检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：向柏宇湖南师范大学

学位级别：硕士

丝状真菌是真菌中一类重要的组成成员,常见的包括木霉、曲霉、青霉等。丝状真菌是自然界优秀的分解者,它们能够分泌多种水解酶从而能够将自然环境中难以降解的物质分解并利用。鉴于其拥有卓越的酶蛋白分泌能力,工业上将它们开发成不同... 详细信息

丝状真菌是真菌中一类重要的组成成员,常见的包括木霉、曲霉、青霉等。丝状真菌是自然界优秀的分解者,它们能够分泌多种水解酶从而能够将自然环境中难以降解的物质分解并利用。鉴于其拥有卓越的酶蛋白分泌能力,工业上将它们开发成不同的表达宿主。但现有的丝状真菌蛋白表达系统仍具有分泌背景较高或靶标蛋白分泌效率较低等缺陷。草酸青霉野生菌株作为优秀的木质纤维素降解酶生产菌株,具有天然的低分泌背景和高蛋白分泌能力。本研究以草酸青霉为研究对象,通过基因工程手段重构淀粉酶表达调控途径,优化丝状真菌蛋白表达系统,不仅提高了蛋白分泌能力,同时还提高了菌株的生长速度。本文的主要的研究内容和研究结果如下: 一.通过持续性激活g蛋白信号通路增强启动子Pamy15A的效率和提高菌株生长速度通过点突变的方法持续性激活草酸青霉Δ13A-OamyR菌株g蛋白信号通路,重构淀粉酶表达通路,提升淀粉酶Amy15A启动子表达效率,并且提高了菌株生长速度,从分子水平优化了草酸青霉作为表达系统的发酵生产效率。在发酵培养期间,OamyR-QL的胞外蛋白浓度是出发菌株Δ13A-OamyR的160%-421%,在36 h时,菌株OamyR-QL菌丝体干重相较于出发菌株Δ13A-OamyR提高了约60%。二.通过转录组学技术对持续性激活g蛋白信号通路菌株差异基因进行分析利用转录组学技术,对草酸青霉g蛋白持续性激活菌株OamyR-QL及其出发菌株Δ13A-OamyR进行了转录差异分析,并对差异基因进行gO富集以及KEgg分析,同时揭示了与淀粉降解密切相关的糖酵解代谢途径以及相关转录因子的表达量变化。三.过表达AmyR进一步提升启动子Pamy15A的效率利用草酸青霉组成型启动子PubiD对淀粉酶转录激活因子AmyR过表达,以OamyR-QL为出发菌株得到的菌株命名为OamyR-QL-uOA,Pamy15A效率得到再次提升,从而进一步提升蛋白表达效率。在发酵培养期间,OamyR-QL-uOA的胞外蛋白含量是出发菌株OamyR-QL的105%-154%,淀粉诱导3 h,21 h和48 h时,amy15A在OamyR-QL-uOA中的转录水平是在OamyR-QL中转录水平的14.8、34.7、37.9倍。同样在这三个时间点,amyR在OamyR-QL-uOA中的转录水平是在OamyR-QL中的转录水平的66.1、15.5、3.1倍。四.比较分析菌株OamyR-QL-uOA与Δ13A-OamyR-ΔCreA蛋白分泌能力与生长发育速度从草酸青霉Δ13A-OamyR出发,在持续性激活g蛋白信号通路的基础上再次叠加过表达amyR的菌株OamyR-QL-uOA与之前构建的工程菌株Δ13A-OamyR-ΔCreA进行比较。发现两株工程菌株蛋白表达水平高且无明显差异,但OamyR-QL-uOA菌株表现出了显著提高的生长速度。因此,草酸青霉工程菌OamyR-QL-uOA更适合开发为蛋白表达系统应用于工业生产。

关键词：草酸青霉淀粉酶表达 g蛋白信号通路

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青霉g蛋白信号通路对糖苷水解酶合成调控初探及其在构建表达系统中的应用

青霉G蛋白信号通路对糖苷水解酶合成调控初探及其在构建表达系统...

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作者：胡益波山东大学

学位级别：博士

植物为主的生物质资源是自然界最大的再生资源库,也被看作生物燃料以及生物炼制最大的原料库,因此有效地降解这些以多糖(纤维素或淀粉)形式储存的生物质是实现可再生资源利用的关键。利用微生物产生的糖苷水解酶来降解自然界储藏的淀粉... 详细信息

植物为主的生物质资源是自然界最大的再生资源库,也被看作生物燃料以及生物炼制最大的原料库,因此有效地降解这些以多糖(纤维素或淀粉)形式储存的生物质是实现可再生资源利用的关键。利用微生物产生的糖苷水解酶来降解自然界储藏的淀粉或木质纤维素是生物质利用的有效途径。青霉是自然界中广泛存在的一种腐生丝状真菌,草酸青霉(***,原名为斜卧青霉Pdecumbens)114-2是本实验室从土壤中分离得到的一株生长快速,与里氏木霉相比,酶组分更加丰富,组成更加合理,其高产突变株也已经用于工业纤维素酶生产多年。随着其基因组测序以及相关组学分析的完成,其高产纤维素酶的机理得到一定的揭示。然而纤维素酶的表达调控是一个多水平且复杂的过程,而近年来关于纤维素酶转录水平的调控研究已经相对较多,研究者们逐渐将目光转向纤维素酶被诱导的前期过程,若能解析清楚纤维素信号转导过程或者发现关键的信号转换蛋白,将对认识纤维素酶的调控机制以及进一步进行高产菌株的改造具有重要的指导意义。除了通过理性的改造进一步提高菌株产酶量的同时,人们也在努力探索降解木质纤维素等生物质材料的最优酶系配比以及高性能的单酶组分。丝状真菌如草酸青霉、里氏木霉,虽然能分泌数量较多的糖苷水解酶,但仍然有相当数量的糖苷水解酶基因处于沉默状态,这些未被表达或者表达量极低的基因中很可能就包含全新的或者性能更加优良的单酶组分。而要获得对这些未知蛋白的了解,首先必须将它们有效表达出来,但由于蛋白在合成过程中的折叠和糖基化的差异性,常用的大肠杆菌以及酵母表达系统有时并不能将来源于丝状真菌的蛋白有活性地表达出来,因此,构建合适的表达系统将是方便且大规模挖掘新酶资源的重要前提。本论文的主要研究内容和结果如下：1.g蛋白信号信号转导通路对在糖苷水解酶合成调控中的功能研究首先通过生物信息学分析,我们在草酸青霉中找到了八个最有可能参与纤维素酶信号转导途径的蛋白,它们包含g蛋白偶联膜受体以及胞内激酶,对它们进行单基因敲除后并未发现这些基因的缺失对菌株表型及胞外糖苷水解酶的表达产生明显影响。然后,我们研究了接受g蛋白偶联膜受体信号的异三聚体g蛋白。发现g蛋白的α亚基PgA3在草酸青霉的淀粉酶和纤维素酶表达过程中起不同的调控作用。当草酸青霉缺失了PgA3后,胞外的淀粉酶几乎不分泌,主要纤维素外切酶CBHI的分泌没有受到明显影响,而胞外p-葡萄糖苷酶BgL1的酶活力也显著下降。而持续性激活PgA3后,淀粉酶活力显著升高,CBHI酶活力和BgL1的酶活力略有下降。进一步对相应糖苷水解酶的转录水平进行检测发现,缺失株中淀粉酶活力的下降以及激活株中淀粉酶活力的上升主要是由淀粉酶基因amy15A的表达量下调和上调引起。另外,在缺失pga3后,外切酶酶活虽然无明显变化,但其转录水平明显上调,而激活株以及突变株中p-葡萄糖苷酶bgl1的转录水平变化趋势不明显。而当在突变株△pga3培养过程中,胞外添加cAMP或者其类似物db-cAMP后,又能恢复淀粉酶的分泌,这说明淀粉酶的表达依赖于PgA3介导的胞内cAMP水平。通过对PgA3的缺失株以及激活株中与纤维素酶以及淀粉酶相关转录因子分析发现,这种对淀粉酶以及纤维素酶的不同的调控方式主要由cAMP所介导的转录因子AmyR表达水平不同而引起的。2.草酸青霉低背景组成型蛋白表达系统的构建和应用研究首先,通过敲除草酸青霉114-2中的最主要的淀粉酶Amy15A得到突变株△15A,发现突变株在以淀粉为唯一碳源进行发酵培养时,胞外蛋白分泌量很少,这样获得了的低胞外蛋白表达背景。然后,我们从草酸青霉中筛选了三个组成型强启动子,为了检验表达系统的可行性,我们成功地用它们表达了三个原本表达量极低的木质纤维素酶,它们分别为p-葡萄糖苷酶BgL4,木聚糖酶Xyn10B和内切葡萄糖苷酶Cel12A,当以淀粉为唯一碳源进行培养时,释放到胞外的主要蛋白酶条带和酶活均为对应的目的蛋白、而当以麦麸纤维素为碳源进行发酵培养时,胞外可分泌出包含目的蛋白在内的纤维素酶重组酶系,其中过表达BgL4和Cel12A使得滤纸酶活FPA的比酶活上升,而过表达Xyn10B使得FPA的酶活略有上升,但FPA的比酶活基本无变化。因此,草酸青霉组成型蛋白表达系统很适合筛选那些不表达或者低表达的木质纤维素酶,通过改变培养基中的碳源,能够方便地得到较纯的酶液(淀粉上),或者方便地检测到包含过表达了的目的蛋白在内的纤维素重组酶系(纤维素上)。3.运用g蛋白信号转导通路提高低背景蛋白表达系统的表达量为了进一步提高淀粉培养条件下的蛋白表达量,本研究通过重新对之前构建的低背景表达系统进行优化。首先,由于检测到淀粉培养条件下,淀粉能对淀粉酶起诱导作用,所以选择了主要淀粉酶Amy15A的启动子作为蛋白表达的启动子并进一步进行改造。首

关键词：草酸青霉 g蛋白信号通路糖苷水解酶强启动子蛋白表达系统

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基于秀丽线虫的TNT神经毒性的机制研究

基于秀丽线虫的TNT神经毒性的机制研究

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作者：李赢安徽大学

学位级别：硕士

含能化合物是在化学和热力冲击的作用下，能够产生大量气体和热量爆发并迅速分解的化学物质，其在生产、运输、存储、使用的过程中出现的泄漏会对环境造成持续性污染。含能化合物以三硝基甲苯（TNT）、环四亚甲基四硝胺（HMX）及环三亚... 详细信息

含能化合物是在化学和热力冲击的作用下，能够产生大量气体和热量爆发并迅速分解的化学物质，其在生产、运输、存储、使用的过程中出现的泄漏会对环境造成持续性污染。含能化合物以三硝基甲苯（TNT）、环四亚甲基四硝胺（HMX）及环三亚甲基三硝胺（RDX）为代表，其中TNT的污染程度最高且毒性最强，TNT暴露导致的健康风险日益增加。已经有研究表明TNT可以通过皮肤接触，吸入以及摄入的方式进入人体并造成伤害，如引起白内障，“TNT”面容、中毒性肝炎、再生障碍性贫血、恶心、呕吐、癫痫等症状。虽然已有研究证实暴露于大量TNT及其衍生物的大鼠和牛蛙表现出活动自由度降低（嗜睡、俯卧、震颤、强直性和阵挛性抽搐）和肌肉张力改变等症状，但导致中枢神经系统出现损伤的机制的研究却很少报道。秀丽线虫身体透明，神经系统简单且清晰，世代周期短，本文以其为模式生物，探究不同浓度（10ng/mL、50 ng/mL以及100 ng/mL）的TNT对秀丽线虫的神经毒性以及引起神经毒性的机制。具体内容如下:　　（1）TNT对线虫神经行为指标的影响　　采用不同的暴露方式将野生型线虫N2暴露于不同浓度的TNT溶液中，研究其对线虫运动行为的影响，发现急性暴露和慢性暴露都会导致线虫的运动能力显著下降，包括头部摆动、身体弯曲以及咽泵速率的减弱，同时证明慢性暴露对线虫的运动行为的影响比急性暴露小。根据以上结果，采用TNT急性暴露，并选择乙醇趋避行为、觅食行为以及学习行为为检测终点，结果显示，乙醇趋避行为能力和菌落接触率显著性下降，反映动物的多巴胺通路受损以及觅食能力减弱，同时线虫的学习能力减弱，表明TNT暴露会导致线虫的神经行为能力损伤。　　（2）TNT对秀丽线虫神经元和神经递质的影响　　对线虫胆碱能、γ-氨基丁酸能（gABA）、多巴胺能和5-羟色胺能四种神经元系统荧光成像的分析发现，TNT暴露对线虫的gABA和5-羟色胺神经元的结构性完整和神经递质的分泌均无明显影响，但在10ng/mL时，胆碱能神经元的荧光强度显著性降低，随着浓度的增加，多巴胺神经元的荧光强度显著性降低，并且进一步发现随着多巴胺和乙酰胆碱的分泌显著性降低，其相关基因的表达均不同程度的显著性下调。　　（3）TNT对秀丽线虫抗氧化过程的影响　　通过采用CF1553转基因线虫作为研究模型，探讨TNT对线虫抗氧化水平的影响。转基因线虫（CF1553）中gFP标记SOD-3,其荧光强度的定量分析，可以反映线虫体内抗氧化过程的变化。TNT可能通过诱导氧化应激而对线虫造成影响，而线虫体内SOD-3蛋白的上调则是其抵抗TNT引起的氧化损伤的一种可能机制。　　（4）g蛋白信号通路靶向调控TNT致秀丽线虫神经损伤　　通过深入研究TNT对神经行为与神经系统的作用，推测TNT可能导致秀丽线虫产生神经毒性的一个重要因素是乙酰胆碱释放的显著减少。此外，TNT暴露对线虫体内的g蛋白信号通路产生了影响，为了验证这一推测，采用了 qRT-PCR实验来检测g蛋白调控通路中相关基因的表达情况。实验结果表明，与g蛋白调控相关的基因egl-30、gsa-1、goa-1以及unc-13的表达量均出现了显著性下调，表明g蛋白靶向调控TNT诱导了线虫的神经毒性。　　在本研究中，使用秀丽线虫探索了 TNT对线虫的影响及信号通路，揭示了 TNT诱导线虫神经毒性的机制，为进一步研究环境中TNT的潜在风险和人类健康提供了基础。

关键词：三硝基甲苯神经元神经递质 g蛋白信号通路毒性机制

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异丙肾上腺素对NCX1.1基因编码钠钙交换体电流的影响

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中华老年多器官疾病杂志 2023年第2期22卷 124-129页

作者：项国剑张建成李泱陈茜福建省立医院心血管内科福州350001 福建医科大学省立临床医学院福州350001 中国人民解放军总医院老年心血管病研究所北京100853 福建省立医院重症医学科福州350001

目的探讨β肾上腺素受体对钠钙交换电流(I_(NCX))的调控及可能的信号转导途径。方法利用免疫磁珠阳性标记表达系统将NCX1.1质粒转染人胚肾293(HEK-293)细胞,选取103个转染阳性的HEK-293细胞,随机分成空白对照组(n=20)、灌流异丙肾上腺素... 详细信息

目的探讨β肾上腺素受体对钠钙交换电流(I_(NCX))的调控及可能的信号转导途径。方法利用免疫磁珠阳性标记表达系统将NCX1.1质粒转染人胚肾293(HEK-293)细胞,选取103个转染阳性的HEK-293细胞,随机分成空白对照组(n=20)、灌流异丙肾上腺素(ISO)组(n=20)、灌流gi蛋白抑制剂百日咳毒素及ISO组(n=20)、灌流环磷酸腺苷(cAMP)合成激动剂毛喉素(forskolin)及ISO组(n=22),灌流蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H89及ISO组(n=21)。运用全细胞膜片钳技术记录各组I_(NCX)的变化。采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。根据数据类型,分别采用t检验或ANOVA方差分析进行组间比较。结果以灌流用药前I_(NCX)为空白对照组,ISO组可使内向I_(NCX)密度从(-6.07±1.53)pA/pF增加至(-7.89±1.61)pA/pF(n=20,P<0.05),平均增加约30%。而预先使用g蛋白-cAMP-PKA通路关键分子激动剂或抑制剂后,ISO对I_(NCX)的效应均发生明显改变。其中,PTX及forskolin可使ISO对I_(NCX)密度增加效应更加显著,电流密度分别增至(-10.02±1.99)pA/pF及(-10.78±1.77)pA/pF,与单纯使用ISO相比,差异有统计学意义(n=20,P<0.01),提示gi蛋白抑制和环磷酸腺苷激动均可增加ISO的作用。而预先应用H89,ISO增加I_(NCX)的效应几乎消失,电流密度约为(-6.22±1.70)pA/pF,与对照组相比无显著差异(n=20,P>0.05),提示抑制PKA可基本阻断ISO对I_(NCX)的刺激效应。结论β肾上腺素受体激动可增加NCX1.1内向电流,其可能通过g蛋白-cAMP-PKA信号通路参与调节。

关键词： β肾上腺素受体钠钙交换体电流钙超载 g蛋白信号通路

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棉铃虫对Cry2Ab毒素抗性风险评估及抗性机理研究

棉铃虫对Cry2Ab毒素抗性风险评估及抗性机理研究

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作者：刘来盘南京农业大学

学位级别：博士

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)隶属于鳞翅目夜蛾科棉铃虫属,是全球范围内危害最严重的棉花害虫。为应对棉铃虫对化学杀虫剂抗性的迅速发展,上世纪90年代后期转Bt基因抗虫棉开始在世界范围内推广种植,到2016年,全球转Bt棉花种植面... 详细信息

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)隶属于鳞翅目夜蛾科棉铃虫属,是全球范围内危害最严重的棉花害虫。为应对棉铃虫对化学杀虫剂抗性的迅速发展,上世纪90年代后期转Bt基因抗虫棉开始在世界范围内推广种植,到2016年,全球转Bt棉花种植面积已达1500万公顷。Bt棉的种植有效控制了靶标害虫棉铃虫和棉红铃虫的危害,降低了棉花的生产成本,提高了棉花产量,产生了巨大的生态和经济效益。为了避免棉铃虫对化学杀虫剂抗性快速演化问题的再次上演,在1996年第一代单价Bt-Cry1Ac抗虫作物商业化种植开始就执行了严格的高剂量/庇护所(high-dose/refuge)抗性治理策略。随后,为了克服单价Bt作物防治靶标害虫种类有限、庇护所面积过大等问题及延缓靶标害虫抗性产生,2003年转入Cry1Ac和Cry2Ab基因的第二代Bt棉花开始在美国和澳大利亚推广,标志着基因聚合(gene pyramiding)或基因叠加(gene stacking)抗性治理策略的应用。我国于1997年开始一直种植转Bt-Cry1Ac基因抗虫棉,采用自然庇护所的抗性治理策略。2010年的监测结果表明,北方棉区部分棉铃虫种群对Cry1Ac毒素产生了早期抗性,对Cry2Ab毒素的敏感性还没有显著影响。但最新监测结果显示,田间种群棉铃虫Cry1Ac抗性个体频率及田间非隐性抗性基因频率较2010年均有显著上升,棉铃虫对Cry1Ac抗性的这一变化是否会对Cry2Ab毒素的敏感性产生影响?本文通过对Cry2Ab毒素4年的敏感性监测、对室内筛选Cry2Ab抗性品系的遗传特性、交互抗性及其在不同品种棉花的存活实验评估了我国棉铃虫对Cry1Ac+Cry2Ab双价棉的抗性风险,同时对有关基因叠加抗性治理策略成功应用的相关条件进行了论证。虽然双价Bt棉花的田间种植已经近十年,但靶标害虫对Cry2Ab抗性研究远远落后于Cry1Ac抗性研究。澳大利亚棉铃虫Cry2Ab隐性抗性是由ABCA2基因突变导致丧失Cry2Ab毒素结合能力引起的。那么我国棉铃虫对Cry2Ab的抗性机理如何?本文运用pull-down和液相-二级质谱联用技术分离和鉴定了棉铃虫中肠Cry2A毒素结合蛋白,并验证了是否与抗性相关;通过构建遗传分离群体,采用QTL定位和转录组测序定位和筛选疑似抗性基因;最后通过信号通路相关抑制剂的生物测定和CRISPR/dCas干扰技术对相关基因进行了功能验证。上述工作的研究结果,对当前和今后如何有效开展我国转基因抗虫棉的种植,以有效控制抗性棉铃虫的发生和危害具有重要指导意义;同时发现中国棉铃虫对Cry2Ab显性抗性可能与gPCR/g蛋白信号通路相关,表明棉铃虫对Cry2Ab的抗性机理存在多样性。具体结果如下:1.棉铃虫田间种群Cry2Ab毒素的敏感性调查采用浓度对数-死亡机率值法,在2013-2016年连续四年调查了我国新疆棉区(沙湾)、华北棉区(安阳、开封、安次、高阳、南皮、邱县、惠民、夏津)以及长江流域棉区(荆州、望江、盐城)等12个田间种群棉铃虫对Cry2Ab毒素的敏感性,结果表明各地田间种群对Cry2Ab毒素的敏感性差异均在10倍以内。比较每年度转基因棉种植密集的华北和长江流域棉区11个种群LC50平均值与室内敏感品系An和未种植Bt棉新疆沙湾种群LC50平均值,4年间Cry2Ab敏感性差异为2.0-2.7倍。2016年采用诊断剂量法,检测了各田间种群对Cry2Ab的抗性个体频率。转基因棉种植区11个棉铃虫种群Cry2Ab诊断剂量存活率在1.4%-5.2%之间,平均存活率3.3%(106/3168),显著高于沙湾种群(3/288,1.0%)和室内敏感品系An(0/288,0),转基因棉种植区和未种植区之间Cry2Ab抗性个体频率存在显著差异(χ2=13.7,df=1,P = 0.025)。Spearman相关性分析显示各检测种群抗性个体频率与LC50值呈正相关(rs = 0.74,df=12,P = 0.0001),两种监测方法结果具有一致性。以上结果表明,在我国转单价棉长期种植引起棉铃虫对Cry1Ac抗性频率的升高可能会影响对Cry2Ab毒素的敏感性,因此我国对转Cry1Ac和Cry2Ab基因双价棉的选择应持谨慎态度。2.棉铃虫Cry2Ab抗性品系筛选及适合度研究2009年,通过F2筛选获得了几个棉铃虫携带Cry2Ab抗性基因的单雌系,混合后用Cry2Ab毒素连续筛选37代建立了抗性品系An2Ab。生物测定结果显示与未筛选对照品系An相比,An2Ab对Cry2Ab具有130倍的抗性,对Cry2Aa毒素具有81倍的高水平交互抗性,对Cry1A类毒素具有18-22倍的交互抗性。抗性遗传方式研究结果显示对Cry2Ab抗性接近于完全显性、常染色体遗传。通过不同模型比较回

关键词：棉铃虫 Cry2Ab 风险评估结合蛋白 QTL定位 g蛋白信号通路

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群感效应对红曲霉洛伐他汀和红曲色素合成的影响及调控机制研究

群感效应对红曲霉洛伐他汀和红曲色素合成的影响及调控机制研究

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作者：廖南清广东药学院

学位级别：硕士

目的最近的研究表明一种被称为群感效应现象在提高微生物次生代谢产物量方面具有较大的应用前景。本研究中,我们探讨亚油酸作为群感效应信号分子氧脂素的前体对人红曲霉洛伐他汀和红色素的合成影响及其调控机理。方法分别采用高效液相... 详细信息

目的最近的研究表明一种被称为群感效应现象在提高微生物次生代谢产物量方面具有较大的应用前景。本研究中,我们探讨亚油酸作为群感效应信号分子氧脂素的前体对人红曲霉洛伐他汀和红色素的合成影响及其调控机理。方法分别采用高效液相色谱法和紫外分光光度法检测洛伐他汀和红色素的产量,探讨亚油酸对红色素和洛伐他汀合成浓度-时间-产量关系;通过Real-Time PCR法检测亚油酸对红曲霉洛伐他汀合成调控基因mk H和洛伐他汀合成基因mk A浓度-时间-表达量的关系;酶联免疫吸附法及比色法分别检测亚油酸对红曲霉g蛋白偶联信号通路中环腺苷酸和胞内钙离子浓度-时间-含量的关系;非放射性蛋白激酶检测法检测蛋白激酶A、蛋白激酶C和酶联免疫法检测磷脂酶C浓度-时间-活性的关系。结果亚油酸对红曲霉次级代谢产物红曲色素和洛伐他汀的产量均有较高的影响,并且呈一定的浓度依赖性。高浓度的亚油酸不利于色素的产生,较低浓度的亚油酸有利于红曲色素的产生。亚油酸浓度为64μM的实验组得到较高的红曲色素产量,在第十三天产量达5.6U/m L,相比对照组增长了27%;较高浓度的亚油酸有利于洛伐他汀的产生,512μM浓度的亚油酸实验组获得较高的洛伐他汀的产量,在第十三天产量达13.2mg/g,与对照组相比增长了26%。Real-Time PCR的结果表明较高浓度亚油酸可提高mk A基因的转录表达水平,而在低浓度亚油酸中mk A基因的表达受到抑制。mk A基因最高的表达出现在512μM组的第九天,表达差异相比对照组达5.36倍;mk A基因最低表达出现在64μM组的第七天,只是对照组的0.27倍。在全部的亚油酸添加组中,调控基因mk H在培养前中期有不同程度的较高水平的表达,最大的差异出现在第九天,分别是64μM组的11.8倍和512μM的7.41。亚油酸可起引c AMP-PKA途径中c AMP浓度的的增加,并且c AMP浓度维持在较高水平,呈一定的浓度依赖性,而PKA的活性也有显著的升高,PKA的活性同样维持在较高水平,活性高低呈亚油酸浓度依赖性的升高,这与c AMP的变化相一致;磷脂酰肌醇信号通路中PKC的活性有一定的升高,而胞内钙离子浓度和磷脂酶C活性相比对照组没有显著的变化。结论外源添加亚油酸可改变红曲霉产生色素的过程;在一定范围内,色素的产量与亚油酸添加浓度成反比,洛伐他汀的产量与亚油酸添加浓度成正比,洛伐他汀和色素的产量成一定的竞争性。洛伐他汀合成基因mk A的转录水平的变化与洛伐他汀的合成量呈正比性相关,而与色素产量是一定的反相关性;调控基因mk H的表达与洛伐他汀和色素的合成量相关,调控基因mk H的表达水平越高,红曲霉次生代谢越活跃。亚油酸对红曲霉的洛伐他汀和红色素合成受c AMP/PKA信号途径影响较大,磷脂酰肌醇-PKC则有一定的影响,而磷脂酰肌醇-Ca2+信号途径的则无显著影响。

关键词：洛伐他汀群感效应 g蛋白信号通路调控红曲霉

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β-arrestins通过直接相互作用调控gαs功能与β-arrestins相互作用蛋白组的研究

β-arrestins通过直接相互作用调控Gαs功能与β-arrestins相互作...

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作者：李博中国科学院大学

学位级别：博士

β-Arrestins的经典功能是调剂g蛋白偶联受体(gPCR)的脱敏，内吞以及开启g蛋白非依赖信号通路。所以，了解β-arrestin信号通路以及g蛋白信号通路如何相互协调以及交叉对于理解gPCR信号通路十分重要。在这一部分的研究发现，β-arresti... 详细信息

β-Arrestins的经典功能是调剂g蛋白偶联受体(gPCR)的脱敏，内吞以及开启g蛋白非依赖信号通路。所以，了解β-arrestin信号通路以及g蛋白信号通路如何相互协调以及交叉对于理解gPCR信号通路十分重要。在这一部分的研究发现，β-arrestin-1可以与gαs相互作用，但是不与gαi或gαo相互作用。使用生物膜干涉技术，我们发现纯化的β-arrestin-1与gαs以一种快速结合/解离的动力学模式相互作用。更进一步的研究发现，β-arrestin-1可以促进gTPγS与gαs结合/解离，也可以促进gαs的gTP水解酶活性。β-arrestin-1上的氨基酸突变(L33K)可以减弱其与gαs的相互作用。与这一结果相一致的，β-arrestin-1 L33K突变无法对gαs的功能产生显著的影响。我们的结果还表明，β-arrestin-1可以促进由isoproterenol引起的gTPγS与细胞膜组分的结合，以及细胞内cAMP的积累。作为β-arrestin-1的同源蛋白，β-arrestin-2也可以与gαs以同样的动力学模式相互作用。但是，β-arrestin-2抑制gTPγS与gαs结合，同时仍促进gαs的gTP水解酶活性。细胞学实验发现，β-arrestin-2抑制了由isoproterenol引起的cAMP的积累。由此，我们的研究揭示了β-arrestins直接调控gαs的潜在机制。

关键词： β-arrestin信号通路 g蛋白信号通路生物膜干涉技术动力学模式

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同病异证H22肝癌小鼠垂体基因差异表达的特征

同病异证H22肝癌小鼠垂体基因差异表达的特征

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作者：刘小美上海中医药大学

学位级别：博士

目的　　观察同病异证H22肝癌小鼠垂体基因差异表达的特征，重点关注Pomc及其转录因子和加工酶，以及参与调控Pomc表达的g蛋白信号通路等。从垂体层面揭示肝癌同病异证发生的物质基础，并进一步探索其形成的机制。　　方法　　1.体内实... 详细信息

目的　　观察同病异证H22肝癌小鼠垂体基因差异表达的特征，重点关注Pomc及其转录因子和加工酶，以及参与调控Pomc表达的g蛋白信号通路等。从垂体层面揭示肝癌同病异证发生的物质基础，并进一步探索其形成的机制。　　方法　　1.体内实验一：腋下接种H22肝癌腹水瘤细胞复制小鼠肝癌模型，采用小鼠计量化四诊和辨证方法，筛选同病异证-邪毒壅盛证(简称邪毒证)与气虚证肝癌小鼠，以无证可辨的正常小鼠为对照。以Affeymetrix小鼠基因芯片检测各组小鼠垂体基因的差异表达。在此基础上分析各证候小鼠垂体差异基因表达的总体特征，并进一步重点分析垂体Pomc及参与其转录、加工基因，以及g蛋白通路等若干与垂体功能密切相关通路基因的差异表达特征。　　2.体内实验二：于2010年和2011年依次开展两批动物实验，2010批小鼠筛选早期邪毒证和气虚证荷瘤小鼠和正常对照小鼠;2011批小鼠筛选邪毒濒危证(邪危组)、邪毒壅盛证(邪毒组)、邪毒居中证(邪中组)、邪毒微弱证(邪微组)等4个不同程度的邪毒证小鼠，以及邪毒居中兼气虚证小鼠(气虚组)和正常对照小鼠。以ELISA技术检测血清ACTH的含量。同步采用RTqPCR技术检测垂体Pomc及其转录和加工相关基因、以及g蛋白信号通路若干差异基因的表达。　　3.体外实验：综合采用ELISA和RTqPCR技术，检测不同剂量CRH、AVP和H作用于AtT20细胞不同时间后，其ACTH的分泌量以及Pomc等基因的表达情况，观察三者分别影响AtT20细胞Pomc转录和ACTH释放的量效和时效关系，以及三者之间可能存在的相互关系。　　结果　　1.体内实验一：筛选获得正常对照小鼠以及肝癌早期邪毒证、气虚证小鼠各8只，芯片检测每张芯片获得垂体16654个基因的mRNA表达。基因差异表达的特征为：(1)气虚组差异表达基因较邪毒组多，且气虚组下调基因多于上调基因，邪毒组上调基因多于下调基因。(2)肝癌小鼠的Pomc表达均低于正常组，且气虚组低于邪毒组。(3)Pomc转录因子Pitx1、Tbx19、Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3在邪毒组均一致上调，转录后的加工酶Pcsk1和Pcsk2均一致下调。但气虚组的Pomc转录因子有高有低，其中Pitx1、Tbx19上调，Nr4a1、Nr4a2和Nr4a3一致下调。且其加工酶Pcsk1下调，Pcsk2上调。(4)g蛋白通路中PKA支路大体处于活跃状态，且邪毒组更甚于气虚组;而PKC支路处于相对抑制状态，但总体上邪毒组较气虚组活跃。(5)其他通路中，哺乳动物昼夜节律显示邪毒组较气虚组活跃，特别是邪毒组的Per1、Per2、Nrld1的表达明显升高。而参与遗传信息加工的基因在邪毒组的表达受到抑制，气虚组却较活跃。　　2.体内实验二：(1)证候分析显示，2010和2011两批动物中，邪毒证肝癌小鼠均兼有一定程度的气虚证，而气虚证兼有一定程度的邪毒证，且2011批气虚证小鼠兼有的邪毒程度较2010批重。(2)肿瘤发生后，两批同病异证肝癌小鼠的垂体对肾上腺的调控均比较活跃，血清ACTH含量升高，其中气虚组均高于邪毒组。(3)检测的基因中，Tbx19、Nr4a2、Nr4a3、Adcy5、Prkar1a和Hras1在两批小鼠邪毒组表达趋势一致，但气虚组只有Tbx19、Nr4a2、Hras1表达一致。(4)与血清ACTH含量气虚组高于邪毒组趋势一致的基因有Pomc、Nr4a2、Pcsk1、Adcy5、Itpr1、Hras1。　　3.体外实验：(1)CRH能促进AtT20细胞释放ACTH和转录Pomc，其中对ACTH的促进作用以400nM作用15min最显著(2.03倍)，而对Pomc的作用以400nM作用30min最显著(4.65倍)，即Pomc的表达滞后于ACTH的释放15min。(2)AVP也能促进AtT20细胞释放ACTH和转录Pomc，其的最佳浓度和时间分别为400nM作用30min(2.07倍)和100nM作用90min(2.02倍)，即Pomc表达滞后ACTH的释放60min。(3)H抑制AtT20细胞释放ACTH和表达Pomc，且对Pomc的抑制随作用时间延长而加重，(4)CRH、AVP和H分别作用时，均能一定程度影响其他激素相关受体的表达。　　结论　　1.不同批次肝癌小鼠的证候发展存在轻微差异，但根据邪盛衰度、气盛衰度不同，均可出现不同邪毒程度以及兼有气虚证的荷瘤小鼠。部分小鼠证候隔夜发展快速，导致处死时实际证候与辨证存在差异。这种肝癌小鼠证候复杂的自然演变和发展过程与人类十分近似，由此提示肝癌防治中，应及时辨证论治、调整治疗方案。　　2.同病异证肝癌小鼠血清ACTH浓度总体上与邪盛衰度呈正相关，气虚证ACTH较邪毒证高。其中邪毒证肝癌小鼠的Tbx19、Nr4a2、Nr4a3、Adcy5、Pr

关键词：同病异证肝癌垂体基因 g蛋白信号通路差异表达

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gsα的过表达和缺失对果蝇大脑发育的影响

Gsα的过表达和缺失对果蝇大脑发育的影响

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作者：姜文超清华大学

学位级别：硕士

g蛋白信号通路是细胞内的一条重要的信号通路,参与包括基因转录、细胞增殖等很多过程。g蛋白复合体包括α、β、γ三个亚基,其中最重要的是gα亚基,gα亚基主要是通过cAMP-PKA信号通路来向下游传递信号。研究显示,gα亚基的突变可以影... 详细信息

g蛋白信号通路是细胞内的一条重要的信号通路,参与包括基因转录、细胞增殖等很多过程。g蛋白复合体包括α、β、γ三个亚基,其中最重要的是gα亚基,gα亚基主要是通过cAMP-PKA信号通路来向下游传递信号。研究显示,gα亚基的突变可以影响细胞内的离子通道的活性,gαi调节果蝇神经母细胞的不对称分裂中纺锤体的方向并影响果蝇神经母细胞的不对称分裂,但目前尚未有gsα对果蝇大脑发育影响的相关报道。为了研究gsα对果蝇大脑发育的影响,我们设计了gsα过度激活和缺失的实验。通过gAL4-UAS体系来过表达gsα基因,通过hsgAL4-UAS体系来研究gsα的激活突变基因短暂和大量的表达对果蝇神经发育的影响,同时通过FLP-out系统来研究果蝇大脑部分细胞群过表达gsα的激活突变基因对细胞发育命运的影响。同时,我们通过体细胞克隆的技术构建表达gsα缺失突变体的果蝇突变体。研究结果显示,在25℃及31℃培养条件下,gsα的过表达对果蝇会产生致死效应,在hsgAL4驱动gsα激活突变基因过表达的实验中,有个别果蝇的大脑发育命运发生了变化。表达gsα失活突变基因的果蝇三期幼虫的大脑形态未发生显著变化,gsα基因的失活对果蝇大脑细胞的细胞周期也未产生显著影响。

关键词： g蛋白信号通路 gsα 果蝇大脑过量表达失活

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三论经脉脏腑相关是经络理论的核心——从基因水平探讨心经经脉脏...

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庆祝中国中医研究院成立50周年首届中医药发展国际论坛暨首届中医药防治艾滋病国际研讨会

作者：周逸平汪克明周美启胡玲吴子健王月兰张发宝杨黄恬安徽中医学院经脉脏腑相关研究中心中科院上海生命科学研究院健康科学中心心脏分子学实验室上海晶泰生物科学技术有限公司中科院上海生命科学研究院健康科学中心心脏分子学实验室

经络理论是中医理论的核心的核心。经络是经脉脏腑间的运行气血的联络系统，结合古人通过大量临床治疗疾病的实践和对人体的解剖观察，在《内经》已形成了系统的经络理论，提出了“心主血脉”，“肺主气”的经脉运行气血，实行人体的统... 详细信息

经络理论是中医理论的核心的核心。经络是经脉脏腑间的运行气血的联络系统，结合古人通过大量临床治疗疾病的实践和对人体的解剖观察，在《内经》已形成了系统的经络理论，提出了“心主血脉”，“肺主气”的经脉运行气血，实行人体的统一和人与自然的统一，具有一定的科学实践依据。经脉脏腑相关理论则是经络理论的核心。经络和经脉脏腑相关研究体了现中医的整体观。近年来，笔者明确提出“经脉脏腑相关是经络理论的核心”的论点后，得到同行广泛的支持，并提出从“以“经”统率的纵向研究、以“脏”统率的横向研究，经脉脏腑表里相关的研究、膀胧经背俞穴与相应脏腑联系的途径”和经脉一脏腑相关与脑联系的研究等五个方面进行重点研究，有望找到经络理论研究的突破口，阐明经络调节人体机能的实质。本文从基因水平探讨心经经脉脏腑相关的相对特异性和电针心经对急性心肌缺血的细胞信号转导与g蛋白信号通路的影响。

关键词：经络理论经脉脏腑基因水平电针心经急性心肌缺血细胞信号转导 g蛋白信号通路

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