检索结果-内蒙古大学图书馆

h5n1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株的全基因克隆及序列分析

微生物学报 2005年第5期45卷 690-696页

作者：龙进学王曲直卢建红刘玉良刘秀梵扬州大学畜牧兽医学院农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009

应用流感病毒通用引物[4]和h5n1亚型禽流感(Avian influenza virus,AIV)的型特异性引物,成功的扩增出h5n1亚型禽流感病毒A/duck/Shandong/093/2004株(简称A/D/SD/04)的全基因序列(包括5′和3′端的非编码区序列).A/D/SD/04的基因组核苷酸全序列与18株网上公布的禽流感基因序列进行比较和分析,结果与4株鸭源h5n1的5～7个基因具99%以上的同源性;与14株h5n1有至少一个以上内部基因同源性在95%以上.与h9亚型AIV代表株A/Quail/hongkong/G1/97(简称G1株)和A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)比较,除了非结构基因(nonstructural gene,nS)与G1株的同源性为95.3%外,其余基因均在36.6%～92.1%之间.说明A/D/SD/04没有h9n2基因的直接整合,是h5n1毒株在自然界的重组株.推导的hA氨基酸序列分析,A/D/SD/04 的血凝素(heamgglutinin,hA)裂解位点与比较的16株AIV的序列一致,是高致病性禽流感的分子特征(PQRERRRKKR/G),第226位氨基酸是对禽类和哺乳细胞均具有亲嗜性的蛋氨酸(Met).神经氨酸酶(neuraminidase,nA)在第48位氨基酸(颈部)后有20个氨基酸的缺失,但非结构蛋白(nS)没有在79～84氨基酸发生缺失.碱性聚合酶2(PB2)的627位氨基酸是亲禽类细胞的谷氨酸(Glu,E).结合生物学特性和分子特征,A/D/SD/04对小鼠的致病力是由多种因素决定,其可能是一株对鸡高度致病,并逐渐获得对哺乳动物致病能力的中间重组病毒.

关键词： h5n1亚型禽流感病毒通用引物全基因组序列序列分析

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h5n1亚型禽流感病毒拯救体系的建立

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微生物学报 2006年第1期46卷 55-59页

作者：龙进学吴艳涛张小荣王曲直刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009

选择鸡胚高产的鸭源h5n1亚型禽流感病毒A／Duck／Shandong／093／2004株作为骨架病毒，在完成了全基因组序列测定基础上，设计合成的11对引物对病毒的8个基因分11段进行扩增。通过与转录载体PhW2000连接，构建A／SD／04的8个基因的拯救... 详细信息

选择鸡胚高产的鸭源h5n1亚型禽流感病毒A／Duck／Shandong／093／2004株作为骨架病毒，在完成了全基因组序列测定基础上，设计合成的11对引物对病毒的8个基因分11段进行扩增。通过与转录载体PhW2000连接，构建A／SD／04的8个基因的拯救载体，经测序获得序列准确的拯救质粒：241、242、243、244、245、246、247和248。A／SD／04的8质粒与PR8（h1n1）进行不同组合的拯救，获得8个均含A／SD／04hA基因的h5重组流感病毒。鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价在2^8-2^10，EID50在10^-8.5 - 10^-9之间，MDT在34～46h之间，均与野生A／SD／04（wt A／SD／04）相似。重组病毒对6周龄的SPF鸡的静脉接种指数（IVPI）与wt A／SD／04却有明显的差异，说明不同组合的内部基因影响病毒对鸡的致病力，但不影响病毒的鸡胚致死能力、对鸡胚的感染能力和病毒在鸡胚中的繁殖能力。构建的A／SD／04的8个质粒拯救系统，为h5nI的基因功能研究和新型疫苗开发奠定基础。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒 8质粒拯救系统病毒拯救重组病毒

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h5n1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

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微生物学报 2005年第1期45卷 58-61页

作者：郑其升张晓勇刘华雷李鹏陈溥言南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室南京210095

根据GenBank公布的h5n1亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素 (hA)基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增h5n1亚型禽流感病毒hA1基因 ,将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中 ,构建原核表达载体pET_hA1。阳性质粒转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱... 详细信息

根据GenBank公布的h5n1亚型禽流感病毒 (AIV)血凝素 (hA)基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增h5n1亚型禽流感病毒hA1基因 ,将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中 ,构建原核表达载体pET_hA1。阳性质粒转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导 ,hA1基因获得表达 ,重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 ,确定了表达hA1基因的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 8mmol L ,诱导时间为 3h。Westernblot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测h5亚型AIV抗体的ihA_ELISA方法。结果表明 ,抗原的最佳包被浓度为 4 μg mL ,血清的最佳稀释度为 1∶2 0 0 ,阳性标准初步定为 :OD待检血清>0 5 ,且OD待检血清 OD阴性血清 >2。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒血凝素基因原核表达 ihA—ELISA

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h5n1亚型禽流感病毒nS第263~277位核苷酸缺失提高病毒对鸡的致病力

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微生物学报 2006年第2期46卷 301-305页

作者：龙进学薛峰彭宜顾敏刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室扬州225009

为研究2000年以来绝大多数h5n1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义，构建h5n1A／D／SD／04株hA、nA、nS的全基因表达／转录载体，以及nS的删除突变载体（m248），A/D/YZ/04株的nS基因表... 详细信息

为研究2000年以来绝大多数h5n1亚型禽流感病毒分离株在非结构基因的第263—277位发生15个碱基缺失现象的生物学意义，构建h5n1A／D／SD／04株hA、nA、nS的全基因表达／转录载体，以及nS的删除突变载体（m248），A/D/YZ/04株的nS基因表达／转录载体（848）和其补加15个核苷酸的nS突变载体（m848）。构建的载体分别与编码WSn（h1n1）内部基因载体进行组合转染，拯救获得4个具不同nS的重组的h5n1亚型流感病毒：RWSn-848和RWSn—m248在263-277位缺失15个碱基。RWSn-m848和RWSn-248则在相同位置不发生缺失。4个重组病毒的平均鸡胚繁殖效价（hA）、鸡胚的平均死亡时间（MDT）和鸡胚半数感染量（EID50）均无显著差异；但RWSn-848和RWSn-m248对6周龄SPF鸡的致病力明显高于RWSn—m848和RWSn-248。结果说明h5n1的nS基因在263～277位核苷酸发生缺失后，不影响重组h5n1在鸡胚中的繁殖性能，但提高了病毒对鸡的致病力。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒病毒拯救突变非结构基因nS 病毒蚀斑形成单位

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h5n1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

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中国兽医科技 2005年第6期35卷 450-454页

作者：龙进学郝贵杰唐应华刘秀梵扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009

采用活病毒免疫,常规杂交瘤融合的方法,获得了4株针对h5n1亚型禽流感病毒(AIV)A/duck/Shandong/093/2004(A/D/SD/04)株血凝素(hA)的单克隆抗体A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的h5n1AIV发生交叉免疫抑制性反应(hI),具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA),用A8E8单克隆抗体测定A/D/SD/04株对COS1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50),结果显示,A/D/SD/04株在COS1上的TCID50为10-5.33/0.1mL,在MDCK上的为10-7.33/0.1mL。将编码A/D/SD/04株的hA基因质粒与PR8质粒共转染COS1细胞后,用A8E8进行IFA,能观察到特异性绿色荧光,这与鸡胚接种结果相符。表明,用此单克隆抗体能准确地检测到h5重组病毒。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备间接免疫荧光试验

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h5n1亚型禽流感病毒感染小鼠肺组织蛋白质组分析

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中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 261-264页

作者：梁立滨赵东明李俊平李雁冰施建忠姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为鉴定禽流感病毒(AIV)感染状态下的差异表达蛋白,本研究将h5n1亚型AIV感染组与对照组小鼠肺组织蛋白样品分别进行双向电泳分离,并采用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行分析。在AIV感染72h后,共有9个表达差异显著的蛋白点(ratio>... 详细信息

为鉴定禽流感病毒(AIV)感染状态下的差异表达蛋白,本研究将h5n1亚型AIV感染组与对照组小鼠肺组织蛋白样品分别进行双向电泳分离,并采用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行分析。在AIV感染72h后,共有9个表达差异显著的蛋白点(ratio>2,p<0.05),而且该蛋白在感染组均呈上调表达。将差异蛋白进行串联质谱分析,并对其中7个蛋白进行鉴定,包括:interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3(IFIT-3)、ATP依赖的干扰素反应蛋白1(ADIR1)、γ干扰素诱导的p47鸟苷三磷酸酶(IRG)、T细胞受体a TA27、气味受体S86、胞苷单磷酸激酶2(Cmpk2)和肌球蛋白。将前3个蛋白基因采用荧光定量PCR方法进行mRnA水平的验证,所获得的结果与双向电泳结果一致。本研究为在蛋白质组水平进一步分析h5n1亚型AIV与宿主相互作用奠定了基础。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒双向凝胶电泳蛋白质组病原宿主相互作用

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h5n1亚型禽流感病毒nA基因在Sf9昆虫细胞中的表达

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2009年第7期37卷 28-32页

作者：张晓东陶玲王汉中格日勒图内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018 中国科学院武汉病毒研究所人畜共患病实验室湖北武汉430071

【目的】在Sf9昆虫细胞中表达h5n1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（nA）基因。【方法】用PCR方法克隆h5n1亚型AIVnA基因,定点插入到转移载体pFastBachTb中,构建重组转移载体pFastBachTb-nA。将其转化到含有AcBa... 详细信息

【目的】在Sf9昆虫细胞中表达h5n1亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）神经氨酸酶（nA）基因。【方法】用PCR方法克隆h5n1亚型AIVnA基因,定点插入到转移载体pFastBachTb中,构建重组转移载体pFastBachTb-nA。将其转化到含有AcBacmid和helper质粒的***10B感受态细胞中,与AcBacmid重组,获得rAcBacmid-nA。提取重组的Bacmid,转染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒vAc-nA。将vAc-nA重新感染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,3-5 d后收集被感染细胞。取转染细胞、感染细胞、破碎感染细胞上清和破碎感染细胞沉淀进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。【结果】通过PCR成功地克隆了1 352 bp的h5n1亚型AIV不含信号肽序列的nA基因;pFastBachTb-nA和rAcBacmid-nA构建成功。AIVnA基因在昆虫Sf9细胞内得到有效表达,表达产物分子质量约为52 ku,且具有免疫原性。【结论】h5n1亚型AIVnA基因在昆虫Sf9细胞中表达成功。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒神经氨酸酶杆状病毒载体真核表达

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h5n1亚型禽流感病毒hA蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

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河南农业科学 2024年第3期53卷 125-132页

作者：屈小天王雅楠许倩茹李雪洋张申立张二芹张改平河南农业大学生命科学学院河南郑州450046 吉林大学动物医学院吉林长春130062 河南农业大学动物医学院/国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为制备h5n1亚型禽流感病毒hA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达h5n1亚型禽流感病毒重组hA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-hA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将... 详细信息

为制备h5n1亚型禽流感病毒hA蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达h5n1亚型禽流感病毒重组hA蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-hA,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-hA通过电转化法导入根癌农杆菌EhA105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DnA,PCR鉴定结果显示,hA基因已插入到水稻基因组中,重组hA基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,hA蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组hA蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组hA蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组hA蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了h5n1亚型禽流感病毒hA重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组hA蛋白。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒 hA蛋白水稻胚乳表达蛋白质纯化

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h5n1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状及应用前景

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中国畜牧兽医 2013年第9期40卷 208-213页

作者：冯书营董仕桢张树逍河南科技大学医学院河南洛阳471003 河南科技大学医学技术与工程学院河南洛阳471003

h5n1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行,给禽类养殖业带来了巨大的经济损失。当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前最为有效... 详细信息

h5n1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行,给禽类养殖业带来了巨大的经济损失。当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前最为有效的预防措施和关键环节。因此,研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为当前禽流感防制工作的热点之一,且取得了大量的研究成果。作者从禽流感病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和RnAi技术应用等方面对h5n1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状作一综述,归纳出该领域中存在的问题和不足,并对禽流感疫苗的应用前景作一展望,以期为深入进行禽流感的防制研究提供参考。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒疫苗研究现状前景

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h5n1亚型禽流感病毒弱毒活疫苗株构建及在不同动物模型上免疫效力的评价

H5N1亚型禽流感病毒弱毒活疫苗株构建及在不同动物模型上免疫效力...

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作者：樊树芳中国农业科学院

学位级别：博士

h5n1亚型禽流感病毒不仅能感染家禽和野鸟,同时也能感染哺乳动物和人。目前,h5n1亚型禽流感病毒已经在14个国家引起300多人感染,死亡率超过50%,这对公共卫生构成了巨大威胁。研制安全有效、能够在短时间内完成大规模生产制备的大流行储... 详细信息

h5n1亚型禽流感病毒不仅能感染家禽和野鸟,同时也能感染哺乳动物和人。目前,h5n1亚型禽流感病毒已经在14个国家引起300多人感染,死亡率超过50%,这对公共卫生构成了巨大威胁。研制安全有效、能够在短时间内完成大规模生产制备的大流行储备疫苗迫在眉睫。 A/Ann Anbor/6/60 ca（h2n2）（简称AA/ca）冷适应致弱病毒具有冷适应性（cold-adapted, ca）和温度敏感性（temperature-sensitive,ts）,感染复制局限于上呼吸道,可直接鼻腔喷入接种,免疫原性良好,且具有高度生物安全性。AA/ca的ca和ts特性完全由六个内部基因决定。利用AA/ca作为内部基因供体研制出来的人类h1n1亚型、h3n2亚型人流感疫苗（Flumist）已经获得了临床应用。与传统灭活疫苗相比,冷适应流感疫苗的优势不仅仅体现在交叉免疫保护能力强、有效免疫保护持续时间长和接种途径方便等方面,而且有可能突破前者作为h5禽流感大流行疫苗存在的关键瓶颈,即灭活疫苗大规模生产所需原材料的短缺与制备时间漫长的制约。本研究以AA/ca疫苗为6个内部基因（PB2,PB1,PA,nP,M和nS）供体,以我国流行的抗原性具有代表性的h5n1亚型禽流感病毒,A/Anhui/2/2005 （我国人禽流感分离株,简称Ah/05）、A/bar-headed/Qinghai/3/2005（目前亚洲、欧洲和非洲流行分布最广的候鸟传播代表株,简称BhG/05）为表面抗原血凝素（hA）和神经氨酸酶（nA）基因供体,同时删除了高致病力相关的hA裂解位点多个碱性氨基酸,通过流感病毒反向遗传操作,在符合人类疫苗生产标准的低代次Vero细胞上救获了2株基因重配病毒,分别命名为Ah/AAca和BhG/AAca。实验证实,2株病毒均具有体外培养ca和ts特性,在鸡体内不能有效复制,只能在小鼠呼吸系统内复制,呈典型的冷适应低致病力表型。进一步利用BALB/c小鼠模型评价2株冷适应基因重配病毒的免疫原性和攻毒保护效力。Ah/AAca和BhG/AAca分别以106EID50（鸡胚半数感染量）剂量经鼻腔途径一次免疫小鼠,均诱导产生显著的血凝抑制（hI）抗体和中和抗体（nT）的抗体反应;间隔4周相同剂量和途径加强免疫后,均诱导产生显著增强的hI和nT抗体反应效应。 Ah/05和BhG/05分别作为hA和nA抗原同源病毒或异源病毒,以102MLD50（小鼠半数致死量）经鼻腔感染途径,分别于一次免疫后第4周和二次免疫后第4周进行攻毒保护试验。Ah/AAca和BhG/AAca一次免疫小鼠和二次免疫小鼠,对Ah/05和BhG/05分别致死攻击均产生100%的发病和死亡保护;病毒分离和滴定试验表明,一次免疫小鼠用同源病毒攻击后第3天,鼻甲骨、肺、脑、脾和肾等器官组织均未检测到病毒复制,异源病毒攻击后仅在鼻甲骨和肺脏检测到低滴度复制病毒,而未免疫对照小鼠上述器官均检测到高滴度的复制病毒;二次免疫小鼠无论同源病毒、异源病毒攻击后第3天,上述组织器官均未检测到病毒复制。为进一步评估h5n1冷适应基因重配病毒作为人类大流行储备疫苗的应用前景,采用已建立的灵长类实验动物模型,进行了系统的免疫保护效力试验。Ah/AAca按107EID50剂量鼻腔途径间隔4周两次免疫接种8只猕猴（Macaca mulatta）,另外8只猕猴以相同的途径接种PBS为对照。一次免疫及二次免疫后,所有猕猴均未发现任何临床异常表现。一次免疫后第4周,所有8只免疫猕猴均检测到对同源病毒Ah/05显著的nT抗体反应,并有5只检测到hI抗体反应;二次免疫后第2周,hI和nT抗体滴度均表现出显著的增强免疫效应,所有免疫猕猴均检测到高滴度nT和hI抗体。对异源病毒BhG/05的nT和hI抗体滴度较同源病毒低2-4倍。所有对照猕猴均未检测到nT和hI抗体反应。二次免疫后第3周,免疫和对照猕猴分别以Ah/05和BhG/05按106EID50剂量经气管内接种途径攻击。结果显示,所有免疫猕猴经同源或异源病毒攻击后临床观察均未见有异常,而对照猕猴攻毒后均出现食欲下降和体温升高等临床症状。病毒分离和滴定试验表明,免疫猕猴无论同源或异源病毒攻击后第3天及第14天,扑杀采集呼吸系统不同部位组织,均未分离到复制病毒,组织病理学检查仅有轻度支气管肺炎变化,免疫组织化学检测病毒抗原也为阴性。对照猕猴同源或异源病毒攻击后第3天呼吸系统不同部位组织均分离到高滴度复制病毒,组织病理学发现有中度或严重的支气管肺炎变化,免疫组织化学检测到肺脏存在大量病毒抗原;攻击后第14天,BhG/05感染对照猕猴呼吸系统不同部位组织已检测不到复制病毒,但Ah/05感染对照猕猴喉头扁桃体组织仍可检测到高滴度病毒复制。本研究利用反向遗传操

关键词： h5n1禽流感冷适应活疫苗小鼠模型非人类灵长动物 h5n1亚型禽流感病毒致病性 M基因

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