检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：张红梅复旦大学

学位级别：博士

结核病是一种主要的呼吸系统传染病。早期诊断以及规范的多药物联合的化学治疗是主要的控制策略。改良的诊断试剂对于检测结核分支杆菌感染是必须的，研究新的血清学诊断方法是对现有诊断方法的一个有力补充。最近已经证明由结核分... 详细信息

结核病是一种主要的呼吸系统传染病。早期诊断以及规范的多药物联合的化学治疗是主要的控制策略。改良的诊断试剂对于检测结核分支杆菌感染是必须的，研究新的血清学诊断方法是对现有诊断方法的一个有力补充。最近已经证明由结核分支杆菌RD1(一个9.5-Kb的DNA片段)区基因编码的蛋白在细菌毒力、疫苗发展和诊断试剂设计等方面具有重要作用。比较基因组学和生物信息学表明除了RD1，还有11个基因组区域在***中保守存在，而在BCG疫苗株中是缺失的。这些缺失区包括了*** H37Rv 108个ORFs，在目前世界不同地区用作抗结核疫苗的所有13个BCG疫苗亚株中都是缺失的。最近已经有不少研究证明，RD1区和其他的RD区编码的蛋白具有发展成为疫苗和诊断试剂的潜力。***基因组中大约有10％的ORFs编码了pe和ppe家族蛋白，它们是富含甘氨酸且***特有的蛋白，由于pe/ppe家族蛋白在序列和可能结构上的独特性，推测它们有可能具有比较重要的免疫学意义，这方面的研究目前还不是太多。不过，现在已经有了一些关于在临床方面定性定量研究pe/ppe蛋白的免疫反应的报道。本项研究的目的是为了确认新的结核病血清学诊断抗原，我们拟对在***中保守存在，而在BCG中缺失的pe/ppe家族成员-Rv3425，Rv3426，Rv3429，Rv2352c，Rv2353c，Rv3621c和Rv3622c的免疫学特性进行评估，并且将它们与人们熟知的两个抗原，ESAT-6和CFP-10相比较。以体外培养的*** H37Rv提取的RNA为模板的RT-PCR实验证明在转录水平上可以表达的基因有Rv3425，Rv3426，Rv3429，Rv2353c，这也预示着它们有可能是在体外指数生长期表达的功能活跃的基因。我们成功地在***中克隆表达纯化了重组蛋白Rv3425，Rv3429，Rv2353c，CFP-10和ESAT-6。并用这些抗原来检测针对结核病人血清以及接种BCG的健康对照者(n=28)血清的抗体反应。结核病人血清包括肺结核病人的血清(n=50)和肺外结核病人的血清(n=32)。我们检测了三个ppe重组蛋白，Rv3425，Rv3429，Rv2353c和两个对照抗原CFP-10，ESAT-6在识别结核病人和健康对照者血清中IgG抗体的反应。五种抗原检测肺结核病人血清IgG反应的敏感性分别为70.0％，22.0％，16.0％，78.0％和36.0％，检测肺外结核病人中的血清IgG反应的敏感性分别为59.4％，18.8％，12.5％，65.6％和34.4％，与接种过BCG疫苗的健康对照者相比较，五种抗原检测结核病人的特异性分别为100％，96.4％，96.4％，96.4％和100％。可以看出，虽然五种抗原的特异性均比较高，可是在检测结核病人的敏感性方面，也只有重组Rv3425蛋白抗原与CFP-10(Rv3874)相当。如果我们将重组蛋白Rv3425，CFP-10 和ESAT-6的血清学检测结果合并在一起考虑，检测肺结核和肺外结核病人的敏感性分别可以上升到82％和68.8％，特异性为96.4％。我们还检测了重组蛋白Rv3425，CFP-10和ESAT-6的IgM抗体反应，检测肺结核和肺外结核病人的敏感性分别为32.0％，74.0％，78.0％和29.0％，64.5％，61.3％，特异性分别为100％，96.4％，96.4％。如果将三个抗原的检测结果合并在一起考虑，检测肺结核和肺外结核病人的敏感性分别可以上升到88％和68.8％，特异性为96.4％。从研究中我们可以发现，重组Rv3425、CFP-10和ESAT-6蛋白针对接种BCG的健康对照者和结核病人的血清学反应具有显著的差异(p＜0.0001)，而且我们还发现重组Rv3425蛋白抗IgG的抗体反应强度基本上同CFP-10等同，并且高于ESAT-6。证明了*** Rv3425具有免疫敏感性和免疫特异性的本质，有希望用于结核病人的血清学诊断，这在以前是没有报道过的。总之，利用现有的血清学诊断测试检测出所有结核病人血清中抗原物质的所有抗体是不可能的，但是合并这些单独的抗原将会增加血清学诊断的作用。

关键词：结核分支杆菌血清学检测诊断抗原缺失区 pe/ppe家族蛋白

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结核分枝杆菌pe26蛋白调节巨噬细胞免疫反应进而促进分枝杆菌胞内定殖

引用

中国预防兽医学报 2023年第5期45卷 502-509页

作者：陈凡若党光辉张嘉俊鹿萍崔宁崔莹莹崔子寅刘思国中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

结核分枝杆菌(MTB)pe/ppe家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究pe/ppe家族中pe26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-pe26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p... 详细信息

结核分枝杆菌(MTB)pe/ppe家族蛋白介导MTB与宿主间的相互作用,调节宿主炎症反应,有助于其的存活和疾病发展。为研究pe/ppe家族中pe26蛋白的作用,本实验利用PCR扩增pe26基因片段,构建重组载体p AIN-pe26,转化耻垢分枝杆菌(Ms)构建重组菌p AIN-pe26/Ms,经western blot鉴定结果显示,p AIN-pe26/Ms正确表达重组pe26蛋白(rpe26)。利用差速离心分离p AIN-pe26/Ms亚细胞组分,经western blot鉴定结果显示,r pe26定位于p AIN-pe26/Ms细胞壁。通过p AIN-pe26/Ms的菌落形态观察和生长曲线测定,结果显示,p AIN-pe26/Ms菌体表面较p AIN/Ms对照组更粗糙,脊不规则且相对较高,褶皱不明显;p AIN-pe26/Ms生长速度较对照组极显著增加(P<0.001)。利用H37Ra感染巨噬细胞,通过q RT-PCR检测pe26转录水平,结果显示,H37Ra感染巨噬细胞后pe26转录水平极显著增加(P<0.001)。利用p AIN-pe26/Ms感染巨噬细胞,分别通过q RT-PCR、ELISA检测细胞因子转录和表达水平,采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、流式细胞术和胞内定殖的方法检测细胞毒性,结果显示,p AIN-pe26/Ms促进宿主细胞炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α)的转录和表达(P<0.05);r pe26促进巨噬细胞死亡,且在感染48 h时促进细胞早期凋亡(P<0.05);r pe26促进p AIN-pe26/Ms在巨噬细胞内的定殖(P<0.01)。上述结果首次表明,定位于细胞壁的r pe26在感染巨噬细胞过程中促进p AIN-pe26/Ms的生长、炎性细胞因子的转录和表达、巨噬细胞凋亡和胞内定殖。本实验为解析pe26参与分枝杆菌的致病机制和MTB调节宿主免疫反应的机制提供一定参考依据。

关键词：结核分枝杆菌巨噬细胞 pe/ppe家族蛋白 pe26

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pe12蛋白介导结核分枝杆菌逃逸宿主先天免疫防御的机制研究

PE12蛋白介导结核分枝杆菌逃逸宿主先天免疫防御的机制研究

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作者：张嘉俊中国农业科学院

学位级别：博士

结核病(Tuberculosis,TB)主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病。2021年全球新发TB患者约1060万人,死亡约130万人。在2019新型冠状病毒大流行之前,TB是单一传染病导致死亡的首要原因... 详细信息

结核病(Tuberculosis,TB)主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病。2021年全球新发TB患者约1060万人,死亡约130万人。在2019新型冠状病毒大流行之前,TB是单一传染病导致死亡的首要原因,超过了艾滋病,而持续恶化的耐多药TB仍是一个严峻的全球公共卫生难题。因此,阐明MTB与宿主的相互作用机制,为抗TB药物与疫苗的研发提供新的靶点与理论基础。巨噬细胞是宿主天然免疫防御抵抗MTB感染的主要免疫细胞,在MTB感染期间,巨噬细胞表达的多种模式识别受体,如TLRs、NLRs等参与MTB的识别与摄取,进而启动各种先天免疫细胞的防御功能。其中,NLRs家族的NLRP3在抵抗MTB感染发挥重要作用。另一方面,MTB能够通过抑制NLRP3炎症小体的活化进而逃逸宿主先天免疫杀伤,但详细的机制目前还不清楚。本研究通过构建MTB pe/ppe家族蛋白的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msg)pe/ppes-Msg,经感染小鼠原代腹腔巨噬细胞筛选,证明pe12-Msg能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的释放。进一步研究显示,pe12蛋白虽然不影响Msg的生长速度,但能够改变Msg的菌落形态;通过大肠杆菌表达和亲和层析纯化,获得高纯度的pe12蛋白,并免疫新西兰大白兔制备抗pe12蛋白的多克隆抗体,以此进行的亚细胞定位结果显示,pe12蛋白定位于MTB的细胞壁和细胞膜上,为MTB的胞外蛋白。使用构建的pAIN-Msg与pe12-Msg和MTB H37Rv、H37RvΔpe12与H37RvΔpe12::pe12分别感染小鼠原代腹腔巨噬细胞。结果显示,pe12蛋白不仅能够抑制巨噬细胞炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的转录与释放,而且抑制巨噬细胞NLRP3的转录与表达,还通过抑制巨噬细胞死亡促进分枝杆菌的胞内定殖。为了研究pe12蛋白与宿主蛋白的互作,应用Pulldown方法,筛选与pe12蛋白互作的宿主蛋白。研究结果显示,pe12蛋白与TLR4存在相互作用关系,使用TLR4抑制剂TAK242处理小鼠原代腹腔巨噬细胞后,pe12蛋白对抑制巨噬细胞IL-1β的转录与释放、巨噬细胞NLRP3的转录与表达和巨噬细胞LDH释放效果均消失,而且对分枝杆菌胞内定殖的促进作用也消失,表明pe12蛋白通过TLR4介导MTB逃逸巨噬细胞的免疫杀伤。应用pAIN-Msg和pe12-Msg尾静脉感染C57BL/6小鼠,经q PCR与ELISA方法检测IL-1β的转录与释放水平。结果显示,pe12蛋白抑制IL-1β在感染小鼠肺脏与脾脏中的m RNA转录水平和血清中的释放水平,促进Msg在小鼠肺脏、肝脏和脾脏中的定殖;病理学和组织病理学结果显示,pe12蛋白促进Msg感染小鼠肺脏、肝脏和脾脏的病理损伤。综上所述,pe12蛋白不仅抑制炎性细胞因子的转录和释放,而且通过TLR4介导MTB逃逸巨噬细胞的杀伤,还促进分枝杆菌在小鼠脏器中的定殖,并引发严重的病理损伤。本研究为解析MTB与宿主的相互作用机制提供基础,也为抗TB药物的研发提供新的药物靶点。

关键词：结核分枝杆菌 pe/ppe家族蛋白 pe12蛋白 TLR4 NLPR3

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