其提纯困难,导致使用rh bmp-2治疗成本高昂,并且局部注射易产生异位骨形成、天然骨吸收、软组织肿胀和溶骨等不良作用,因此,FDA仍未批准其在儿童、孕妇和荷瘤患者中的应用。由于在临床应用中直接使用rh bmp-2存在天然障碍,因此靶向bmp信号通路的增敏剂作为间接降低rh bmp-2治疗成本的新方法可能会在未来中占有重要的地位。泛素连接酶Smurf1作为骨的负调控因子通过拮抗bmp信号通路以降低其信号活性。前期实验室建立了基于计算机模拟对接E3拮抗剂筛选的新方法,筛选出了可以抑制Smurf1的小分子化合物A01和A17,并在细胞水平上证明了靶向Smurf1以增强bmp信号通路作为药物靶点的可行性。本研究的目的是对前期结果做更深入的研究,利用小鼠骨折模型探究Smurf1抑制剂A01、A17在动物水平上对骨形成是否有促进作用。我们创新发明了针对小鼠骨骼的骨折造模仪,优化了髓内针固定的手术方案,并确立小鼠愈后的评估标准。使用新型骨折造模仪将120g重物从200mm高处下落可以在不伤及小鼠皮肤及肌肉的情况下,对其股骨干造成横行或斜行断端,骨折造模成功率高;术后我们使用X-ray、Micro-CT等临床方法检查小鼠骨折愈合情况,并通过骨痂染色、m RNA检测软骨特异性基因表达等生物学方法分析愈合过程,结果显示小鼠愈合方式为典型的软骨内成骨,该模型可以作为模拟人类骨折愈合的标准模型。在药效评价方面,我们对术后3d的骨折小鼠进行灌胃处理,在骨折后28d采用三点弯曲的方式评估其生物力学的恢复状况,以此作为药效评价的第一标准。并在骨折后标志性时间点(14d、28d)对实验小鼠进行Micro-CT、骨密度扫描等分析,以此来评估骨折小鼠的恢复状况,分析Smurf1抑制剂A01、A17在骨折愈合不同时期中的作用。结果显示:在骨折后28d用药组(A01、A17组)小鼠骨折部位的生物力学强度以及峰值负荷更高;在骨折后14d和28d时,用药组小鼠的骨矿物质密度(BMD)要明显高于对照组;Micro-CT结果也显示用药组在骨折后14d时骨痂要小于对照组,且其形成新骨的比例高于对照组;骨折后28d时用药组的骨痂大小与对照组无显著差异,但其矿化骨的比例要明显高于对照组。因此,以上结果表明Smurf1抑制剂A01和A17对于骨折小鼠的生物力学恢复有促进作用,其原因可能是由于促进了愈合过程中新骨的形成以及矿化骨的沉积。虽然目前促进骨折愈合的疗法不胜枚举,但靶向泛素-蛋白酶体的药物和通过靶向拮抗细胞内效应蛋白的药物还未曾应用到这骨折的治疗之中,我们的实验结果为这一方案提供了有力的数据,证明靶向泛素连接酶Smurf1以促进骨折愈合的可行性。

关键词：股骨骨折骨折愈合软骨内成骨 bmp信号通路小鼠 Smurf1抑制剂

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笠贝背腹轴基因调控网络的初步解析

笠贝背腹轴基因调控网络的初步解析

引用

作者：崔梦露中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

学位级别：硕士

背腹轴形成是两侧对称动物早期发育过程中的重要事件之一。一般认为,bmp信号通路在背腹轴形成过程中具有重要调控作用,这种机制在多种动物中均已得到了验证。然而,不同动物中的背腹轴决定机制存在多样性,呈现出较强的可塑性。作为两侧... 详细信息

背腹轴形成是两侧对称动物早期发育过程中的重要事件之一。一般认为,bmp信号通路在背腹轴形成过程中具有重要调控作用,这种机制在多种动物中均已得到了验证。然而,不同动物中的背腹轴决定机制存在多样性,呈现出较强的可塑性。作为两侧对称动物的三个主要分支之一,冠轮动物中存在多种背腹轴调控机制,是研究动物背腹轴形成机制保守性和可塑性的理想对象。同时,对冠轮动物背腹轴形成机制的研究也是理解这一大类动物发育和演化的关键环节。本课题组前期研究发现,在腹足纲软体动物笠贝(Lottia goshimai)的背腹轴形成过程中,bmp2/4和chordin起关键的调控作用。但同时也发现,抑制chordin后的胚胎虽然早期阶段完全失去背腹轴,但会随着发育部分恢复背腹极性,提示其他基因协同调控了背腹轴形成过程。基于此研究现状,有必要对笠贝的背腹轴调控网络进行进一步探索,以更加深刻的理解笠贝背腹轴形成的分子机制。本研究以笠贝为研究对象,利用扫描电镜和原位杂交手段,从形态学水平和分子水平系统展示了背腹轴的形成过程;鉴定了部分bmp信号调节基因并分析了它们的时空表达模式,解析了与背腹轴形成的关联关系;最后对部分基因进行了RNAi抑制实验,探索其在背腹轴形成中的功能。主要结果如下:1.通过扫描电镜观察和原位杂交实验,系统分析了笠贝早期胚胎的变化过程,从形态学水平和分子水平上详细展示了背腹轴的形成过程。笠贝胚胎在3.5hpf左右进入原肠作用阶段,细胞剧烈运动,背腹轴随之形成。8hpf后原肠作用基本结束,担轮幼虫特征性结构(壳区和胚孔)开始形成,进入担轮幼虫阶段。在这一时期内(3.5hpf～8hpf),标记基因gata2/3和soxb表达范围的变化指示了背腹侧不同类型细胞群体随着发育不断运动的过程。2.通过序列比对和系统发育分析,鉴定了6个可能参与背腹轴形成的基因:admp、bmp5-8、gremlin、tolloid、bambi和nogginb。分析这些基因的时空表达规律,发现以下特点:首先,不同基因出现不对称表达模式的时间不同:bambi、gremlin持续不对称表达;tolloid、bmp5-8早期广泛表达,晚期不对称表达;admp在早期没有表达,在晚期不对称表达;nogginb一直没有表达。其次,不同基因表达于不同的类型组织:bambi,gremlin,tolloid在背侧类型组织中表达,bmp5-8在腹侧类型组织中表达,admp倾向于在背腹交际处表达。有意思的是,即使是表达于相同类型的组织,这些基因的表达区域也不同(如tolloid和gremlin),这种差异提示存在多个细胞群体与背腹轴形成相关。3.初步的功能实验证实gremlin和tolloid在笠贝背腹轴形成中具有调控作用。通过RNAi抑制两个基因的功能后,都会使笠贝胚胎的形态与标记基因的表达出现异常。具体而言,抑制gremlin后,幼虫身体拉长、腹侧特征性凹陷变平,标记基因表达位置迁移至身体后部。抑制tolloid则似乎使幼虫停滞于较早期的形态,标记基因表达在底部,且近乎辐射对称。这些结果均提示胚胎的背腹轴形成受到了严重干扰,两个基因都对背腹轴形成过程具有调控作用。两种突变表型的差异提示gremlin和tolloid的作用方式存在差异。结合其分子性质和表达部位,推测tolloid可能直接调控bmp信号,而gremlin则有可能通过间接方式发挥作用。综上所述,本研究展示了笠贝背腹轴的形成过程,揭示了背腹轴形成中信号网络的更多细节。综合现有研究基础及本研究的结果,基于原位表达和功能实验(MO、RNAi),初步描绘了笠贝背腹轴形成的分子作用网络。该网络包含bmp2/4、chordin、admp、bmp5-8、gremlin、tolloid、bambi共七个基因,存在多个调控节点。在拓扑结构上与其他动物存在相似性,但在admp、bmp5-8、gremlin等节点上存在自身的特点。该网络为进一步解析基因功能提供了基础支持,为探究冠轮动物中背腹轴决定机制提供了重要信息。

关键词：笠贝 bmp信号通路背腹轴发育基因调控网络

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ACVR1在磨牙牙根形成中的作用研究

ACVR1在磨牙牙根形成中的作用研究

引用

作者：刘苍维吉林大学

学位级别：硕士

研究目的:牙根在承受、传递和分散咀嚼压力等方面具有重要作用。牙根短小、牙根缺如等短根疾病可导致牙早失,影响患者的发音、美观和咀嚼功能,严重危害患者的身心健康。牙根牙本质由成牙本质细胞形成,是牙根的主体结构,因此,探究牙根牙... 详细信息

研究目的:牙根在承受、传递和分散咀嚼压力等方面具有重要作用。牙根短小、牙根缺如等短根疾病可导致牙早失,影响患者的发音、美观和咀嚼功能,严重危害患者的身心健康。牙根牙本质由成牙本质细胞形成,是牙根的主体结构,因此,探究牙根牙本质的形成机制,对阐明牙根发育的分子机理、预防由于牙根过短导致的牙早失具有重要意义。已有研究报道bmp（bone morphogenetic proteins,bmps）信号通路及相关转录调节因子参与牙根发育的多个步骤,但其在牙根牙本质形成的作用及机制尚不明确。因此,本课题利用条件性基因敲除小鼠模型,探究I型bmp受体ACVR1介导的bmp信号在牙根成牙本质细胞分化及牙根牙本质形成中的重要作用,为临床治疗牙根发育性疾病及牙根再生提供新思路和新靶点。研究方法:1、在成牙本质细胞中特异性敲除Acvr1基因。收集持续喂养普通饲料的出生后5天含报告基因的转基因小鼠下颌骨;收集自合笼检栓开始喂养含多西环素饲料并于出生当天更换为普通饲料的出生后7天含报告基因的转基因小鼠下颌骨。通过荧光显微镜观察报告基因表达位置,间接反映Cre重组酶的活化位置。2、收集出生后42天的对照组(Osterix-Cre;Acvr1 fx/+)小鼠和Acvr1条件性基因敲除(Osterix-Cre;Acvr1 fx/-)小鼠的下颌骨,固定后,经micro-CT扫描测量下颌第一磨牙牙根长度;收集出生后14天/21天/42天的对照组小鼠和Acvr1条件性基因敲除小鼠的下颌骨,固定后,脱钙、脱水、石蜡包埋及矢状面切片,获得小鼠下颌第一磨牙矢状面连续切片。通过HE染色分别测量牙根发育不同时期（出生后14天/21天/42天）对照组小鼠和Acvr1条件性基因敲除小鼠的下颌第一磨牙牙根长度,明确ACVR1是否可引起短根。通过免疫组织化学染色,检测出生后14天和出生后42天对照组小鼠和Acvr1条件性基因敲除小鼠的下颌第一磨牙DSP/DMP1/BSP的表达水平,探究ACVR1对牙根牙本质的形成和成牙本质细胞的分化的作用。通过天狼星红染色,检测出生后42天对照组小鼠和Acvr1条件性基因敲除小鼠的下颌第一磨牙胶原的形成,确定ACVR1对成牙本质细胞胶原形成能力的影响。研究结果:1、报告基因表达于出生后的成牙本质细胞中,提示Osterix-Cre在这些细胞中被活化,因此间接确定Acvr1基因可在出生后的成牙本质细胞内被敲除。2、成牙本质细胞内Acvr1基因特异性敲除导致小鼠下颌第一磨牙牙根变短且牙根牙本质形成异常。Micro-CT扫描结果示,与对照组相比,出生后42天的Acvr1基因敲除组小鼠下颌骨短小、牙根变短、根管壁变薄。HE染色结果显示,成牙本质细胞内Acvr1基因特异性敲除后,与对照组相比,出生后14天/21天42天的Acvr1基因敲除组小鼠下颌第一磨牙牙根变短,出生后42天时,可见牙根有骨样牙本质形成。3、成牙本质细胞内Acvr1基因特异性敲除导致牙根成牙本质细胞成牙向分化下降,进一步影响胶原的分泌和形成。免疫组织化学染色结果发现,同对照组相比,Acvr1基因敲除组小鼠在出生后14天,临近根分叉处的成牙本质细胞内的DSP、DMP1和BSP的表达均未见明显差异,但在出生后42天DSP表达降低、DMP1表达有降低趋势,嵌入骨样牙本质内的细胞甚至无DMP1的表达,但BSP的表达未见明显差异。天狼星红染色可见,出生后42天,Acvr1基因敲除组小鼠磨牙牙根牙本质胶原纤维呈黄色和绿色,而且排列紊乱、甚至呈不光滑的毛刺样突起突入髓腔内。这说明Acvr1基因敲除小鼠牙根牙本质以较为细小的尚未完全成熟的胶原纤维为主。研究结论:1、I型bmp受体ACVR1促进成牙本质细胞的成牙向分化。2、I型bmp受体ACVR1促进磨牙牙根牙本质有序形成。

关键词： bmp信号通路 ACVR1 牙根牙本质成牙本质细胞

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利用CRISPR/Cas9技术构建Smad1-HA-Tag小鼠及SMAD1-HA-Tag人牙间充质细胞培养体系

利用CRISPR/Cas9技术构建Smad1-HA-Tag小鼠及SMAD1-HA-Tag人牙间...

引用

作者：卢冰冰福建师范大学

学位级别：硕士

已有研究表明,bmp信号通路在通过上皮和间充质相互作用而发育的器官形成中起着重要的作用。最新的研究发现bmp信号途径在牙齿发育中存在着一种不同于bmp/Smad经典信号途径和bmp非经典信号途径的新的调控方式,称为非典型bmp经典信号途径... 详细信息

已有研究表明,bmp信号通路在通过上皮和间充质相互作用而发育的器官形成中起着重要的作用。最新的研究发现bmp信号途径在牙齿发育中存在着一种不同于bmp/Smad经典信号途径和bmp非经典信号途径的新的调控方式,称为非典型bmp经典信号途径。在非典型bmp经典信号通路中,pSmad1/5/8复合物不依赖Smad4,而与未知的互作蛋白结合入核调控牙齿发育相关基因的表达。解析pSmad1/5/8是与哪种互作蛋白相互作用,目前主要的技术手段是通过亲和纯化技术分离纯化鉴定互作蛋白,由于抗体的特异性和为了能有效高纯度的分离互作蛋白,本课题选用对靶蛋白空间结构影响小且易于检测的亲和标签蛋白HA;并且研究发现在pSmad1/5/8复合物中,Smad1是主要的入核基因;因此本实验利用CRISPR/Cas9技术在不影响Smad1蛋白表达的基础上,分别在小鼠Smad1基因的3'端终止密码子前和人类SMAD1基因的5'端起始密码子后插入HA标签蛋白基因序列,实现HA蛋白与pSmad1/5/8蛋白共表达,从而为后期分离纯化互作蛋白提供实验材料。利用CRISPR/Cas9技术将外源基因敲入基因组的系统中,需要Cas9蛋白、特异识别的sgRNA和带外源基因的同源重组片段donor。为了验证设计的sgRNA和donor的可行性,本实验首先在细胞水平上进行验证实验。在小鼠Smad1基因的终止密码子附近设计2个sgRNA,并构建带有目的sgRNA序列的CRISPR质粒,检测sgRNA的切割效率,实验结果表明2个sgRNA都能准确有效的对Smad1基因进行切割。进一步在Smad1终止密码子前设计带HA标签蛋白基因序列的同源重组片段donor,与sgRNA共转染NIH3T3细胞,实验结果表明HA序列正确插入到Smad1终止密码子前,并与pSmad1/5/8蛋白融合表达。将在细胞水平上验证成功的Smad1 sgRNA和donor与Cas9蛋白共同通过原核显微注射到小鼠受精卵中,实验结果表明成功获得了在Smad1终止密码子前插入HA序列的遗传修饰小鼠。同时,本实验利用CRISPR/Cas9技术成功建立了 SMAD1-HA-Tag人牙间充质细胞培养体系。在人类SMAD1基因起始密码子附近设计3个sgRNA,并构建带有目的sgRNA序列的CRISPR质粒,将质粒分别转染到HEK293T细胞中,对3个sgRNA的切割情况以及脱靶效率进行了检测。实验结果筛选到2个切割效率高,脱靶率低的sgRNA(sgRNA1和sgRNA3)。进一步在SMAD1起始密码子后设计带HA标签蛋白的同源重组片段donor,分别与sgRNA1/3共转染人牙间充质细胞,筛选正确插入HA基因序列的细胞,成功获得在SMAD1起始密码子后正确的插入了 HA基因序列、并与pSmad1/5/8蛋白融合表达的细胞。综上所述,本实验成功构建了 Smad1-HA-Tag遗传修饰小鼠;并建立了SMAD1-HA-Tag人牙间充质细胞培养体系。为后期研究pSmad1/5/8的互作蛋白提供了材料,为解释和阐明新发现的非典型bmp经典信号途径的作用机理奠定基础。

关键词： bmp信号通路 CRISPR/Cas9 Smad1 HA标签蛋白

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肝星状细胞对脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化的影响

肝星状细胞对脂肪间充质干细胞向内皮细胞分化的影响

引用

作者：周春光温州医科大学

学位级别：硕士

目的：通过大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)与大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，rADSCs)在内皮细胞分化诱导培养基中的共培养，观察HSCs对rADSCs向内皮细胞(endothelial cells，ECs)分化的影响和rADSCs向ECs分化过程中bmp信号通路的活化情况。<br>　　方法：共培养实验设置四组，阳性对照组、实验组、阴性对照组和空白对照组。诱导培养2周后，利用多细胞共培养技术、CCK8法、流式细胞技术、免疫荧光技术、Western blotting法、细胞迁移试验、低密度脂蛋白吞噬试验和体外成血管试验等研究技术观察检测各组rADSCs向ECs的分化情况和rADSCs向ECs分化过程中bmp信号通路的活化情况。<br>　　结果：诱导2周后，三组rADSCs细胞体积逐渐变小变圆，部分细胞出现典型的内皮细胞鹅卵石样改变;四组细胞vWF、VE-Cadherin和表达均阳性;Western blotting检测结果与免疫荧光结果一致，实验组eNOS蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);内皮细胞迁移试验显示，实验组每视野下细胞迁移数目明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01);低密度脂蛋白吞噬试验显示，实验组细胞吞噬DiI-Ac-LDL的能力明显高于空白对照组(P＜0.05);体外成血管试验显示实验组细胞体外成血管的能力明显高于其他三组细胞——阳性对照组(P＜0.05)、阴性对照组和空白对照组(P＜0.01)。bmp信号通路检测结果显示，实验组细胞bmp4表达水平和Smad1/5蛋白磷酸化水平明显高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.01);而在bmp4信号通路被Noggin抑制后，实验组细胞Smad1/5蛋白磷酸化水平显著降低(P＜0.05)。<br>　　结论：HSCs可以通过促进bmp4蛋白表达，上调SMAD1/5蛋白磷酸化水平激活bmp信号通路，从而促进rADSCs向ECs分化，并增强分化后ECs的功能。利用共培养体系对多种细胞共培养时进行生长分化现象的观察及其相互影响机制的研究，可以为组织工程功能性血管化组织器官及其生物模拟物的设计和创造提供更加可靠的理论指导和更加广阔的研究策略。

关键词：脂肪间充质干细胞内皮细胞细胞分化肝星状细胞 bmp信号通路

来源：评论

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利用原位杂交技术研究H1N1流感病毒对心脏发育基因的影响

利用原位杂交技术研究H1N1流感病毒对心脏发育基因的影响

引用

作者：谭智勇湖南师范大学

学位级别：硕士

先天性心脏病是一类严重威胁人类健康的疾病,遗传因素和环境因素是导致先天性心脏病的主要原因。在过去的几十年里,人们对导致先天性心脏病的研究取得了极大的进展,但对先天性心脏病的致病机制还是了解不多,尤其是环境因子影响心脏发育... 详细信息

先天性心脏病是一类严重威胁人类健康的疾病,遗传因素和环境因素是导致先天性心脏病的主要原因。在过去的几十年里,人们对导致先天性心脏病的研究取得了极大的进展,但对先天性心脏病的致病机制还是了解不多,尤其是环境因子影响心脏发育更是知之甚少。已有研究证明怀孕早期宫内病毒感染是最重要的环境因子之一。而临床流行病学调研表明有15种病毒的早期宫内感染可能与先天性心脏病的发生有关,但尚未有实验证明两者之间的关系。因此研究流感病毒对心脏发育相关基因的影响具有重要的意义。本课题以SPF级纯种KM小鼠为实验动物,通过建立稳定感染的H1N1流感病毒小鼠模型,以形态观察和原位杂交为主要手段,并以bmp信号途径为研究对象,从基因表达水平验证分析了bmp信号途径成员及部分心脏标志基因的表达变化。本论文获得主要研究结果如下:1、根据小鼠胚胎心脏的发育时间,在怀孕第7.5天进行攻毒,构建了H1N1流感病毒感染小鼠模型。对病毒感染怀孕小鼠胚胎及其对照进行了形态学观察研究,发现病毒感染组胚胎发育延缓,心脏发育异常。2、原位杂交检测bmp信号通路相关基因,发现在病毒感染胚胎中bmp4/5/7和BAMBI在早期心脏中表达都下调,说明了流感病毒影响了bmp信号通路。3、原位杂交检测心脏发育核心调控因子Nkx2.5在胚胎9.5、10.5天的表达,发现病毒感染胚胎在这两个时期表达明显减少,说明流感病毒影响了心脏发育。4、原位杂交检测第二心域标志因子Isl1和Fgf10的表达,发现Isl1在10.5和11.5天的病毒感染胚胎的右心室和流出道表达减少,Fgf10亦在10.5天的病毒感染胚胎的右心室和流出道下调,说明流感病毒能影响第二心域发育。5、进一步对腔室特化因子MLC2a和ehand的表达进行检测,发现MCL2a在9.5天的病毒感染胚胎表达减少,ehand在10.5、11.5天的病毒感染胚胎的左心室区域显著下调,这表明流感病毒也影响了心脏的腔室建成。综上所述,这些结果初步表明在早期心脏发育中流感病毒影响bmp信号及心脏发育的重要因子Nkx2.5、Isl1、Fgf10、MLC2a和ehand的表达。

关键词： bmp信号通路流感病毒原位杂交技术先天性心脏病

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bmp2调节SMAD与microRNA介导慢性肾衰竭血管钙化的机制研究

BMP2调节SMAD与microRNA介导慢性肾衰竭血管钙化的机制研究

引用

作者：王洪刚山东大学

学位级别：硕士

研究背景近年来,我国慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)患者数量逐年增加,尽管以血液净化技术为代表的肾脏替代疗法已能使CRF患者摆脱尿毒症的威胁,但与普通人群相比,CRF患者因心血管事件而导致的死亡率仍居高不下,此过程中主要的... 详细信息

研究背景近年来,我国慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)患者数量逐年增加,尽管以血液净化技术为代表的肾脏替代疗法已能使CRF患者摆脱尿毒症的威胁,但与普通人群相比,CRF患者因心血管事件而导致的死亡率仍居高不下,此过程中主要的独立危险因素是血管钙化(vascular calcification,VC),因此探讨CRF患者血管钙化的发生机制具有重要意义。CRF导致的血管钙化是一种区别于动脉粥样硬化的血管钙化类型,始于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的成骨分化,主要涉及羟磷灰石晶体在血管壁中的沉积,且与肾脏-血管-骨轴具有密切的联系。Wnt/β-catemin途径能够促进成骨细胞的分化和成骨细胞分泌的胞外基质的生物矿化,在这一过程中起着重要作用。然而,单纯控制高磷血症以及使用Wnt途径抑制剂并不能完全预防或者明显降低尿毒症血管钙化的发生率。近年来医学界对于与钙磷代谢变化相关的另一条信号通路bmp/Smad 途径的关注明显增加。bmp(Bone morphogenic protein,bmp)是一种广泛存在于骨基质中的酸性糖蛋白,是转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族中涉及领域最为广泛的一族,它可以上调包括Smad6、Smad7等转录因子在内的66种基因的表达。研究认为,bmp家族中的bmp2在动脉粥样硬化、血管和瓣膜钙化等过程中均具有重要作用,bmp2激活Smads后通过远端启动子和近端启动子启动成骨细胞特异转录因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达进而诱导成骨细胞分化。但bmp2通过哪种smad调节Runx2的表达,该种smad又是通过何种分子导致钙化的发生目前尚无定论。本研究通过构建大鼠与VSMC钙化模型,借助免疫组化、免疫荧光、RT-qPCR以及Western blot等多种实验方法,明确bmp2在CRF钙化中的作用,并进一步探讨bmp2对下游smad家族蛋白的调控机制,此外本课题还进一步探索了 microRNA在此过程中的潜在作用,并寻找可能参与调控钙化过程的miRNA种类。研究目的1.明确bmp2在慢性肾衰竭血管中层钙化中的作用;2.明确smad蛋白家族在慢性肾衰竭血管中层钙化中的作用;3.探索bmp2调控smad家族参与慢性肾衰竭血管中层钙化的机制;4.寻找bmp2-smad通路中参与调控慢性肾衰竭血管中层钙化的microRNA。研究方法体外实验:体外培养VSMC,将细胞按照1×105个/mL的密度接种于六孔板中,待细胞贴壁后更换为含磷浓度5 mM的培养基,,分别干预0、3、5、7、9天,检测不同干预时间下细胞内ALP浓度与细胞钙含量,确定最佳干预时间,用于后续实验;将VSMC分为对照组、高磷组(pi:5mM)、干预组(pi:5mM+bmp-2抑制剂LDN-193189,250nM),每组按相应条件分别干预确定的最佳干预天数;体内实验:20只Wistar大鼠随机分为对照组(n=5)、CRF组(n=5)以及干预组(n=10),对照组常规饲喂,CRF组与干预组采用含0.75%腺嘌呤的高钙高磷饲料饲喂4周,构建慢性肾衰竭模型,造模成功后,CRF组采用高钙高磷饲料维持喂养,干预组在CRF组基础上按2.5 mg/kg/d腹腔注射bmp-2抑制剂,对照组以及CRF组同时等量注射生理盐水作为对照,共治疗2周。检测方法:钙化模型构建成功后,分别采用von kossa染色、RT-qPCR、免疫荧光、免疫组化等分析细胞与动物组间钙化差异、Runx2、bmp2、Smad家族基因与蛋白水平表达差异以及microRNA水平差异。研究结果体外实验:高磷通过诱导bmp2表达促进大鼠VSMC钙化机制研究。1.高磷刺激能够上调bmp2表达,促进VSMC转分化为成骨样细胞,促进钙沉积;2.抑制bmp2可以显著抑制VSMC的转分化以及钙沉积;***2通过上调Runx2以及p-smad1/5/8表达发挥促进钙化作用;***钙化时,miR-30b、miR-30c表达明显下调,再抑制bmp2后,二者表达显著升高。体内实验:bmp2促进CRF大鼠血管钙化机制研究。***大鼠发生显著血管钙化,高表达bmp2、Runx2;2.抑制bmp2可以显著抑制钙化,下调Runx2表达;***血管钙化时,p-smad1/5/8水平升高,smad6表达下调,抑制bmp2后p-smad1/5/8 下降,smad6水平上升。***钙化时,miR-30b、miR-30c表达下调,再抑制bmp2后,二者表达上升。研究结论bmp2依赖smad1/5/8的磷酸化促进Runx2的表达进

关键词：慢性肾衰竭血管钙化 bmp信号通路 Smads microRNA

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腭间充质过表达Noggin导致软腭裂并影响软腭肌肉、肌腱发育

腭间充质过表达Noggin导致软腭裂并影响软腭肌肉、肌腱发育

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作者：王尚琦大连医科大学

学位级别：硕士

背景:软腭裂是人类的一种先天性畸形,会影响到腭的生理功能。由于很少有动物模型显示单独的软腭裂,所以目前对导致软腭裂的分子与细胞机制我们仍不清楚。目前手术是治疗软腭裂的主要方法,由于软腭部肌肉成熟肌纤维数量少,肌肉及肌腱排... 详细信息

背景:软腭裂是人类的一种先天性畸形,会影响到腭的生理功能。由于很少有动物模型显示单独的软腭裂,所以目前对导致软腭裂的分子与细胞机制我们仍不清楚。目前手术是治疗软腭裂的主要方法,由于软腭部肌肉成熟肌纤维数量少,肌肉及肌腱排列方向复杂,再生能力低,所以完全恢复软腭的生理结构与功能还非常困难。目前已有文献报道,Wnt、Hh、Fgf信号通路在软腭发育过程中起着不同的影响作用。bmp信号通路对硬腭的发育起着至关重要的作用,但其对软腭发育的影响我们还尚不清楚。目的:本研究使用Osr2-cre KI工具鼠,于小鼠胚胎腭开始发育的11.5天,在腭间充质过表达bmp信号通路的拮抗因子Noggin,从而构建Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠来研究在腭间充质中抑制bmp信号通路对软腭发育的影响。方法:用Osr2-cre KI小鼠与pMes-Noggin小鼠杂交以产生Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠,分别取Osr2-cre;pMes-Noggin胚胎和同窝野生型胚胎（Wild Type,WT）,对组织进行固定、脱水、包埋、切片。通过Masson染色来确定软腭裂表型。Ki67标记细胞增殖以及TUNEL法细胞凋亡实验分别比较细胞增殖/凋亡差异。通过免疫组化（Myosin、CD31、β-Tubulin）分析软腭肌纤维、神经、血管的分化情况,同时提取软腭组织RNA进行RT-PCR来分析软腭中肌腱发育早期以及分化成熟阶段特异性标记物m RNA表达水平。通过免疫组化（p-Smad1/5/8、p-Erk1/2、Axin2、Lef1、Gli1）分析软腭中抑制bmp通路是否引起了Wnt、Shh信号通路的改变。整体原位杂交分析软腭中Shh的表达水平。结果:（1）Masson染色显示Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠存在软腭裂表型。（2）Ki67标记结果显示软腭间充质细胞增殖水平下降,TUNEL细胞凋亡实验实验显示软腭间充质细胞凋亡率升高。（3）免疫组化显示Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠软腭肌肉、神经、血管分化均受到抑制。（4）Real-Time PCR结果显示,Osr2-cre;pMes-Noggin小鼠软腭肌腱早期分化标记物Scx上调、但Colα1表达下调,提示过表达Noggin会使肌腱分化受到抑制。（5）免疫组化显示经典bmp信号通路在软腭间充质的表达被抑制,进而Wnt经典信号通路表达上调。（6）整体原位杂交显示Shh在软腭上皮的表达下调。结论:（1）小鼠软腭间充质中过表达Noggin会通过抑制软腭细胞增殖、促进细胞凋亡的方式,使软腭突体积减少,两侧软腭突不能在中线处接触融合进而导致软腭裂。（2）小鼠软腭中间充质中过表达Noggin,会抑制软腭中肌肉、肌腱、神经、血管的分化。（3）小鼠软腭间充质中抑制bmp信号通路会通过信号通路之间的串联作用,上调软腭间充质中Wnt信号通路。软腭间充质中bmp信号通路的下调与Wnt信号通路的上调又通过软腭上皮与间充质的相互作用,使上皮中Shh表达下调,进而影响软腭间充质中Gli1的表达量上调。这些可能是抑制软腭肌腱、肌肉、神经、血管的分化的原因。

关键词：软腭裂 Noggin bmp信号通路肌肉肌腱

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ACVR1在成牙本质细胞极化和牙本质形成中的作用及机理研究

ACVR1在成牙本质细胞极化和牙本质形成中的作用及机理研究

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作者：周怡君吉林大学

学位级别：硕士

牙本质是构成牙齿的重要组成部分,具有承担咀嚼压力、保护牙髓、传导感觉等作用。而牙本质这些生理机械功能的实现,尤其是对感觉的传导,依赖于规则有序排列的管状牙本质。牙胚发育过程的钟状期,在内釉上皮的诱导下,牙乳头外层的细胞退... 详细信息

牙本质是构成牙齿的重要组成部分,具有承担咀嚼压力、保护牙髓、传导感觉等作用。而牙本质这些生理机械功能的实现,尤其是对感觉的传导,依赖于规则有序排列的管状牙本质。牙胚发育过程的钟状期,在内釉上皮的诱导下,牙乳头外层的细胞退出细胞周期,细胞明显伸长,细胞核移向远离基底膜的一侧,而在靠近基底膜的一侧形成成牙本质细胞突,细胞器呈不对称分布,建立细胞极性,分化为具有分泌功能的成熟的成牙本质细胞。成熟的成牙本质细胞可通过细胞突分泌基质并进一步矿化形成牙本质。细胞极性是指细胞形态及内容物沿一个或多个轴向非对称分布。细胞逐渐形成极性的过程称为细胞极化。成牙本质细胞的极化是其分化过程中重要一环,这标志着细胞在形态和功能上的改变,是牙本质有序形成的基础。只有形成了有序的牙本质,牙本质液和神经纤维才能充填到排列规则的牙本质小管内,使牙齿具有感受刺激等生理功能;此外,牙本质的管状结构还为整个牙齿提供了更强的机械支持。因此,成牙本质细胞的极化对牙本质的有序形成,及其后牙齿功能的正常行使,具有重要意义。多种信号通路参与了成牙本质细胞的分化和牙本质的形成,其中,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,bmp)信号通路的作用至关重要。条件性敲除(Osr2-Cre)bmp信号通路中的Smad4基因,小鼠可出现下颌磨牙成牙本质细胞分化受阻、牙本质形成紊乱的表型。而在bmp信号通路中,Ⅰ型bmp受体起着关键性的信号转导作用。活化蛋白A受体1(activin A receptor 1,ACVR1)是Ⅰ型bmp受体的一种。在小鼠神经嵴细胞中敲除Acvr1,小鼠出现多种颅颌面畸形的表型。本课题组的前期研究表明,ACVR1表达于牙源性间充质。通过Osterix-Cre在小鼠牙源性间充质中敲除Acvr1,会导致出生后21天的小鼠下颌切牙牙本质形成缺陷。但关于ACVR1在成牙本质细胞极化及其在牙本质形成等方面的具体作用,目前仍不明确。为进一步探究ACVR1在成牙本质细胞极化及牙本质形成中的作用,我们通过Cre-LoxP系统,建立了在牙源性间充质中特异性(Osterix-Cre)敲除Acvr1基因的小鼠模型。取Osterix-Cre;Acvr1 fx/-基因型的新生小鼠为实验组,同窝Osterix-Cre;Acvr1 fx/+基因型的新生小鼠为对照组。取实验组及对照组小鼠头部标本,石蜡包埋切片后,通过HE染色观察小鼠下颌切牙牙本质的形成和成牙本质细胞形态;天狼星红染色观察下颌切牙牙本质胶原排列;免疫荧光染色检测高尔基体(GM130)在下颌切牙成牙本质细胞中的定位。HE染色结果显示,与对照组相比,实验组小鼠下颌切牙牙本质形成缺陷,牙尖处可见骨样牙本质;切牙颈环处的成牙本质细胞为多角形,切牙中段、牙本质初形成处,成牙本质细胞为柱状、具有细胞极性,这两处均与对照组结果相似,但在切牙牙尖处,部分成牙本质细胞呈多角形,丧失细胞极性。天狼星红染色结果显示,相较对照组,实验组小鼠切牙牙尖处胶原排列紊乱。GM130免疫荧光染色结果显示,实验组小鼠切牙近牙尖处成牙本质细胞中高尔基体-细胞核相对位置发生改变。综上,Ⅰ型bmp受体ACVR1参与成牙本质细胞极化并促进牙本质的有序形成,在调控牙本质形成中具有重要作用。

关键词：牙本质形成成牙本质细胞极性 ACVR1 bmp信号通路

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