检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：吴芷莹南华大学

学位级别：硕士

目的:以课题组前期分离鉴定的裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体PHW2为研究对象,鉴定其受体结合蛋白及受体。为进一步阐明pb1噬菌体的宿主识别机制奠定基础。方法:提取噬菌体PHW2的DNA进行基因组测序,通过Gene Mark S、NCBI、Uni Prot... 详细信息

目的:以课题组前期分离鉴定的裂解多重耐药铜绿假单胞菌的噬菌体PHW2为研究对象,鉴定其受体结合蛋白及受体。为进一步阐明pb1噬菌体的宿主识别机制奠定基础。方法:提取噬菌体PHW2的DNA进行基因组测序,通过Gene Mark S、NCBI、Uni Prot等在线数据库对噬菌体PHW2的基因组进行注释和同源性比对;采用Prot Param、SMART、SOPMA、SWISS-MODEL、Alpha Fold2等在线网站和软件对注释为噬菌体尾部相关的蛋白进行理化性质、功能结构域、二级结构和三级结构预测,筛选出可能具有受体结合蛋白功能的尾部蛋白。选定尾丝蛋白构建表达全长及不同截短体的质粒,经IPTG诱导表达重组蛋白,免疫ICR小鼠制备多克隆抗体。采用免疫电镜定位尾丝蛋白在噬菌体上的位置。利用重组蛋白竞争吸附实验和多克隆抗体阻断成斑实验验证尾丝蛋白的受体结合蛋白的功能,并明确其影响宿主吸附的氨基酸区段。使用蛋白酶K、高碘酸盐处理宿主菌表面受体,测定噬菌体PHW2对处理后菌株的成斑率,初步判断噬菌体识别的受体性质。进一步提取细菌表面的外膜蛋白和脂多糖,进行阻断吸附实验验证噬菌体PHW2的受体性质。用PHW2反复感染宿主菌PA001筛选出噬菌体耐受菌株。测定噬菌体对耐受菌的吸附率,选择低吸附率的菌株提取细菌DNA进行全基因组测序,将耐受菌株与野生菌株进行SNP分析和KEGG分析,发现可能的潜在受体。结果:噬菌体PHW2基因组为ds DNA,全长为65,984 bp,GC含量为55.69%,属于有尾噬菌体纲（Caudoviricetes）、pbunavirus属pb1样噬菌体,编码92个开放阅读框。通过基因注释和结构预测发现可能参与宿主识别的尾部蛋白为gp42、gp44、gp50、gp51。其中gp42可能为短尾丝蛋白,gp44被预测可能含有解聚酶活性的尾部蛋白;gp50为可能具有受体结合蛋白功能的尾丝蛋白;gp51为尾丝伴侣蛋白。成功表达尾丝蛋白gp50及其截短蛋白gp50（1-451）和gp50（453-964）,其中gp50和gp50（453-964）为包涵体表达,gp50（1-451）为上清表达。免疫电镜定位可发现,gp50蛋白定位在噬菌体的尾丝,其多克隆抗体可以阻断噬菌体的成斑,具有受体结合蛋白的功能。细胞结合实验发现截短蛋白gp50（1-451）不能与细胞结合,且不能影响噬菌体的吸附,提示gp50 N端不是与受体结合的关键区域。gp50（453-964）的多克隆抗体可封闭噬菌体,阻断噬菌体的感染,与全长蛋白的阻断效果相当,表明gp50 C端是其与受体结合的区域。使用蛋白酶K和高碘酸盐破坏细菌表面蛋白及多糖,测定噬菌体成斑率,发现高碘酸盐处理组噬菌体的成斑率显著降低,表明多糖可影响PHW2的吸附。进一步提取细菌表面的脂多糖和外膜蛋白进行阻断吸附实验验,结果显示只有脂多糖可以显著影响噬菌体的吸附,表明脂多糖为噬菌体PHW2的主要受体。将噬菌体耐受菌的基因组进行测序,通过SNP分析发现突变基因与铜绿假单胞菌的Ⅳ型菌毛的合成有关,提示Ⅳ型菌毛可能为噬菌体PHW2的潜在受体。结论:铜绿假单胞菌噬菌体PHW2属于pb1样噬菌体;尾丝蛋白gp50为受体结合蛋白,其中C端是与受体结合的关键氨基酸区域;铜绿假单胞菌表面的脂多糖是PHW2识别的主要受体,Ⅳ型菌毛为潜在受体。

关键词：铜绿假单胞菌 pb1样噬菌体受体结合蛋白受体

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pb1样铜绿假单胞菌噬菌体PHW2的生物学特性

引用

微生物学通报 2021年第9期48卷 3205-3217页

作者：吴芷莹金泽源李万霞曾飞朱明卓陈少贤彭文仪徐艳萍童贻刚柏琴琴南华大学衡阳医学院公共卫生学院卫生检验与检疫系湖南衡阳421001 北京化工大学生命科学与技术学院北京100029 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

【背景】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种引起医院感染、急性感染和慢性感染的常见条件致病菌。多重耐药铜绿假单胞菌仍然是引起严重医院感染的常见病菌,其临床治疗面临严峻挑战。噬菌体具有特异性杀菌的能力,在防治铜绿假... 详细信息

【背景】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种引起医院感染、急性感染和慢性感染的常见条件致病菌。多重耐药铜绿假单胞菌仍然是引起严重医院感染的常见病菌,其临床治疗面临严峻挑战。噬菌体具有特异性杀菌的能力,在防治铜绿假单胞菌耐药菌方面具有应用前景。【目的】分离能裂解碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌的噬菌体,分析其生物学特性和基因组特征,为噬菌体治疗储备资源。【方法】采集环境水样,用双层琼脂平板法分离噬菌体,对其形态、一步生长曲线、感染复数等生物学特性进行研究;使用IlluminaMiSeq平台测定噬菌体的全基因组序列,利用Newbler3.0、GeneMarkS、BLASTp、Mauve2.4.0等生物信息软件进行拼接、注释和比较基因组学分析。【结果】分离到一株噬菌体PHW2,该噬菌体属肌尾病毒科成员,可裂解7株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌;其最佳感染复数为0.1。一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌PA001的潜伏期为100 min,裂解期为360 min,裂解量为25 PFU/cell;噬菌体PHW2在温度25-50℃和pH 6.0-8.0范围内稳定;紫外照射7 min后PHW2活性明显下降;5%氯仿处理100 min内,PHW2仍保持较高的活性。噬菌体PHW2的基因组长65984 bp,GC含量为55.69%,编码92个ORFs,不含tRNA。基因组比对结果显示PHW2与pb1样噬菌体高度相似。体外生物被膜抑制试验和清除试验结果显示,噬菌体PHW2能显著抑制宿主菌PA001形成的生物被膜并破坏24 h内形成的生物被膜。【结论】分离鉴定了一株新的pb1样噬菌体PHW2,对碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌裂解能力强。生物学特性、基因组特征、体外生物被膜抑制试验和清除试验结果表明该噬菌体具有治疗铜绿假单胞菌耐药菌的潜力。

关键词：铜绿假单胞菌 pb1样噬菌体生物学特性全基因组分析

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