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Lncrna-NORAD调节miR-155-5p/TLR6分子轴对脓毒症大鼠急性肺损伤的影响

中国呼吸与危重监护杂志 2025年第1期24卷 26-32页

作者：曾海文陈巧莉丁志荣福建医科大学附属泉州市第一医院重症医学科福建泉州362000 福建医科大学附属泉州市第一医院综合病房福建泉州362000

目的探讨dna损伤激活的非编码rna(non-coding rna activated by dna damage,NORAD)调节miR-155-5p/TLR6分子轴对脓毒症大鼠急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的影响。方法将大鼠随机分为对照组、模型组、NORAD低表达空载组(LV-sh-NC组)、NORAD低表达组(LV-sh-NORAD组)、NORAD低表达+miR-155-5p低表达空载组(LV-sh-NORAD+NC antagomir)、NORAD低表达+miR-155-5p低表达组(LV-shNORAD+miR-155-5p antagomir)。ELISA法检测白细胞介素(interleukin,IL)8、IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平;实时荧光定量聚合酶链反应检测各组大鼠肺组织NORAD、miR-155-5p和Toll样受体6(Toll-like receptor 6,TLR6)基因表达;测量肺组织湿/干重比值(W/D);苏木精-伊红染色法(hematoxylineosin staining,HE)染色观察肺组织形态;原位末端标记法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)法检测肺组织细胞凋亡;Western blot检测肺组织中TLR6、Bax、Bcl-2、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Cleaved-caspase-3)蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-155-5p与NORAD和TLR6的关系。结果与对照组比较,模型组和LV-sh-NC组大鼠肺组织损伤明显,血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平、肺组织中NORAD和TLR6 mrna表达、W/D比值、凋亡率、TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达显著升高,肺组织miR-155-5p表达和Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。下调NORAD表达可减轻大鼠肺组织损伤,降低血清IL-1β、TNF-α、IL-8水平、肺组织中NORAD和TLR6 mrna表达、W/D比值、凋亡率、TLR6、Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达,肺组织miR-155-5p表达和Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。下调miR-155-5p表达可降低负调控NORAD对脓毒症ALI大鼠的改善作用(P<0.05)。结论下调NORAD可抑制miR-155-5p/TLR6分子轴,减轻ALI大鼠肺损伤。

关键词：脓毒症急性肺损伤 dna损伤激活的非编码rna miR-155-5p/TLR6

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NORAD在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制

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中华医学杂志 2021年第10期101卷 732-736页

作者：刘强姚丽中国医科大学附属第一医院肾脏内科沈阳110001

目的探讨dna损伤激活的非编码rna(NORAD)在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法根据培养基中葡萄糖浓度将小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES-13分为高糖组及低糖组,处理24 h后转染NORAD小干扰rna(si-NORAD)及Toll样受体... 详细信息

目的探讨dna损伤激活的非编码rna(NORAD)在高糖诱导小鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡中的作用及机制。方法根据培养基中葡萄糖浓度将小鼠肾小球系膜细胞SV40-MES-13分为高糖组及低糖组,处理24 h后转染NORAD小干扰rna(si-NORAD)及Toll样受体4(TLR4)小干扰rna(si-TLR4),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NORAD及TLR4的表达。在SV40-MES-13细胞中分别转染NORAD、TLR4过表达质粒及小干扰rna。Cell Counting Kit-8(CCK-8)、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡结果;共转染NORAD和miR-520h模拟剂,TLR4和miR-520h模拟剂后检测荧光素酶强度及三者表达情况;共转染si-NORAD和miR-520h抑制剂、TLR4过表达质粒和miR-520h模拟物以及共转染si-TLR4和miR-520h抑制剂后检测三者水平及细胞增殖水平来验证三者的调节关系。结果高糖处理小鼠系膜细胞SV40-MES-13后,NORAD(1.65±0.08比1.00±0.06,P=0.003)及TLR4(1.96±0.09比1.01±0.07,P=0.001)的表达均升高。NORAD及TLR4过表达后细胞增殖加快(1.34±0.04比0.85±0.04,P=0.001;1.33±0.02比0.82±0.03,P<0.001),细胞凋亡减少(0.45±0.03比0.94±0.06,P=0.001;0.51±0.05比0.99±0.03,P=0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-520h能与NORAD及TLR4结合;NORAD与miR-520h表达相互影响,miR-520h模拟物可减少TLR4表达。与单独转染si-NORAD相比,共转染si-NORAD及miR-520h抑制剂时TLR4相对表达量升高(0.74±0.03比0.55±0.03,P=0.014);与单独转染miR-520h模拟物相比,共转染miR-520h模拟剂及TLR4过表达质粒后细胞增殖更快(0.73±0.01比0.61±0.02,P=0.007);与单独转染miR-520h抑制剂相比,共转染miR-520h抑制剂及si-TLR4后细胞增殖减少(1.31±0.04比1.55±0.04,P=0.013)。结论NORAD可结合miR-520h调节TLR4促进高糖诱导系膜细胞增殖及抑制凋亡。

关键词：糖尿病肾病 dna损伤激活的非编码rna 微rna-520h Toll样受体4

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lncrna NORAD促进食管鳞状细胞癌EC9706细胞的增殖和迁移

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中国肿瘤生物治疗杂志 2020年第4期27卷 359-364页

作者：李欢张评梅王郁王佳丽段玉青刘丽华河北医科大学第四医院肿瘤免疫科河北石家庄050035 河北医科大学国际合作研究干细胞实验室河北石家庄050035

目的:探讨长链非编码rna(long non-coding rna,lncrna)dna损伤激活的非编码rna(non-coding rna-activated by dna damage,NORAD)对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞株EC9706增殖和迁移能力的影响及其机制。方法:采用RT-PCR法检测不同ESCC细胞(EC9706、TE1、YES-2、KYSE150)中NORAD m rna表达水平,通过rna干扰技术将NORAD的小干扰rna(sirna)转染到EC9706细胞(si-NORAD组)以建立NORAD低表达细胞,另设置空白对照组(Ctrl组,不转染任何序列)及阴性对照组(NC组,转染sirna阴性对照序列),qPCR验证其转染效果。用MTT、平板克隆形成和划痕愈合实验检测敲低NORAD前后EC9706细胞增殖和迁移能力的变化,Western blotting检测敲低NORAD前后EC9706细胞中上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)和锌指转录因子Snail的表达变化。结果:在4种ESCC细胞中NORAD mrna均呈高表达状态,同时与TE1、YES-2、KYSE150细胞相比,EC9706细胞中NORAD mrna呈显著高表达(P<0.01)。与Ctrl组和NC组比较,转染NORAD-sirna后,si-NORAD组EC9706细胞中NORAD表达水平显著降低(均P<0.01),EC9706细胞的增殖和迁移能力显著降低(均P<0.05);敲低NORAD表达后,EC9706细胞中E-cadherin表达升高而N-cadherin和Snail表达降低(均P<0.05)。结论:NORAD在EC9706细胞中呈高表达状态,敲低NORAD表达可通过上调E-cadherin、下调N-cadherin和Snail表达而抑制EC9706细胞的增殖和迁移能力。

关键词： dna损伤激活的非编码rna 食管鳞状细胞癌 EC9706细胞增殖迁移

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长链非编码rna NORAD通过上调MTDH促进食管鳞癌顺铂耐药作用机制研究

长链非编码RNA NORAD通过上调MTDH促进食管鳞癌顺铂耐药作用机制...

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作者：贾云泷河北医科大学

学位级别：博士

中国是食管癌高发国家,鳞状细胞癌是主要病理类型。多数食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）患者在就诊时已处于晚期或局部晚期,失去手术机会。以顺铂为基础的化疗方案是ESCC综合治疗体系的重要组成部分,既是术后辅助... 详细信息

中国是食管癌高发国家,鳞状细胞癌是主要病理类型。多数食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）患者在就诊时已处于晚期或局部晚期,失去手术机会。以顺铂为基础的化疗方案是ESCC综合治疗体系的重要组成部分,既是术后辅助治疗的首选,也是不可切除性或复发性ESCC的一线治疗方案。然而,耐药是多数患者治疗终止的主要原因,并严重影响患者生存。目前,对于ESCC顺铂耐药的相关分子机制认识较少,制约新治疗策略的确立。第一部分lnc rna NORAD在食管鳞癌细胞顺铂耐药中的生物学意义目的:构建顺铂耐药的ESCC细胞,筛选参与顺铂耐药的关键长链非编码rna（long non-coding rna,lnc rna）,探索顺铂耐药的表观遗传学机制。方法:1.利用ESCC细胞系KYSE30和TE1通过药物浓度递增法构建顺铂耐药的ESCC细胞,即KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R细胞。2.利用细胞计数盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法分析顺铂耐药的ESCC细胞及其亲本细胞的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值,计算KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R细胞的耐药指数。3.利用CCK-8、划痕愈合和Transwell实验检测顺铂耐药的ESCC细胞及其亲本细胞的增殖、迁移和侵袭能力。4.使用生物信息学分析技术在包含顺铂耐药和顺铂敏感的ESCC组织的基因表达数据文库（Gene Expression Omnibus,GEO）的GSE45670数据集中筛选差异lnc rna,以在顺铂耐药的ESCC组织中上调的lnc rna作为候选lnc rna。5.利用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）在构建的顺铂耐药ESCC细胞及其亲本细胞中检测候选lnc rna的表达水平。6.利用短发夹rna（short hairpin rna,sh rna）构建dna损伤激活的非编码rna（non-coding rna activated by dna damage,NORAD）敲低的KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R细胞,利用慢病毒转染构建NORAD过表达的KYSE30和TE1细胞。使用不同浓度的顺铂对以上细胞进行处理,利用CCK-8明确干预NORAD表达对顺铂处理ESCC细胞的IC50值的影响。利用克隆形成实验分析干预NORAD表达在ESCC细胞中对顺铂的敏感性的影响。western blotting检测顺铂干预后的ESCC细胞中dna损伤标记物γH2AX以及凋亡标记物caspase-3和cleaved caspase-3的表达水平。流式细胞术检测顺铂干预后的ESCC细胞的细胞周期。7.利用敲低NORAD的KYSE30/CDDP-R细胞、过表达NORAD的KYSE30细胞以及相应对照组细胞构建荷瘤动物模型,给予顺铂或PBS干预,观察肿瘤生长速度。取下肿瘤组织后,利用免疫组化检测dna损伤标记物γH2AX以及凋亡标记物caspase-3和cleaved caspase-3的表达。结果:1.成功构建顺铂耐药的ESCC细胞。KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R细胞对顺铂的耐药指数分别是2.09和2.08。2.与KYSE30和TE1细胞相比,KYSE30/CDDP-R和TE1/CDDP-R细胞的迁移和侵袭能力显著增强（P<0.05）,而增殖能力无显著差异。3.生物信息学分析结果显示,在GSE45670数据集中,与顺铂敏感的ESCC组织相比,顺铂耐药的ESCC组织中共有5个表达水平上调的lnc rna,分别是NORAD、HOXA-AS2、linc00996、TENM3-AS1和CEP83-DT。4.q RT-PCR结果显示,NORAD、HOXA-AS2、linc00996和TENM3-AS1在KYSE30/CDDP-R细胞中表达水平上调（P<0.05）,NORAD、HOXA-AS2、linc00996和CEP83-DT在TE1/CDDP-R细胞中表达水平上调（P<0.01）。NORAD在顺铂耐药的ESCC细胞中的表达上调最显著。***-8结果显示,顺铂处理sh-NC、sh-NORAD-1和sh-NORAD-2组KYSE30/CDDP-R细胞的IC50值分别为5.83、2.93和3.10;处理sh-NC、sh-NORAD-1和sh-NORAD-2组TE1/CDDP-R细胞的IC50值分别为5.86、2.97和3.15。顺铂处理空载组和NORAD过表达组KYSE30细胞的IC50值分别为2.93和

关键词：食管鳞癌顺铂耐药长链非编码rna dna损伤激活的非编码rna 异黏蛋白

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长链非编码rna NORAD在食管鳞状细胞癌中的表达及功能研究

长链非编码RNA NORAD在食管鳞状细胞癌中的表达及功能研究

引用

作者：李欢河北医科大学

学位级别：硕士

第一部分lncrna NORAD在食管鳞状细胞癌组织中表达及临床意义目的:检测长链非编码rna(long non-coding rna,lncrna)dna损伤激活的非编码rna(non-coding rna-activated by dna damage,NORAD)在食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)组织中的表达状态,分析其表达水平与ESCC临床病理特征的关系。方法:收集2019年3月至2019年6月期间于河北医科大学第四医院胸外科行ESCC根治术患者手术切除的癌组织及相应癌旁组织标本30例。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)方法检测30例ESCC组织及相对应癌旁组织中lncrna NORAD表达水平,并通过统计学分析ESCC组织中lncrna NORAD表达水平与患者性别、年龄、肿瘤分化程度、组织学TNM分期等临床病理特征之间的关系。结果:lncrna NORAD在ESCC组织中表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05);lncrna NORAD在TNM分期处于III-IV期、肿瘤分化程度处于低分化以及淋巴结转移阳性的ESCC患者组织中表达水平显著高于TNM分期处于I-II期、肿瘤分化程度处于中高分化以及淋巴结转移阴性者(P<0.05),而不同性别、年龄及饮酒史的ESCC患者组织中NORAD表达无显著差异(P>0.05)。结论:lncrna NORAD在ESCC组织中呈高表达状态,其表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移和组织学TNM分期具有显著相关性,而与患者年龄、性别、饮酒史无显著性相关性。第二部分lncrna NORAD促进EC9706细胞迁移能力及机制研究目的:探讨lncrna NORAD对食管鳞癌EC9706细胞增殖和迁移能力的影响及机制。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测lncrna NORAD在不同ESCC细胞(TE1、YES-2、EC9706和KYSE150)中的表达水平,通过rna干扰技术将lncrna NORAD的小干扰rna(small interfering rna,si rna)转染到EC9706细胞(si-NORAD组)以建立lncrna NORAD低表达细胞,同时设置空白对照组(Con组,不转染任何序列)和阴性对照组(NC组,转染rna干扰阴性对照序列),q RT-PCR验证转染效率。用MTT、平板克隆形成和划痕实验检测敲低lncrna NORAD前后对EC9706细胞增殖和迁移能力的影响,Western blotting方法检测敲低lncrna NORAD前后EC9706细胞中E-钙黏连蛋白(E-cadherin)、N-钙黏连蛋白(N-cadherin)和锌指转录因子Snail的表达变化。结果:lncrna NORAD在4种ESCC细胞中均存在表达;转染NORAD-si rna后,EC9706细胞中lncrna NORAD表达较Con组和NC组显著降低(P<0.01);si-NORAD组EC9706细胞的增殖和迁移能力较Con组和NC组显著降低(P<0.05);敲低lncrna NORAD表达后,EC9706细胞中E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.01)而N-cadherin及Snail蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:lncrna NORAD在ESCC细胞中均存在表达,敲低lncrna NORAD表达可以抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和迁移能力。lncrna NORAD或可通过上调N-cadherin和Snail表达,同时下调E-cadherin表达诱导EC9706细胞上皮间质转化进而促进细胞恶性生物学行为。

关键词：长链非编码rna dna损伤激活的非编码rna 食管鳞状细胞癌迁移增殖

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NORAD在口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织及口腔鳞癌细胞系中的表达及作用机制

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临床和实验医学杂志 2023年第13期22卷 1360-1363页

作者：陈赫崔子峰靳琳玉杨凯成崔怡河北医科大学第四医院口腔颌面外科河北石家庄050000 河北医科大学第二医院口腔颌面外科河北石家庄050000

目的探讨dna损伤激活的非编码rna(NORAD)在口腔鳞状细胞癌组织,癌旁组织及口腔鳞癌细胞系中的表达及作用。方法回顾性选取2020年1月至2022年1月在河北医科大学第四医院行手术切除的口腔鳞状细胞癌组织标本88例,同时选取癌旁组织标本88... 详细信息

目的探讨dna损伤激活的非编码rna(NORAD)在口腔鳞状细胞癌组织,癌旁组织及口腔鳞癌细胞系中的表达及作用。方法回顾性选取2020年1月至2022年1月在河北医科大学第四医院行手术切除的口腔鳞状细胞癌组织标本88例,同时选取癌旁组织标本88例作为对照。采用PCR检测组织中NORAD mrna相对表达量,分析不同临床病理特征口腔鳞状细胞癌组织NORAD mrna相对表达量差异;同时选取口腔鳞癌细胞系SCC9、CAL27、SCC15及TSCCA细胞,以及正常黏膜HOK细胞,检测各细胞NORAD mrna相对表达量差异。结果口腔鳞状细胞癌组织NORAD mrna相对表达量为2.21±0.87,明显高于癌旁组织(1.03±0.34),差异有统计学意义(P<0.05)。TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移口腔鳞状细胞癌组织NORAD mrna相对表达量分别为2.79±0.69、2.62±0.65、2.68±0.68,明显高于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移口腔鳞状细胞癌组织(1.98±0.67、2.03±0.70、1.93±0.62),差异均有统计学意义(P<0.05);复发和未复发患者NORAD mrna相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CAL27细胞NORAD mrna相对表达量为1.87±0.41,明显高于SCC15、SCC9、TSCCA、HOK细胞(1.40±0.44、1.39±0.46、1.06±0.34和0.51±0.18),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NORAD在口腔鳞状细胞癌组织表达上调,与TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关,NORAD在CAL27细胞中表达最高。

关键词： dna损伤激活的非编码rna 口腔鳞状细胞癌组织癌旁组织细胞系

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