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鸭卵黄免疫球蛋白的提纯及兔抗鸭IgY(H+L)hrp标记抗体的制备

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中国兽医杂志 2007年第1期43卷 10-12页

作者：孙凌霜齐岩王彬史楠王君伟东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

鸭免疫抗体的准确、灵敏检测不仅有助于鸭免疫系统的研究,更有助于鸭类疾病的预防和控制.我国是世界养禽大国,更是世界主要鸭类养殖地和消费国,鸭类疾病的防控直接影响到我国鸭类养殖业的持续、健康、快速发展.

关键词：免疫抗体卵黄免疫球蛋白 hrp标记鸭类制备提纯免疫系统养殖业

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向蜡嘴、锡嘴雀耳蜗内注入hrp标记的研究

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野生动物 1991年第2期12卷 38-40页

作者：曾庆华林来风东北师大生物学系神经生物学研究室

发声是一种复杂的综合性的活动,它可由不同的刺激因素诱发,其中听觉与发声中枢的关系则是十分密切的,特别是在鸣禽类,听觉反馈对它的发声学习鸣啭能力有着极其重要的作用。国外的学者对这方面的工作进行了一定的研究。而国内尚未见有这... 详细信息

发声是一种复杂的综合性的活动,它可由不同的刺激因素诱发,其中听觉与发声中枢的关系则是十分密切的,特别是在鸣禽类,听觉反馈对它的发声学习鸣啭能力有着极其重要的作用。国外的学者对这方面的工作进行了一定的研究。而国内尚未见有这方面工作报导。Nottebohm(1979)提出金丝鸟的发声学习与听觉中枢反馈联系密切,幼龄鸟是通过模仿亲鸟或同类成鸟的鸣叫来学习发生的。如果幼龄鸟在学习发声阶段的某一临界期致聋以后将出现发声和鸣叫的异常(Marler 1977),从而说明听觉信息的传递对维持成体的鸣叫是至关重要的。对于控制蜡嘴、锡嘴雀两种鸣禽发声的主要中枢及传出神经通路,我们曾进行了一定的研究,证明在端脑内由上纹状体腹部尾侧(Hyperstriatumvertrale pars caudalis,HVC)发出纤维投射到原纹状体粗核(Nucleus robustus archistriatalis,

关键词：蜡嘴雀锡嘴雀耳注射 hrp标记

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内脏(盆神经)和躯体(坐骨神经)初级传入终末在猫骶髓后连合核的汇聚——溃变和hrp标记电镜研究

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神经解剖学杂志 1989年第1期 20-20页

作者：杜彦军秦秉志李继硕第四军医大学解剖学教研室第四军医大学解剖学教研室

李继硕、秦秉志发现:来自膀胱壁的内脏初级传入纤维和来自坐骨神经初级传入纤维都有部分投射到骶髓后连合核,且两者互相重叠,推测该核区是内脏和躯体初级传入的会聚处。本实验用猫7只,以10％Ricin CA60 3μl注射于一侧胫神经和腓神经;... 详细信息

<正> 李继硕、秦秉志发现:来自膀胱壁的内脏初级传入纤维和来自坐骨神经初级传入纤维都有部分投射到骶髓后连合核,且两者互相重叠,推测该核区是内脏和躯体初级传入的会聚处。本实验用猫7只,以10％Ricin CA60 3μl注射于一侧胫神经和腓神经;3天后,以30％hrp(Toyobo)3μl注射于同侧盆神经,其中3只同时注射hrp 0.1μl于同侧臂旁核(PBL),再存活3天。以含2％多聚甲醛和2％戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)灌注动物。

关键词：连合核 hrp标记初级传入终末腓神经臂旁核电镜研究胫神经膀胱壁核区磷酸盐缓冲液

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肠神经对鸡输卵管支配的逆行追踪法研究

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中国兽医学报 2003年第6期23卷 585-587页

作者：陈秋生黄国庆刘仪南京农业大学动物医学院江苏南京210095

应用 hrp和 CB- hrp逆行追踪支配鸡输卵管神经元在肠神经内的分布和形态特点 ,以探察鸡肠神经在体内的支配范围以及肠神经对生殖系统的可能调节作用。结果显示 ,肠神经内出现大量阳性神经元和神经纤维 ,这些神经元大多数为小型多极神经... 详细信息

应用 hrp和 CB- hrp逆行追踪支配鸡输卵管神经元在肠神经内的分布和形态特点 ,以探察鸡肠神经在体内的支配范围以及肠神经对生殖系统的可能调节作用。结果显示 ,肠神经内出现大量阳性神经元和神经纤维 ,这些神经元大多数为小型多极神经元 ,少数是双极神经元。阳性细胞主要位于肠神经节内 ,节间束也见个别分布。这就从形态上证实 ,肠神经支配并调节鸡的生殖活动。本研究还比较了 hrp和 CB- hrp

关键词：肠神经鸡输卵管神经支配逆行追踪法 hrp标记 CB-hrp标记

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三叉神经领域本体感觉中枢通路新发现的两个核团(AVM、ADO)的位置、形态及细胞构筑

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神经解剖学杂志 1998年第2期14卷 135-141页

作者：桂兰润王百忍李继硕第四军医大学解剖学教研室梁琚脑研究中心西安710032

将hrp溶液注入丘脑腹后内侧核的特定部位，在王百忍等发现的“带状区”（三叉神经本体觉中枢通路的三级神经元所在地）的腹侧部标记出AVM和ADO两个小核团。用图象分析仪研究了此二小核团的形态、位置、细胞构筑和进行了三维重建图象分... 详细信息

将hrp溶液注入丘脑腹后内侧核的特定部位，在王百忍等发现的“带状区”（三叉神经本体觉中枢通路的三级神经元所在地）的腹侧部标记出AVM和ADO两个小核团。用图象分析仪研究了此二小核团的形态、位置、细胞构筑和进行了三维重建图象分析；并结合免疫组织化学方法，分化了ADO和AS区的关系。本文的结果确证了AVM、ADO两个小核团的存在，对它们的位置、形态和细胞构筑做了确切的观察，搞清了它们和周围结构的位置关系，为在脑内此二新核团的发现提供了科学且可靠的根据。本研究还对ADO和AS区进行了分化，证明ADO是区别于A5区的独立的小核团。

关键词： AVM ADO hrp标记免疫组织化学图象分析大鼠

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基于表面原子转移自由基聚合和纳米探针的生物分析新方法

基于表面原子转移自由基聚合和纳米探针的生物分析新方法

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作者：吴亚锋东南大学

学位级别：博士

复杂生物样品中与疾病相关生物分子的灵敏、快速、准确检测对于研究疾病的发生发展、疾病诊断与治疗等具有十分重要的意义。但由于在疾病的发生发展初期，相关生物分子在组织或血液中表达很低，利用常规方法无法检测到，难以实现疾病的... 详细信息

复杂生物样品中与疾病相关生物分子的灵敏、快速、准确检测对于研究疾病的发生发展、疾病诊断与治疗等具有十分重要的意义。但由于在疾病的发生发展初期，相关生物分子在组织或血液中表达很低，利用常规方法无法检测到，难以实现疾病的早期诊断，因此发展生物分析新原理新方法，实现生物检测的信号放大并有效提高检测灵敏度，是目前生物分析化学领域的热门课题。本论文围绕生物分子检测的信号放大方法需求，基于表面原子转移自由基聚合和纳米探针，开展了以下三个方面的工作:\n 1、表面原子转移自由基聚合反应基础及其生物传感应用\n 将引发剂分子通过共价键合的方式与DNA或蛋白质分子偶连，研究固体表面生物分子存在时原子转移自由基聚合反应原理及基础条件。进一步利用DNA杂交或夹心免疫反应将标记有引发基团的生物分子固定到电极或基质表面，选择具有侧链功能基团的单体进行原子转移自由基聚合反应。该聚合反应由引发基团数量（固定的标记生物分子数量）及其外部条件（催化剂、单体量、温度、溶剂等）控制，当引发基团数量（生物分子浓度）确定时，聚合物的生长使成百上千个单体分子聚集形成长链聚合物，由于聚合物的侧链带有功能基团且能与电化学或光学活性物质发生键合反应，从而显著增加了单元生物分子识别反应的信号分子负载量，实现了生物分子检测的信号放大，提高了检测灵敏度。\n 基于这种表面原子转移自由基聚合反应辅助的信号放大方法，成功地构建了四种生物传感器:\n (1) DNA/卵清蛋白(ovalbumin)电化学传感器。利用DNA杂交或分子特异性识别将标记有引发基团的DNA检测探针或ovalbumin固定到电极或金片表面，选择具有活性羟基的甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)或具有环氧基的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)单体进行原子转移自由基聚合反应。椭圆偏振计数据表明，金片上形成的聚合物的厚度大约为20 nm。形成的长链聚合物的侧链带有羟基或环氧基能与电化学活性物质氨基二茂铁(FcNH2)发生键合反应，键合在聚合物链上的二茂铁衍生物具有灵敏的电化学响应，可用于溶液中DNA/ovalbumin的测定。最优实验条件下，DNA浓度的对数在浓度为0.1～1000 nM范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限为15 pM; ovalbumin浓度的对数在浓度为在0.1～500ng mL-1范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限为0.07 ng mL-1。\n (2)前列腺抗原(PSA)/癌胚抗原(CEA)电化学传感器。利用夹心免疫反应将标记有引发基团的PSA或CEA固定到电极或金片表面，以GMA为单体进行原子转移自由基聚合反应。通过形成的长链聚合物侧链上环氧基嫁接FcNH2，制得灵敏的PSA/CEA电化学传感器。最优实验条件下，PSA和CEA浓度的对数分别在浓度为0.001～40 ng mL-1及0.0005～40 ng mL-1范围内与电化学信号呈良好的线性关系，其检测限分别为0.14 pg mL-1和0.10 pg mL-1。制得的传感器分别对60个PSA和40个CEA临床血样进行了检测，所得结果与临床电致化学发光方法得到的结果一致。\n (3) PSA电化学和流动注射化学发光免疫传感器。利用夹心免疫反应将标记有引发基团的PSA固定到电极或金片表面，以GMA为单体进行原子转移自由基聚合反应。利用长链聚合物侧链上丰富的环氧基团与具有电化学和化学发光活性的辣根过氧化物酶(hrp)分子中的活性氨基之间的化学反应，将hrp偶联在聚合物表面，制得PSA免疫传感器。最优条件下，PSA在浓度为0.0005～20 ng mL-1范围内分别与电化学信号及流动注射化学发光信号呈良好的线性关系，其检测限分别为1.3 pg mL-1和4.0 pg mL-1。电化学信号和流动注射化学发光信号较传统的用hrp标记的抗体作为信号分子的检测信号分别放大了14和13倍。\n (4) CEA电致化学发光(ECL)传感器。利用夹心免疫反应将标记有引发基团的CEA固定在电极或金片表面，选择具有环氧基的GMA单体进行原子转移自由基聚合反应，并将具有ECL活性的N,N-二异丙基乙二胺(DPEA)偶联在形成的聚合物的侧链上，制得CEA电致化学发光传感器。最优实验条件下，CEA在浓度为0.001～1000 ng mL-1范围内与ECL信号呈良好的线性关系，其检测限为0.5 pg mL-1。\n 基于表面原子转移自由基聚合反应辅助的信号放大方法构建的生物传感器具有灵敏度高、选择性强、检测范围宽等优点，可用于检测低浓度的DNA和蛋白质，为肿瘤疾病的早期诊断与治疗提供了新途径。\n 2、基于纳米生物探针的信号放大方法及其在生物传感中的应用\n 将信号分子负载在二氧化硅(SiO2)纳米粒子表面

关键词：原子转移自由基聚合反应纳米探针生物检测电化学响应 hrp标记

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Ⅰ型鸭病毒性肝炎的逆转录套式PCR检测

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中国畜牧兽医 2009年第4期36卷 143-145页

作者：黄成斌潘玲毛火云黄显明安徽农业大学动物科技学院合肥230036

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)系由鸭肝炎病毒(duck viral hepatitis virus,DHV)引起的幼龄鸭易感的重度致死性疾病,以传播迅速、病程短及引起肝脏出血性病变为特征.鸭肝炎病毒有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3种血清型.中国主要流行Ⅰ型(王升... 详细信息

鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis,DVH)系由鸭肝炎病毒(duck viral hepatitis virus,DHV)引起的幼龄鸭易感的重度致死性疾病,以传播迅速、病程短及引起肝脏出血性病变为特征.鸭肝炎病毒有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3种血清型.中国主要流行Ⅰ型(王升炳,2007).鸭病毒性肝炎常用的诊断方法很多,中和试验被认为是最可靠、最经典的诊断方法(王勇等,2007);张小飞等(2005)以鼠抗DHV抗体为一抗,hrp标记的羊抗鼠IgG为二抗,建立了检测石蜡切片中DHV抗原的免疫酶组化法.

关键词： Ⅰ型鸭肝炎病毒套式PCR检测鸭病毒性肝炎逆转录 cDNA文库诊断方法 virus hrp标记

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产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测

产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测

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作者：王苗利山东农业大学

学位级别：硕士

为了认识α毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布,深入探讨产气荚膜梭菌的肠源毒血症的致病机理,本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌α毒素的多克隆抗体,并以此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒... 详细信息

为了认识α毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布,深入探讨产气荚膜梭菌的肠源毒血症的致病机理,本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌α毒素的多克隆抗体,并以此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位,阐明了产气荚膜梭菌毒素的分布状况,揭示了家畜猝死症的致病机理。首先在厌氧条件下培养复活了A型产气荚膜梭菌标准菌株,提取DNA模板,设计特异性的引物,并对其α毒素的全长基因进行PCR扩增、克隆。以常规基因重组技术,将回收的目的基因片段插入原核表达载pET28a,得到重组质粒,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),转化完成后,用IPTG诱导表达,摸索诱导最优条件后,将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳,并经镍柱亲和纯化目的蛋白;PBS透析,Western blot检测了蛋白的特异性。将表达并纯化的α毒素蛋白500μg混以免疫弗氏佐剂免疫家兔四次,定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度,获得多克隆抗体。将产气荚膜梭菌接种产毒培养基,厌氧环境45C、4h培养,取培养液常规硫酸铵法提取外毒素,用灭菌生理盐水稀释,腹腔皮下注射小鼠,取72h内死亡小鼠的器官组织:心、肝、脾、肺、肾、胃,小肠、延脑,投入4%多聚甲醛中固,然后制作组织切片,用自制的兔抗α毒素多克隆抗体作为一抗,hrp(辣根过氧化物酶)和FITC(荧光素)分别标记的羊抗兔IgG,作为二抗。通过免疫组织化学法对患产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位检测。结果表明,PCR扩增出长度为1228 bp的产物,通过Blast比对,确认为α毒素基因;对表达载体pet28a和含有目的基因的重组T载体分别进行双酶切,并将酶切后的线性pet28回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接,成功构建了pet28a-α表达载体。经IPTG诱导、表达产物经SDS-PAGE电泳,获得大小为45KD特异的表达条带,表达量可达42.1%。Western blot结果证明表达的目的蛋白具有高度的特异性。以表达的α毒素蛋白为抗原,四次免疫家兔后,获得得多克隆抗体经ELISA测定,其效价为1 : 512,000。经免疫组织化学法对器官的毒素分布检测指出,在小鼠的延髓、肠、肾、肺、胃的组织细胞胞浆中发现了阳性颗粒,说明α毒素随血液循环系统进入并侵害了动物的延髓、肠、肾、肺、胃等组织。在脾、肝的血管内发现阳性颗粒,但在主质细胞中未发现毒素分布,说明毒素无法侵害脾肝的主质细胞。研究显示,本实验成功的制备了高效价的兔抗α毒素多克隆抗体,免疫组化结果提示,首次在延髓的细胞胞浆中发现了α毒素,延髓是生命中枢、呼吸、心血管中枢,毒素的侵害使其紊乱,加之毒素对消化系统呼吸系统及肾脏的毒害作用,导致动物死亡。

关键词：产气荚膜梭菌 α毒素家畜猝死症及其机理多克隆抗体免疫组化 hrp标记 FITC标记

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酶标白桂木凝集素糖蛋白结合特性的分析

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中国生物化学与分子生物学报 2000年第2期16卷 210-214页

作者：吴耀生张红周素芳邓勇周德义林文珍广西医科大学生物化学教研室南宁530021

采用辣根过氧化物酶 ( hrp)标记白桂木凝集素 ( AHL) ,应用酶联夹心法及糖竞争抑制实验 ,研究 AHL的糖蛋白结合特性 .研究表明 ,AHL能与两种不同类型的糖蛋白结合 ,一类以胃蛋白酶为代表 ,AHL能以高亲和力与胃蛋白酶结合 .其次能与β-... 详细信息

采用辣根过氧化物酶 ( hrp)标记白桂木凝集素 ( AHL) ,应用酶联夹心法及糖竞争抑制实验 ,研究 AHL的糖蛋白结合特性 .研究表明 ,AHL能与两种不同类型的糖蛋白结合 ,一类以胃蛋白酶为代表 ,AHL能以高亲和力与胃蛋白酶结合 .其次能与β-乳球蛋白、牛血清清蛋白结合 ,但结合力依次递减 .AHL也能与透明质酸以较高亲和力相结合 .AHL与胃蛋白酶、β-乳球蛋白、牛血清清蛋白、透明质酸的结合受 Me- Gal的强烈竞争抑制 ,亦受 Me- Man\D- Gal\Raf的抑制 .另一类为Con A,AHL与 Con A的结合受 Me- Man的强烈竞争抑制 ,并受 Me- Glc\D- Man\D- Fru\D- Glc的较强抑制 .各种糖的封闭性抑制实验结果与竞争性抑制实验相似 .提示 AHL上存在 O-糖苷键结合位点 .

关键词：白桂木凝集素糖蛋白结合特性 hrp标记

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牛病毒性腹泻病毒野毒株的分离鉴定

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中国预防兽医学报 2000年第6期22卷 463-464页

作者：钟发刚王新华沈敏温建新张银国新疆农垦科学院畜牧兽医研究所石河子832000

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