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中国预防兽医学报 2015年第10期37卷 733-737页

作者：田雨陈普成赵玉辉姜永萍柳金雄陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001

流感病毒在体外感染细胞的过程中,是分别通过网格蛋白(Clathrin)和小窝蛋白(Caveolae)介导的两种内吞途径进入细胞内。为探索h5n1亚型禽流感病毒(AIV)侵入细胞的其他机制,本实验在胎牛血清存在的情况下,采用Dynasore抑制剂抑制网格蛋白... 详细信息

流感病毒在体外感染细胞的过程中,是分别通过网格蛋白(Clathrin)和小窝蛋白(Caveolae)介导的两种内吞途径进入细胞内。为探索h5n1亚型禽流感病毒(AIV)侵入细胞的其他机制,本实验在胎牛血清存在的情况下,采用Dynasore抑制剂抑制网格蛋白和小窝蛋白介导的两种AIV侵入体外培养细胞途径,然而AIV仍然可以感染A549人源肺癌细胞系。进一步实验结果显示,采用巨胞饮抑制剂5-(n-乙基-n-异丙基)阿米洛利(EIPA)能够完全抑制病毒的感染,确认巨胞饮作用是AIV侵入体外培养的另外一种途径。同时,AIV也可以通过巨胞饮作用侵入不同来源的DF1禽源细胞和MDCK犬源细胞。此外,分别具有与禽源受体、人源受体和禽源-人源双重受体亲和特性的3株流感病毒仍然能够通过巨胞饮作用感染A549细胞。受体特异性试验表明,去除细胞的唾液酸受体后,病毒则不能够感染体外培养的细胞,表明唾液酸受体在巨胞饮作用的病毒侵入方式中仍然具有关键作用。本实验结果证明,巨胞饮作用是流感病毒侵入细胞的另外一种途径。该结果将有助于进一步研究流感病毒的感染机理。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒病毒入胞巨胞饮血清

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hA 226/228双位点突变对h5n1禽流感病毒受体结合特异性和致病性的影响

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中国预防兽医学报 2014年第8期36卷 590-592页

作者：谷春阳张乾义孔晖晖张莹姜永萍关云涛胡永浩陈化兰甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

禽流感病毒(AIV)主要识别SAα2,3Gal受体,而人源流感病毒主要识别SAα2,6Gal受体。本研究利用糖链受体结合特性检测方法检测表明,h5n1 AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)可以同时识别SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受体,然而hA 226位谷氨酸(Q... 详细信息

禽流感病毒(AIV)主要识别SAα2,3Gal受体,而人源流感病毒主要识别SAα2,6Gal受体。本研究利用糖链受体结合特性检测方法检测表明,h5n1 AIV A/duck/Guangxi/35/2001(DK/35)可以同时识别SAα2,3Gal和SAα2,6Gal受体,然而hA 226位谷氨酸(Q)到亮氨酸(L)和228位甘氨酸(G)到丝氨酸(S)的双突变,可以导致DK/35更倾向于识别SAα2,6Gal受体。对BALB/c小鼠致病性试验显示,突变病毒株(rDK/35(Q226L/G228S))对小鼠的致病力比野毒株弱,其MLD50为4.7 log10EID50,而DK/35为1.8 log log10EID50。本研究表明h5n1 AIV通过突变可以获得优先与SAα2,6Gal受体特异性结合的能力,为h5n1 AIV的监测预防和对公共卫生风险评估提供一定的参考依据。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒受体结合特异性致病性

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h5n1禽流感病毒hA和nA部分蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

H5N1禽流感病毒HA和NA部分蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

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作者：姚艳湖南农业大学

学位级别：硕士

禽流感(avian influenza，AI)是A型流感病毒引起的禽类感染疾病综合征，其临床表现包括亚临床感染、中轻度的呼吸系统疾病、产蛋下降和严重的致死性疾病。由h5n1亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的高致病性禽流感(highly... 详细信息

禽流感(avian influenza，AI)是A型流感病毒引起的禽类感染疾病综合征，其临床表现包括亚临床感染、中轻度的呼吸系统疾病、产蛋下降和严重的致死性疾病。由h5n1亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，hPAI)是近几年来在许多国家流行、给家禽养殖业带来巨大经济损失、而且威胁到人类的健康和安全的一种烈性传染病。AIV的快速检测技术是有效控制AI流行的检测手段和重要前提，为此我们进行了该研究。本试验参照GenBank公布的禽流感病毒h5n1亚型血凝素(hemagglution hA)和神经氨酸酶(neuramindase nA)基因的核苷酸序列，设计hA基因的5′端第123～870位脱氧核苷酸和nA基因的5′端第417～1362位脱氧核苷酸特异性引物，以1株h5n1亚型禽流感病毒A／Swine／Fuiian／03 RnA为模板，通过反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法，扩增了hA(核苷酸123～870位)和nA(核苷酸417～1362位)基因cDnA。将该片段克隆测序后定向插入到原核表达载体pET-his中，构建原核表达载体pET-hA和pET-nA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，表达了hA基因和nA基因，重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间，确定了表达hA基因和nA基因的最佳诱导条件：在37℃时，用终浓度为0.5mmol／L的IPTG，诱导时间3h。用镍柱分离纯化得到纯化的重组蛋白。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测h5n1亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明，hA抗原的最佳包被浓度为320ng／孔，血清最佳稀释倍数为1：10，nA抗原最佳包被浓度为118ng／孔，血清最佳稀释倍数为1：10。对该方法进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和相关性试验，结果表明这种检测AIV血清抗体的间接ELISA方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点，为h5n1亚型禽流感检测试剂盒的研制奠定了基础。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒血凝素基因神经氨酸酶原核表达间接ELISA

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表达h5n1禽流感病毒hA基因重组腺病毒的构建及免疫保护性研究

表达H5N1禽流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及免疫保护性研究

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作者：王伟东北农业大学

学位级别：硕士

h5n1亚型高致病性禽流感(highly Pathogenic Avian Influenza，hPAI)是一种严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起，h5n1病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种间屏障感染包括人类在内的多种哺乳动物。目前疫苗免疫仍然是... 详细信息

h5n1亚型高致病性禽流感(highly Pathogenic Avian Influenza，hPAI)是一种严重危害养禽业的高度传染性、致死性疾病。自1997年起，h5n1病毒在全世界范围内蔓延，并且突破种间屏障感染包括人类在内的多种哺乳动物。目前疫苗免疫仍然是预防禽流感大流行的最有效途径，现有的传统全病毒灭活苗，依赖鸡胚进行生产，耗时长，难以满足需求。因此，寻求一种能够迅速生产、廉价、高效的新型流感疫苗对于禽流感的防控具有重要的意义。腺病毒载体做为治疗基因的递送载体，具有宿主范围广、高效表达外源基因、安全性好和免疫途径简捷等优点，具有广阔的应用前景。本研究通过RT-PCR扩增h5n1亚型禽流感病毒A/wild duck/Shandong/628/2011(SD628)(Clade2.3.4)和A/wild duck/Shandong/2/2011(SD2)(Clade2.3.2.1)的hA基因，将其克隆到pShuttle-CMV中构建重组腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-SD628-hA和pShuttle-CMV-SD2-hA。采用Ad-Easy技术，制备表达禽流感病毒hA基因的复制缺陷型重组腺病毒rAd-hA(rAd-SD628-hA和rAd-SD2-hA)，将其感染AD293细胞后，可产生明显的细胞病变，通过细胞超薄切片可观察到完整的腺病毒。经RT-PCR、间接免疫荧光及westernblot证明hA基因在AD293细胞中成功转录和表达，并且表达的蛋白具有良好的生物学活性。用腺病毒纯化试剂盒纯化P4代重组腺病毒，测其TCID值，rAd-SD628-hA的病毒滴度为10TCID/mL;rAd-SD2-hA的病毒滴度为7.5×10TCID/mL。 rAd-SD628-hA经肌肉注射和滴鼻免疫BALB/c小鼠，免疫剂量分别为10TCID/只，5×10TCID/只。初免3周后，采用同种剂量、同种途径进行加强免疫。以病毒中和试验(Vn)检测小鼠血清抗体效价，二免1周，肌肉注射免疫组和滴鼻免疫组中和抗体效价达到最高分别达到1:113，1:66，中和抗体效价呈明显的上升趋势。同源SD628病毒攻毒后，腺病毒疫苗免疫组小鼠状态良好，无小鼠死亡，体重未出现明显波动。对照组小鼠精神萎靡，皮毛粗糙，体重持续下降，最低下降到原体重的81%，并且有2只小鼠死亡。以上结果表明：rAd-SD628-hA经肌肉和鼻粘膜两种途径免疫BALB/c小鼠均能够诱导良好的免疫应答反应，保护小鼠抵抗致死剂量h5n1流感病毒的攻击。 rAd-SD628-hA采用肌肉注射的方式免疫SPF鸡，初免3周后，加强免疫。二免2周后，分别用10EID剂量的同源病毒SD628、异源病毒SD2进行攻毒。血凝抑制试验(hI)检测鸡血清抗体效价。SD628攻毒组的SPF鸡以抗原A/wild duck/Shandong/628/2011(h5n1)检测hI抗体效价，攻毒前，二免2周hI抗体效价达到最高;10TCID剂量组、10TCID剂量组和Re-6灭活疫苗免疫组hI抗体效价分别达到9log2，9.16log2，6.88log2。同源SD628病毒后，10TCID剂量组有1只鸡死亡(保护率87.5%)，3只鸡排毒;10TCID剂量组没有鸡死亡，未出现鸡排毒(保护率100%);Re-6疫苗组有3只鸡排毒，没有鸡死亡(保护率100%);对照组的鸡全部死亡。结果表明：针对同源病毒的攻击，rAd-SD628-hA以10TCID剂量免疫SPF鸡在保护力和抑制排毒等方面都优于10TCID剂量，保护效果与灭活疫苗无显著差别。 rAd-SD628-hA免疫SPF鸡后，SD2攻毒组的SPF鸡以抗原A/wild duck/Shandong/2/2011(h5n1)检测hI抗体效价，二免2周，10TCID剂量组和Re-6灭活疫苗组抗体效价分别达到4log2，10.88log2。异源SD2病毒攻毒2周后，腺病毒免疫组抗体效价明显升高达到6.14log2，Re-6灭活疫苗免疫组抗体效价略有上升达到11.14log2。同时，10TCID剂量组和Re-6疫苗组的SPF鸡均未出现死亡情况(保护率100%)，但是，10TCID剂量组有4只鸡排毒，Re-6疫苗组鸡未出现排毒，对照组的鸡全部死亡。结果表明：rAd-SD628-hA以10TCID剂量免疫SPF鸡，也能抵御异源病毒的致死性攻击。本研究构建的h5n1亚型禽流感病毒重组腺病毒活载体疫苗在BALB/c小鼠和SPF鸡上均能够诱导高水平的抗体，并且可以完全保护小鼠和鸡抵抗致死性AIV的攻击，为新型流感疫苗的研发提供了理论依据。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒腺病毒表达系统 hA基因免疫效力

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h5n1禽流感病毒感染与非感染状态下鸡免疫球蛋白轻链可变区遗传多样性研究

H5N1禽流感病毒感染与非感染状态下鸡免疫球蛋白轻链可变区遗传多...

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第十七次全国动物遗传育种学术讨论会

作者：宿甲子郭将于海滨李傲楠张金玉孟继伦赵志辉吉林大学动科学院吉林长春130062 吉林大学实验动物中心吉林长春130062

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h5n1禽流感病毒可诱发帕金森病

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中国家禽 2009年第16期31卷 67-67页

禽流感（AIV）尤其是h5n1亚型禽流感病毒的致病性很强，死亡率也较高。h5n1AIV感染动物常具有明显的神经症状，如轻度脑炎、运动障碍、甚至昏迷。但还没有研究对感染h5n1AIV后的幸存者其神经系统进行长期监测。美国国立卫生研究院和埃... 详细信息

禽流感（AIV）尤其是h5n1亚型禽流感病毒的致病性很强，死亡率也较高。h5n1AIV感染动物常具有明显的神经症状，如轻度脑炎、运动障碍、甚至昏迷。但还没有研究对感染h5n1AIV后的幸存者其神经系统进行长期监测。美国国立卫生研究院和埃默里大学的科学家最新研究发现，经历1918年西班牙流感的幸存患者，年纪渐长时患帕金森病的几率比其他未感染流感的人高。

关键词： h5n1禽流感病毒帕金森病 h5n1亚型禽流感病毒美国国立卫生研究院诱发感染动物神经症状运动障碍

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病毒样颗粒为阳性对照的h5n1实时荧光定量PCR检测方法的建立

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厦门大学学报（自然科学版） 2014年第3期53卷 418-423页

作者：张国广郭迟鸣欧阳莹黄小君陈亮厦门大学生命科学学院福建厦门361102 闽南师范大学生物科学与技术学院福建漳州363000

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性h5n1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将h5n1AIV hA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DnA序列的表达载体上,诱导表达... 详细信息

合适的标准品对实时荧光定量PCR(qPCR)检测高致病性h5n1禽流感病毒(avain influenza virus,AIV)十分重要.本研究将h5n1AIV hA基因的部分序列插入到能够表达MS2噬菌体病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)DnA序列的表达载体上,诱导表达后得到了包裹有h5n1AIV hA基因RnA片段的VLP.该VLP能够耐受核酶的消化,形态与MS2噬菌体病毒颗粒形态相同.利用表达的VLP作为阳性标准品及设计的特异性荧光探针、淬灭链,使用优化的qPCR反应体系,得到qPCR检测h5n1亚型AIV的阳性对照标准曲线.研究结果为高致病性h5n1亚型AIV的准确定量检测提供了基础.

关键词： h5n1亚型禽流感病毒 qPCR 病毒样颗粒

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h5亚型禽流感病毒核蛋白基因重组质粒的构建及其在hela细胞的瞬时表达

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中国兽医科学 2006年第3期36卷 189-192页

作者：刘光亮王群童铁钢肖一红孟庆文吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

采用PCR技术从重组质粒pMel-nP扩增得到了禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang-dong/1/96(h5n1)株的核蛋白(nP)基因,将其亚克隆至真核表达载体pVAX1上。将提取的pVAX-nP阳性克隆转染hela细胞,48 h后经间接免疫荧光试验和Western-blotting检测,nP基因在hela细胞中已成功瞬时表达。表达产物的分子质量约为57 ku,它与h5n1亚型AIV多克隆抗血清有较好的免疫反应。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒 nP基因瞬时表达

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h5n1亚型禽流感灭活疫苗和DnA疫苗诱导IFn-γ应答评价

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2017年第3期38卷 1-5,10页

作者：戴华徐正中陈俊华季琰焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心/医学院江苏扬州225009

用h5n1亚型禽流感病毒(AIV)油乳剂灭活疫苗和携带h5n1亚型AIV血凝素(hA)的重组DnA疫苗pVAX1-hA分别免疫2周龄SPF鸡,共免疫3次,每次间隔4周。每次免疫后14d,每组随机取4只鸡,分离其脾脏淋巴细胞,用h5n1亚型AIV JS株灭活全病毒作为特异性... 详细信息

用h5n1亚型禽流感病毒(AIV)油乳剂灭活疫苗和携带h5n1亚型AIV血凝素(hA)的重组DnA疫苗pVAX1-hA分别免疫2周龄SPF鸡,共免疫3次,每次间隔4周。每次免疫后14d,每组随机取4只鸡,分离其脾脏淋巴细胞,用h5n1亚型AIV JS株灭活全病毒作为特异性体外刺激抗原刺激鸡脾脏淋巴细胞,72h后,检测其培养上清中特异性ChIFn-γ的水平,同时用hI试验检测免疫鸡血清抗体。结果表明:重组DnA疫苗pVAX1-hA免疫组在二次免疫后,可检测出特异性ChIFn-γ的分泌和一定水平的抗体应答;而h5n1亚型AIV灭活疫苗免疫组均未能检测出ChIFn-γ,二次免疫后能产生较高水平的抗体应答。说明DnA疫苗可激发较高水平的IFn-γ应答,而AIV灭活疫苗主要激发抗体应答,提示两者联合免疫可使免疫的禽群诱导产生强的细胞免疫应答和抗体应答,为AIV的防控提供了参考。

关键词： h5n1亚型禽流感病毒灭活疫苗 DnA疫苗 ChIFn-γ 抗体

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卵黄抗体和灭活疫苗同时注射紧急预防h5n1亚型禽流感

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中国兽医杂志 2008年第9期44卷 35-36页

作者：丁建余兴龙白霞刘春红李润成黄泽彬汪镇南刘忠华湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

禽流感(AI)是由A型流感病毒所引起的各种家禽及野生禽类的感染和疾病综合征.高致病性禽流感已被OIE列为I类烈性传染病,对养禽业构成了严重的威胁,近几年我国养禽业由此蒙受了重大的经济损失[1].1997年我国香港特区发生18例h5n1亚型禽流... 详细信息

禽流感(AI)是由A型流感病毒所引起的各种家禽及野生禽类的感染和疾病综合征.高致病性禽流感已被OIE列为I类烈性传染病,对养禽业构成了严重的威胁,近几年我国养禽业由此蒙受了重大的经济损失[1].1997年我国香港特区发生18例h5n1亚型禽流感病毒直接感染人群的病例,其中死亡6例[2],所以有效地防控高致病性禽流感具有重要的公共卫生意义.

关键词： h5n1亚型禽流感病毒紧急预防灭活疫苗卵黄抗体高致病性禽流感注射 A型流感病毒公共卫生意义

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