检索结果-内蒙古大学图书馆

生物化学与生物物理进展 2013年第11期40卷 1107-1115页

作者：杨旺陈松杨振德肖昕廖芳华中科技大学同济医学院基础医学院病原微生物教研室武汉430030

对于包括铜绿假单胞菌在内的众多微生物而言,群体感应系统是细菌表达毒力因子的重要调节子.las和Rhl是群体感应两个主要组成部分.las和Rhl分别受自诱导剂N-3-氧化十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)和N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(C4-H... 详细信息

对于包括铜绿假单胞菌在内的众多微生物而言,群体感应系统是细菌表达毒力因子的重要调节子.las和Rhl是群体感应两个主要组成部分.las和Rhl分别受自诱导剂N-3-氧化十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)和N-丁酰-L-高丝氨酸内酯(C4-HSL)的影响.最近的研究进展显示群体感应分子尤其是3-oxo-C12-HSL具有调节宿主免疫系统的能力.本实验展示了3-oxo-C12-HSL可以诱导鼠源巨噬细胞(RAW264.7)的凋亡和吞噬作用.把合成的3-oxo-C12-HSL加入RAW264.7细胞培养基中,发现细胞生活力以一种依赖于3-oxo-C12-HSL的浓度(6.25 to 100μmol/L)和培养时间(2 to 24 h)的方式逐渐丢失.同样,我们观察到3-oxo-C12-HSL的细胞毒活性,用3-oxo-C12-HSL处理的细胞出现细胞形态上的改变,这一改变表明3-oxo-C12-HSL处理的细胞加速凋亡,这一点同时也被其他多个标准(caspases3、8和9,线粒体膜电位,磷脂酰丝氨酸的表达)所证实.中性红吞饮实验证明,3-oxo-C12-HSL会显著地减小RAW264.7细胞的吞噬能力(P<0.05).同时,高浓度的3-oxo-C12-HSL会降低RAW264.7细胞对铜绿假单胞菌的吞噬作用(P<0.001).这些数据表明3-oxo-C12-HSL能特异性地促进细胞凋亡的诱导和RAW264.7细胞吞噬能力的减小.这可能和3-oxo-C12-HSL诱导的细胞毒性有关.最终我们的实验数据证明,群体感应信号分子3-oxo-C12-HSL在铜绿假单胞菌感染的致病机理中扮演着重要的角色.

关键词：铜绿假单胞菌 las系统信号分子群体感应系统细胞凋亡吞噬作用

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铜绿假单胞菌las系统信号分子对小鼠巨噬细胞的影响

铜绿假单胞菌Las系统信号分子对小鼠巨噬细胞的影响

引用

作者：许娜娜华中科技大学

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）俗称绿脓杆菌,属革兰阴性杆菌,广泛分布于水、空气、土壤及医院环境中,同时也是人体的正常菌群。本菌的感染多见于皮肤粘膜受损部位,如烧伤、创伤等,也见于因长期化疗或使用免疫抑制剂的患... 详细信息

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）俗称绿脓杆菌,属革兰阴性杆菌,广泛分布于水、空气、土壤及医院环境中,同时也是人体的正常菌群。本菌的感染多见于皮肤粘膜受损部位,如烧伤、创伤等,也见于因长期化疗或使用免疫抑制剂的患者。在医源性感染中由本菌引起者约占10%,在某些特殊病房中,如烧伤和肿瘤病房、各种导管和内窥镜的治疗与检查室内,本菌感染率可高达30%。它是一种能引起急慢性感染的机会致病菌,特别是引起肺部感染。它是引起囊性肺纤维化、弥漫性泛支气管炎及支气管扩张症等病人死亡的主要病原体。由于其对抗生素的耐药性使其感染几乎不可能被清除而导致肺衰竭最终导致死亡。这促使人们开始致力于研究其感染的机制,从而从根本上寻找新的抗感染途径。近年来的研究发现细菌可以根据特定信号分子的浓度来监测周围环境中自身的数量变化,当信号分子达到一定的阈值浓度时,可与相应受体结合,激活菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化,完成这一信号传导的普遍存在于革兰阴性菌和革兰阳性菌中的系统被称为细菌密度感知信号（Quorum-sensing,QS）系统。在革兰阴性菌中,对QS系统研究最为深入的是铜绿假单胞菌,该菌的信号系统在调控铜绿假单胞菌各种毒力因子表达中起重要作用。随着对该系统的深入研究,已经证实细菌细胞间信号系统是由参与毒力基因表达的调控多基因组成的,同时也明确了细胞间信号系统基因群是一个复杂的级联系统。这个级联系统包括两个主要的转录调节因子lasR和rhlR和几个其它组成元素。近年来又发现了铜绿假单胞菌的由QS系统控制并且调控lasB的转录的喹诺酮信号级联系统。目前的研究成果表明,las系统在铜绿假单胞菌QS系统中位于信号级联系统的顶层。lasR-3-oxo-C12-HSL复合物可以正向调控rhlR和rhlI的转录;喹诺酮信号系统中的醌类物质（PQS）是连接las系统和Rhl系统的纽带。不论在哪一个细胞间信号系统中,las系统均处于中心地位。当细菌密度较低的时候,仅产生基础水平的3-oxo-C12-HSL,当密度升高时,3-oxo-C12-HSL亦随之升高直至阈值浓度,此时3-oxo-C12-HSL便和lasR结合,lasR-3-oxo-C12-HSL复合体主导网络调控并激活下游特定基因的转录,从而激活包括绿脓菌素等在内的一系列致病因子的表达。近年来已有研究提示密度感知系统本身就可能是一种毒力因子,并且可以直接作用于宿主细胞,抑制宿主免疫反应,从而导致机体更易于被感染。综合以前学者的研究讨论工作,强烈提示信号分子能够改变铜绿假单胞菌感染后的宿主免疫反应并可能是宿主免疫应答反应的重要调节因子。宿主体内存在着比较完善的免疫系统。该系统由免疫器官、免疫细胞以及免疫分子组成。在感染免疫过程中,各免疫器官、组织、细胞和免疫分子间互相协作、互相制约、密切配合,共同完成复杂的免疫防御功能。而致病菌侵入人体后,首先遇到的是固有免疫功能的抵御。固有免疫主要由组织屏障和某些免疫细胞、免疫分子等组成。而巨噬细胞作为机体重要的分泌细胞因子的固有免疫应答细胞,具有吞噬颗粒性抗原及吞饮可溶性抗原的作用。此外,巨噬细胞作为炎症阶段的主要吞噬细胞,负责清除机体损伤处组织和细胞的坏死碎片以及病原体等,这些物质对创伤愈合过程都有重要的调控作用。因此,巨噬细胞的活化对于机体早期抗感染免疫具有一定作用。故以巨噬细胞凋亡和吞噬等细胞行为学变化为研究靶点,可成为筛选和开发新型免疫调节药物的新策略。我们通过化学合成铜绿假单胞菌las系统信号分子3-oxo-C12-HSL分子,观察其对小鼠巨噬细胞株RAW264.7的基本生物效应,为进一步研究细菌与宿主之间相互作用提供初步实验依据。本研究工作分以下二个部分: 一、铜绿假单胞菌las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞活力及凋亡影响的检测 1、铜绿假单胞菌las系统信号分子3-oxo-C12-HSL对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞活力影响的检测挑选一瓶状态好的细胞用0.25%的胰酶消化吹打混匀成密度约为8×10～6/ml的细胞悬液,以200μL/孔的量接种到96孔培养板中（周边孔用PBS填充）37℃5%CO2培养箱中培养过夜后,细胞贴壁生长,将孔板中的培养基弃去,加入不含胎牛血清的DMEM200μL/孔,各孔分别加入信号分子3-oxo-C12-HSL使其终浓度为100,50,25,12.5,6.25μM及对照孔（加等量的DMSO）,每组设6个复孔,信号分子3-oxo-C12-HSL作用2h或4h后吸去孔中培养基,用PBS洗两遍,然后加入180μL/孔不含胎牛血清的DMEM并同时加入20μL/孔MTT,继续培养4h,4h后将上清弃去,每孔加入

关键词：铜绿假单胞菌 las系统信号分子小鼠巨噬细胞株RAW264.7 凋亡免疫调节凋亡通路吞噬活性

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