检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：杜利吉林大学

学位级别：硕士

脑梗死是神经系统最常见的疾病，发病率、致残率和病死率均很高，严重地危害人类的健康和生活质量。目的：本研究旨在将VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体注入大鼠短暂性脑缺血再灌注模型，探讨VEGF在急性局灶性脑缺... 详细信息

脑梗死是神经系统最常见的疾病，发病率、致残率和病死率均很高，严重地危害人类的健康和生活质量。目的：本研究旨在将VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体注入大鼠短暂性脑缺血再灌注模型，探讨VEGF在急性局灶性脑缺血疾病治疗中的作用。方法：实验组使用线栓法制备Wistar大鼠左侧大脑中动脉缺血再灌注模型。假手术组除不插线栓外，操作步骤与实验组相同。实验动物分组：取体重250-300g健康成年雄性Wistar大鼠100只，随机分5组：正常组大鼠8只（A组），假手术组8只（B组），单纯缺血组24只（C组），PBS治疗组24只（D组），VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体治疗组36只（E组）（按梗塞后不同取材时间分为1d、3d、7d、14d，4个检测时间点）。 ①行MCAO模型的大鼠术后行神经行为学评分，1～3分者入选实验。 ②大鼠于预定时间点断头取脑,使用TTC染色观察脑梗塞范围。 ③HE染色光镜观察大脑中动脉缺血大鼠脑组织病理学改变。 ④免疫组化SP法测定各脑区VEGF、CD34和CD133的表达。显微镜下观察阳性表达情况。应用SPSS18.0软件对结果进行统计学分析。 ⑤检测EGFP免疫荧光的表达。结果： ①成功制备了大鼠左侧大脑中动脉局灶性缺血再灌注模型。 ②神经行为学评分：E组神经行为学评分较其它各组明显降低，尤其是在治疗7天后。 ③TTC染色脑梗死体积：C与D组间无统计学差异，E组梗死体积明显小于C组和D组，有统计学差异（P<0.05）。 ④VEGF、CD34和CD133的表达：E组VEGF和CD34含量明显增高，与各组相比均有统计学差异（P<0.05），各组未见CD133的表达。 ⑤免疫荧光：VEGF治疗组有荧光表达，余各组无荧光表达。结论： ①VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体治疗急性缺血性脑卒中有较好的疗效，促进新生血管形成，挽救缺血半暗带，明显改善神经损伤。 ②VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体治疗急性缺血性脑卒中能够明显缩小梗死体积，减轻神经细胞和间质水肿，促进神经功能恢复。

关键词：动物模型脑缺血 hiv-1慢病毒载体血管内皮生长因子 CD34 CD133

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VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体的构建及表达

VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型HIV-1慢病毒载体的构建及表...

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作者：赵丽静吉林大学

学位级别：硕士

缺血性脑卒中是严重威胁人类健康和生命的神经系统常见疾病之一,目前尚缺乏有效的防治措施,随着生物技术的发展,基因治疗成为缺血性脑卒中研究者关注的焦点。VEGF在血管、中枢及外周神经系统中的作用已逐渐为人们所熟知,并进行了大量的... 详细信息

缺血性脑卒中是严重威胁人类健康和生命的神经系统常见疾病之一,目前尚缺乏有效的防治措施,随着生物技术的发展,基因治疗成为缺血性脑卒中研究者关注的焦点。VEGF在血管、中枢及外周神经系统中的作用已逐渐为人们所熟知,并进行了大量的实验研究,因此成为缺血性脑卒中基因治疗的理想因子。但近年来的研究发现,其治疗效果因给药途径、剂量、时间的不同而相差甚远,最佳的治疗条件仍有待大量的实验来证实,基于此本实验构建了VEGF 164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体,旨在为后续治疗条件的优化筛选提供实验基础。目的：构建VEGF164与EGFP双基因共表达的hiv-1慢病毒载体四质粒包装系统,经共转染293T包装细胞系,获得含有目的基因VEGF164与报告基因EGFP的优化新型hiv-1慢病毒载体。方法：①经RT-PCR方法扩增获得鼠源性VEGF164基因,克隆入pMD-18T载体中,得到质粒pMD18T-VEGF164;②分别对pHR’CMV-EGFP、pIRES2-EGFP进行双酶切及连接反应,构建质粒pHR’CMV-IRES2-EGFP;③分别对pMD18T-VEGF164、pHR’CMV-IRES2-EGFP进行酶切及连接反应,构建重组的载体质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP;④对重组的载体质粒进行限制性酶切鉴定并测序验证;⑤将构建好的载体质粒、pCMVΔ8.9 (包装质粒)、pCMV-VSV-G(包膜质粒)及pRSV-Rev四质粒共转染293T包装细胞系,收集细胞上清、高速离心获得慢病毒载体,并用RT-PCR、荧光显微镜观察监测质粒及慢病毒载体转染细胞后目的基因及报告基因的表达情况。结果：①RT-PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,可见三条明亮的条带,自上而下分别为645bp、573bp、441bp,分别对应VEGF188、VEGF164、VEGF121基因,进行目的片段的回收,获得了鼠源性VEGF164基因;②用限制性内切酶(Bam HI)对重组质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP进行酶切电泳,电泳图谱显示释放出约9.8Kb及573bp DNA片段,继而用限制性内切酶(BstⅪ+XhoⅠ)对该质粒进行双酶切电泳,电泳图谱显示释放出约9.7Kb及720bp DNA片段;③将质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP分别进行正反两向测序,与Genebank做对照,发现VEGF164序列上有一个碱基突变,但并不影响后期VEGF蛋白的表达;④四质粒共转染293T细胞,24小时后,荧光显微镜观察细胞呈现出绿色荧光,荧光强度在转染后48小时较强：收集的慢病毒载体再次感染293T细胞,48小时后,细胞亦呈现出绿色荧光,且每一视野EGFP阳性细胞可达70%左右,提取感染后293T细胞的总RNA,进行RT-PCR反应,可见VEGF164感染组有目的基因的表达,对照组未见阳性表达。结论：①成功的从Wistar大鼠血液中提取了总RNA, RT-PCR反应扩增获得了鼠源性VEGF164基因,并测序验证成功;②经连接反应,构建了重组的载体质粒pHR’CMV-VEGF164-IRES2-EGFP,并经酶切电泳证实构建成功;③成功构建了VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体。本实验成功构建了VEGF164与EGFP双基因共表达的优化新型hiv-1慢病毒载体四质粒包装系统,经共转染293T细胞系,收集细胞上清,高速离心获得了高滴度的优化新型hiv-1慢病毒载体,实现了VEGF164目的基因的表达,同时以EGFP基因作为报告基因可以直接观察目的基因在细胞内的表达情况,也有利于将来在活体基因治疗中进行体内或体外示踪研究。

关键词：血管内皮生长因子增强型绿色荧光蛋白 hiv-1慢病毒载体缺血性脑卒中内部核糖体进入位点

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含绿色荧光蛋白基因的优化新型hiv-1慢病毒载体的构建及表达

含绿色荧光蛋白基因的优化新型HIV-1慢病毒载体的构建及表达

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作者：李霞吉林大学

学位级别：硕士

hiv-1慢病毒载体可感染非分裂细胞,具有转移外源基因片段大、使目的基因长期稳定表达、不易诱发宿主免疫反应等优点,是脑梗死基因治疗的理想载体。本实验在慢病毒载体三质粒包装系统基础上,将野生型hiv-1基因组分装在四个质粒中,构建优... 详细信息

hiv-1慢病毒载体可感染非分裂细胞,具有转移外源基因片段大、使目的基因长期稳定表达、不易诱发宿主免疫反应等优点,是脑梗死基因治疗的理想载体。本实验在慢病毒载体三质粒包装系统基础上,将野生型hiv-1基因组分装在四个质粒中,构建优化新型hiv-1慢病毒载体四质粒包装系统:载体质粒(含指示基因——绿色荧光蛋白基因)、gag-pol质粒(包装质粒)、rev质粒和包膜质粒,经限制性酶切、电泳,证实质粒构建成功。然后经转化感受态细胞、摇菌,大量提取质粒,以备转染和测定载体滴度使用。将四质粒包装系统共转染293T包装细胞,48小时后荧光显微镜观察可见绿色荧光,证实质粒转入细胞。经收集细胞上清及高速离心获得hiv-1慢病毒载体颗粒。病毒载体再次转染293T细胞,仍可观察到绿色荧光,说明载体携带的指示基因成功融合入细胞基因组。经测定病毒滴度为4×108TU/ml,这说明假包膜VSV-G使载体颗粒的稳定性提高,通过高速离心可获得较高滴度的病毒颗粒。优化新型hiv-1慢病毒载体构建成功。四质粒系统的使用进一步减少了各质粒间的同源性,减少了重组产生有复制能力病毒的机会。

关键词： hiv-1慢病毒载体绿色荧光蛋白基因优化新型

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hiv-1缺损慢病毒载体的高滴度制备及其介导的高效基因转移

引用

微生物学报 2007年第6期47卷 1060-1065页

作者：曾令兵张林孟彦 Yuanan Lu 叶林柏中国水产科学研究院长江水产研究所荆州434000 Retrovirology Research Laboratory Pacific Biosciences Research Center University of Hawaii at Manoa Honolulu Hawaii 96822 USA 武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室武汉430072

近来,慢病毒载体引起了极大关注,己成为转基因操作中重要的工具。用编码病毒组份的三质粒系统共转染293T包装细胞系,建立了大量制备hiv-1缺损慢病毒载体的方法,病毒载体的度可达到1.1×107IU/mL,离心浓缩可将载体滴度提高100倍以上... 详细信息

近来,慢病毒载体引起了极大关注,己成为转基因操作中重要的工具。用编码病毒组份的三质粒系统共转染293T包装细胞系,建立了大量制备hiv-1缺损慢病毒载体的方法,病毒载体的度可达到1.1×107IU/mL,离心浓缩可将载体滴度提高100倍以上。hiv-1缺损慢病毒载体可以高效转导人淋巴瘤等多种来源的细胞,RT-PCR检测显示外源基因GFP稳定表达达18个月以上,长期传代观测未检出p24抗原蛋白或可复制病毒。

关键词： hiv-1慢病毒载体制备高滴度基因转移效率

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