检索结果-内蒙古大学图书馆

江苏农业科学 2014年第11期42卷 26-29页

作者：王雷崔震海张立军沈阳农业大学生物科学技术学院/辽宁省植物基因工程技术研究中心辽宁沈阳110866

以玉米自交系郑58基因组DNA为模板,设计了2对特异性引物,分别PCR扩增玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)启动子及其全长编码序列,利用In-Fusion技术将两者定向克隆到载体p CAMBIA-1391Z上,并对重组子进行测序验证。结果表明,该pepc... 详细信息

以玉米自交系郑58基因组DNA为模板,设计了2对特异性引物,分别PCR扩增玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)启动子及其全长编码序列,利用In-Fusion技术将两者定向克隆到载体p CAMBIA-1391Z上,并对重组子进行测序验证。结果表明,该pepc启动子序列与Gen Bank中的玉米自交系B73的同源性为97.70%,片段长1 200 bp;全长编码序列同源性为97.90%,片段长6 330 bp。通过HindⅢ和EcoRⅠ酶切载体p CAMBIA-1391Z,利用In-Fusion技术将线性载体与之前获得的2个PCR片段连接,测序结果与预期序列一致,表明成功构建了p CAMBIA-1391Z-pepc植物表达载体。对克隆和载体构建中存在的问题进行了讨论,以期为该类型基因的高效克隆及表达载体的构建提供参考、为C4型pepc基因功能研究和C3植物遗传转化提供可用的基因序列。

关键词：玉米 pepc 基因克隆序列分析表达载体构建

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转pepc&PPDK双基因水稻灌浆期的光合生理特性

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江苏农业科学 2013年第1期41卷 58-61页

作者：宋涛张小娟苑中原郑宝刚叶露幻陈国祥吕川根南京师范大学生命科学学院江苏南京210023 江苏省农业科学院粮食作物研究所江苏南京210014

在野外条件下,利用荧光动力学分析和生理生化研究技术,在灌浆期对转pepc&PPDK双基因水稻R2P及其原种R299功能叶的光合特性和抗氧化系统进行比较研究。结果表明:(1)与R299相比,R2P的功能叶叶绿素含量高12.43%,净光合速率高26.86%;(2)... 详细信息

在野外条件下,利用荧光动力学分析和生理生化研究技术,在灌浆期对转pepc&PPDK双基因水稻R2P及其原种R299功能叶的光合特性和抗氧化系统进行比较研究。结果表明:(1)与R299相比,R2P的功能叶叶绿素含量高12.43%,净光合速率高26.86%;(2)R2P的PSⅡ具有更高光化学活性,有活性的反应中心数量多,热耗散的能量比例较少,光能吸收、传递和转化为电能效率较高;(3)R2P具有较强电能转化为活跃化学能能力,全电子链电子传递活性和光合磷酸化活性分别比R299高58.2%和48.1%;(4)暗反应关键酶方面,R2P的Rubisco初始活性较高,具有较高的pepc和PPDK活性,差异显著;(5)与R299相比,R2P抗氧化酶SOD、POD和CAT活性分别高12%、15%、22%,O2.-生成速率和MDA含量分别低9%、22%。研究证明R2P在光反应和暗反应方面优势明显,抗氧化能力较高。

关键词： pepc PPDK 转基因水稻光合生理特性

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In Vivo Phosphorylation: Development of Specific Antibodies to Detect the Phosphorylated pepc Isoform for the C4 Photosynthesis in

In Vivo Phosphorylation: Development of Specific Antibodies ...

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作者： Yoshihisa Ueno Kumiko Yoshizawa-Kumagaye Junji Emura Tomoko Urabe Taku Yoshiya Tsuyoshi Furumoto Katsura Izui

Phosphoenolpyruvate carboxylases (pepcs), mostly known as the enzymes responsible for the initial CO2 fixation during C4 photosynthesis, are regulated by reversible phosphorylation in vascular plants. The phosphorylation site on a pepc molecule is conserved not only among isoforms but also across plant species. An anti-phosphopeptide antibody is a common and powerful tool for detecting phosphorylated target proteins with high specificity. We generated two antibodies, one against a peptide containing a phosphoserine (phosphopeptide) and the other against a peptide containing a phosphoserine mimetic, (S)-2-amino-4-phosphonobutyric acid (phosphonopeptide). The amino acid sequence of the peptide was taken from the site around the phosphorylation site near the N-terminal region of the maize C4-isoform of pepc. The former antibodies detected almost specifically the phosphorylated C4-isoform of pepc, whereas the latter antibodies had a broader specificity for the phosphorylated pepc in various plant species. The following procedures are described herein: (1) preparation of the phosphopeptide and phosphonopeptide; (2) preparation and purification of rabbit antibodies; (3) preparation of cell extracts from leaves for analyses of pepc phosphorylation with antibodies; and (4) characterization of the obtained antibodies. Finally, (5) two cases involving the application of these antibodies are presented. less

关键词： Immunoassay Reversed-phase HPLC Mass Spectrometry Dialysis Affinity Purification Freeze-thaw Method ELISA Affinity Chromatography Protein Extraction Homogenization SDS-PAGE Electrophoresis Western Blot Cross-linking Dot Blot Gel Electrophoresis Zea mays Oryctolagus cuniculus Equus caballus Protein phosphorylation pepc Synthetic peptide Phosphoenolpyruvate carboxylase C4 photosynthesis Phosphopeptide antibody Phosphonopeptide antibody Flaveria bidentis Anti-rabbit

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pepc活性对玉米幼苗叶片光合特性的影响

PEPC活性对玉米幼苗叶片光合特性的影响

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作者：孙姝娆沈阳农业大学

学位级别：硕士

与C3植物相比,玉米等C4植物在高光强、高温和干旱条件下具有更高的光合能力和产量以及更强的适应性。pepc是C4植物光合碳同化途径的第一个关键酶,许多研究者将C4植物的pepc基因转入C3植物,希望改变C3植物的光合途径,从而提高其在高光强... 详细信息

与C3植物相比,玉米等C4植物在高光强、高温和干旱条件下具有更高的光合能力和产量以及更强的适应性。pepc是C4植物光合碳同化途径的第一个关键酶,许多研究者将C4植物的pepc基因转入C3植物,希望改变C3植物的光合途径,从而提高其在高光强、高温和干旱环境下的生产能力,然而这类转化并没有达到预期目的(Fμkayama et al.2006; Weber et al.2010)。那么,pepc活性改变对其他光合相关指标有怎样的影响?光强对pepc活性具有调节作用(郭丽丽2013),而天冬氨酸(L-Asp)是pepc催化活性的变构抑制剂,本试验利用光强和L-Asp处理玉米幼苗,调节pepc活性,研究pepc活性变化对其他C4酶活性及其基因表达、光合速率、反射光谱、荧光动力学参数、叶绿体超微结构的影响,探讨pepc活性在C4光合途径中的作用,为揭示C4光合途径形成机制以及利用转基因技术改造C3作物的光合途径,从而提高C3作物在高光强、高温和干旱环境下的产量潜力提供参考。研究结果如下：1.水培玉米幼苗最适营养液为1/5Hoagland营养液；抑制玉米pepc活性最适L-Asp浓度为270m/L到290mg/L之间。2.随光强升高,玉米幼苗叶片pepc、PPDK、NADP-MDH、NADP-ME活性均升高;L-Asp处理后各光强下生长的玉米幼苗叶片pepc活性下降均在80%以上,而PPDK、 NADP-MDH、NADP-ME活性也均有不同程度下降。3. L-Asp处理后,玉米幼苗叶片pepc基因的表达量随着时间的增加先上调再下调,即3h时上调,6h后下调,且下调幅度逐渐增大。PPDK、NADP-MDH、NADP-ME基因表达量的变化趋势与pepc基因基本一致,但变化幅度不同。4.随光强升高,玉米幼苗叶片Pn、Gs、Tr、PS Ⅱ和SOD的活性先升高后略下降,Ci、光的反射率、活性氧产生速率和丙二醛含量先下降后升高。L-Asp处理后各光强下Pn、Gs、Tr、PS Ⅱ和SOD活性均大幅降低,Ci、光的反射率、活性氧产生速率和丙二醛含量均显著升高。5.随光强升高,玉米叶片解剖结构发生明显变化,叶肉细胞叶绿体基粒更发达,基粒片层排列更紧密。L-Asp处理后,叶绿体形态变化不大,但基粒片层排列变得松散,不再整齐有序,脂质球有增多现象。综上,光强和L-Asp处理可改变pepc活性,光强增加使pepc活性升高,L-Asp处理使pepc活性下降。pepc活性升高,叶肉细胞叶绿体基粒变得更发达,PPDK、NADP-MDH、NADP-ME酶活性、Pn、PS Ⅱ活性、SOD活性也随之增加；pepc活性下降,叶肉细胞叶绿体基粒片层排列松散,PPDK、NADP-MDH、NADP-ME酶活性、Pn、PS Ⅱ活性、SOD活性也随之降低。pepc活性对玉米光合具有重要调节作用。

关键词：玉米 C4 pepc 光强 L-Asp

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C_4光合作用关键酶pepc的反应机制

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安徽农业科学 2006年第23期34卷 6113-6114,6118页

作者：赵艳陈丽梅李昆志昆明理工大学生物工程技术研究中心云南昆明650224

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)在C4和CAM植物的光合作用中起着非常重要的作用。综述了该酶的催化反应机制及其调控方面的研究进展。

关键词：光合作用 pepc 空间结构大肠杆菌玉米天冬氨酸

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玉米C4-pepc基因RNAi植物表达载体的构建

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沈阳农业大学学报 2013年第1期44卷 88-91页

作者：崔震海蔡莹张立军沈阳农业大学生物科学技术学院/辽宁省植物基因工程技术研究中心沈阳110161

玉米C4光合关键酶pepc基因在玉米C4光合作用中起到重要作用,根据已测序的玉米C4-pepc基因序列,设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以pBI121 C4-pepc质粒DNA为模板,PCR扩增得到2个C4-pepc基因片段。再将正向和反向两个片段分别经双... 详细信息

玉米C4光合关键酶pepc基因在玉米C4光合作用中起到重要作用,根据已测序的玉米C4-pepc基因序列,设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以pBI121 C4-pepc质粒DNA为模板,PCR扩增得到2个C4-pepc基因片段。再将正向和反向两个片段分别经双酶切后插入植物表达载体pTA7002的XhoI和SpeI酶切位点之间,从而构建了以玉米C4-pepc基因为靶标的RNAi植物表达载体p7002-Z-F。载体质粒经酶切鉴定正确后通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105中,为后续探讨干扰载体的干涉pepc基因表达效果奠定了基础。

关键词：玉米 pepc RNAi 植物表达载体

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外源因子对高表达转玉米C4型pepc水稻悬浮细胞中pepcase及内源信号分子的影响

外源因子对高表达转玉米C4型pepc水稻悬浮细胞中PEPCase及内源信...

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作者：王满南京农业大学

学位级别：硕士

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, pepc)是C4光合途径中固定CO2的关键酶,对C4作物的高光效有重要作用。高表达转玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因水稻(高表达转玉米C4型pepc水稻)无论在生理性状,光合指标及... 详细信息

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, pepc)是C4光合途径中固定CO2的关键酶,对C4作物的高光效有重要作用。高表达转玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因水稻(高表达转玉米C4型pepc水稻)无论在生理性状,光合指标及产量等性状方面都优于未转基因水稻原种。为了研究C4型pepc在C3植物水稻中的生理机制,本文以高表达转玉米C4型pepc水稻(PC)和原种Kitaake(WT)为材料,建立了悬浮细胞系,通过外施化学试剂诸如用磷脂酶C抑制剂硫酸新霉素(Neomycin sulfate, NS)、磷脂酶D抑制剂正丁醇(1-butanol),钙及钙的鏊合剂乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸Ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid, EGTA),在细胞水平上研究外源因子对细胞内pepc酶活性以及相关信号分子NO、过氧化氢及钙的影响,结果发现： 1、PC和WT悬浮细胞系的建立2,4-D浓度为2mg/L,6-BA浓度为1mg/L,通过3次继代培养(2,4-D浓度2-0.5mg/L,6-BA浓度为2-0.2 mg/L, ABA浓度为1 mg/L),依次减低外源激素的施用,可获得颗粒状且分散的愈伤组织,转移到液体培养基(2,4-D浓度0.5mg/L,6-BA浓度为0.2 mg/L, ABA浓度为1 mg/L),适合的培养温度为28℃,悬浮细胞系继代时新原液的比例为3：1,6周可建立稳定的供试材料的悬浮细胞系。 2、单独外施新霉素或正丁醇处理1h抑制细胞内PA的含量,PC细胞内pepc酶活性及NO、H2O2含量下降,有浓度和时间依赖性,单独外施Mas处理1h促进细胞内PA含量,PC细胞内的酶活性及NO、H2O2含量降低,葡萄糖作用与Mas相似。 3、PC细胞中,联合加入正丁醇和新霉素1h后,pepc酶活性、NO、H2O2含量上升；加入Mas, pepc酶活性、NO、H2O2含量下降；葡萄糖作用效果与Mas相似。同时伴随Ca2+的大量释放。 4、当在PC悬浮细胞中同时加入正丁醇、新霉素和EGTA时,PC内pepc活性、NO和H202含量比对照增加。虽然联合施加三种抑制剂的细胞中钙离子释放量比单独加入外源抑制剂EGTA降低很多,但与未施抑制剂的PC对照相比,细胞内的钙离子仍略有增加,表现PC的pepc活性仍诱导增加,可见PC细胞内的内源钙的浓度与pepc酶活性的调节密切有关,这可能由于本文外施的EGTA的浓度只能抑制部分PC内钙库的迸发。

关键词：转C4pepc基因水稻磷脂酸 pepc NO H2O2 钙

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转玉米C4型pepc基因大豆的分子特征及光合特性的研究

转玉米C4型PEPC基因大豆的分子特征及光合特性的研究

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作者：钟秀娟南京农业大学

学位级别：硕士

大豆是主要油料来源和植物蛋白来源之一,也是重要的工业原料来源。中国是人口大国,近年来每年对大豆的需求日益增加,对进口大豆的依存度日益增高。因此,提高大豆的产量对我国国民经济尤为重要。利用基因工程手段改善植物光合作用从而提... 详细信息

大豆是主要油料来源和植物蛋白来源之一,也是重要的工业原料来源。中国是人口大国,近年来每年对大豆的需求日益增加,对进口大豆的依存度日益增高。因此,提高大豆的产量对我国国民经济尤为重要。利用基因工程手段改善植物光合作用从而提高作物产量已成为当前研究的热点,但目前该方向在大豆中的研究进展比较缓慢。玉米等C4植物光合效率较高,在高温、干旱等条件下具有明显的生长优势。试图将玉米C4型pepc基因转入大豆,以获得稳定遗传且光合效率明显改善的纯合株系,为大豆等C3植物的高光效基因工程育种提供理论基础和重要的材料支撑。本文以玉米C4型pepc基因为目的基因构建的载体pCAMBIA3301-pepc（含Bar基因为筛选标记）,采用农杆菌介导的大豆子叶节法对6个大豆品种进行转化。转化过程中,使用除草剂草丁膦作为筛选剂:在丛生芽诱导阶段筛选浓度为3 mg·L-1,芽伸长阶段为4 mg.L-1,生根阶段不加筛选剂。共进行了 13个批次2542个外植体的转化,最后获得68株组培抗性苗。研究选用Jack紫为试验材料,通过设置除草剂不同浓度梯度进行涂抹实验观察比较得出:除草剂浓度为125 mg.L-1时涂抹大豆主茎倒一叶叶片,3天后阳性植株涂抹部位无明显变化,阴性植株明显变黄甚至枯萎。因此在对68株组培抗性苗及其中阳性植株的后代鉴定时采用了此方法。利用除草剂草丁膦涂抹组培抗性苗叶片初步筛选得到4株抗性植株,再使用Bar蛋白试纸条和目的基因PCR扩增两种方法对此4株抗性植株进行鉴定,最后发现此4株抗性苗均为转基因阳性植株。除草剂草丁膦涂抹、Bar试纸条检测和PCR扩增三种方法结果一致,都可用于鉴定抗除草剂基因（Bar）为筛选标记的转基因植株。68株组培抗性苗最后检测只有4株为阳性,原因可能是组培阶段筛选剂浓度偏低。对PCR呈阳性的植株T0-1、T0-2及T0-1的4株TT1代株系进行了 Southern blot分析,结果发现T0-1及其4个T,代株系均有两个拷贝数的插入;而T0-2的Southern blot没有出现杂交带。之后结合T0-2的30个T,代株系PCR均呈阴性的结果,本文认为T0-2可能为假阳性。提取4个T0-1的T,代阳性株系（T1-1-1、T1-1-2、T1-1-3和T1-1-5）和野生型（Jack紫）植株盛花期主茎倒一叶叶片RNA进行不同株系间的半定量PCR和荧光定量PCR分析发现,目的基因pepc在4个T1代阳性株系中均转录表达,且表达量有差异。最后对此4个株系及对照植株盛花期（R2）的主茎倒三叶的叶片进行净光合速率的测定,发现其净光合速率均有不同程度的提高,T1-1-1、T1-1-2、T1-1-3和T1-1-5较对照分别提高了 10%、6%、4%和23%,其中T1-1-5与对照相比差异极显著。综上所述,本文通过农杆菌介导法将玉米C4型pepc基因转入大豆。Southern blot表明pepc基因已整合到大豆基因组,且转录表达。转玉米C4型pepc基因提高了大豆的光合效率,对产量等性状的影响还需进一步研究。

关键词：农杆菌介导转化法草丁膦 pepc 净光合速率转基因大豆

来源：评论

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籽粒苋C4关键酶基因（NAD-ME、pepc）的克隆及NAD-ME功能预测

籽粒苋C4关键酶基因（NAD-ME、PEPC）的克隆及NAD-ME功能预测

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作者：李平山西大学

学位级别：硕士

与C3植物相比,C4植物在极端条件(强光、高温、干旱等)下具有明显的生长优势、高养分利用率及高生物产量,这是由于其光合速率高、CO2补偿点低,而且几乎没有光呼吸。C4植物这些优点的生物学基础在于其具有C4光合途径。籽粒苋属双子叶C4植... 详细信息

与C3植物相比,C4植物在极端条件(强光、高温、干旱等)下具有明显的生长优势、高养分利用率及高生物产量,这是由于其光合速率高、CO2补偿点低,而且几乎没有光呼吸。C4植物这些优点的生物学基础在于其具有C4光合途径。籽粒苋属双子叶C4植物,克隆其C4关键酶基因,以期为C4基因工程提供候选基因。 NAD／NADP-苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)是C4途径的两个关键酶。NAD／NADP-苹果酸酶催化苹果酸脱羧释放CO2,并产生丙酮酸,丙酮酸再生为PEP,使C4途径得以循环进行。本研究根据已报道的玉米NADP-ME基因序列,设计特异性引物,经RT-PCR扩增获得了籽粒苋NAD-ME基因的cDNA序列。该序列开放可读框长度为1872bp,编码623个氨基酸。通过Blastn和DNAMAN软件比对,发现该基因核苷酸序列与其他植物已报道的NAD／NADP-ME基因有75.1%-80.6%的相似性。另外,对推断氨基酸序列的蛋白保守区、疏水性／亲水性、潜在跨膜片段、信号肽、蛋白固有无序化和蛋白二级结构进行了分析,初步研究了籽粒苋NAD-ME蛋白的理化性质。运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析了籽粒苋NAD-ME基因的密码子的偏好性,并与其他植物的NAD/NADP-ME基因密码子偏好性和大肠杆菌、酵母的基因组的密码子偏好性进行比较。结果表明,所比较的单子叶植物和双子叶植物的NAD/NADP-ME基因与籽粒苋NAD-ME基因都存在类似的密码子使用情况,对同义密码子的使用有明显的偏好性,其密码子多以A或T结尾；籽粒苋NAD-ME基因与大肠杆菌、酵母的基因组密码子偏好性有较大差异。分析结果对选择籽粒苋NAD-ME合适的转基因受体植物以及合适的蛋白质表达系统具有一定的指导意义。 pepc在Mn2+或Mg2+存在的情况下,催化PEP羧化为OAA。本研究采用分段扩增的方法,首次克隆出了籽粒苋pepc的基因组DNA全长。经Blast比对分析,结果显示,与本克隆片段相似的序列绝大多数为植物pepc基因,其中,与***的pepc基因(Z71973.1)相似性高达93%。因此,初步判定实验获得的序列为籽粒苋基因组pepc基因。

关键词：籽粒苋 NAD-ME pepc 基因克隆

来源：评论

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甘蔗Rubisco和pepc基因的克隆及其在不同施氮水平下不同甘蔗品种中的表达

甘蔗Rubisco和PEPC基因的克隆及其在不同施氮水平下不同甘蔗品种...

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作者：吴朝兴广西大学

学位级别：硕士

甘蔗(Saccharrum spp.)是一种重要的C4作物,在我国90%以上食糖年产量来自甘蔗。近年来,中国的甘蔗产业面临着许多新的挑战,过量施肥是其中之一。氮肥施用过量是国内蔗区极为普遍的现象,施氮过量不仅导致氮利用效率下降,增加了生产成本,... 详细信息

甘蔗(Saccharrum spp.)是一种重要的C4作物,在我国90%以上食糖年产量来自甘蔗。近年来,中国的甘蔗产业面临着许多新的挑战,过量施肥是其中之一。氮肥施用过量是国内蔗区极为普遍的现象,施氮过量不仅导致氮利用效率下降,增加了生产成本,加重病虫害,降低甘蔗蔗糖分,还会严重污染环境。光合酶Rubisco和pepc是催化C4植物光合作用的关键酶,是植物叶片可溶性蛋白的主要组成成分,因此氮能够通过影响这两个酶的含量和酶学特性来影响光合作用。虽然关于氮对光合作用影响的研究已有不少,但是氮对不同氮利用效率甘蔗品种光合作用影响的分子水平的研究鲜有报道。光合作用与氮素利用密切相关,研究不同施氮量对不同氮利用效率甘蔗品种光合作用的影响,阐明氮利用效率与光合作用互作的机理对提高氮肥的利用效率有重要意义。本研究采用PCR技术扩增甘蔗品种GT11的光合酶Rubisco和pepc基因的全长CDS序列,并进行克隆、原核表达及纯化。采用荧光定量和Western blotting技术对三个生长于不同施氮水平下的氮利用效率不同的甘蔗品种(GT11、ROC22和GXB9)的光合酶基因表达情况进行检测,同时测定光合作用,所得结果如下：1.成功克隆出GT11的光合酶基因rbcS、rbcL和pepc的全长CDS,并在原核表达宿主Rosetta中进行表达,最终获得了符合单克隆抗体制备条件的融合蛋白SSU和LSU。2.通过对荧光定量和Western blotting结果进行分析发现,氮利用效率高的甘蔗品种GXB9的三个光合酶基因在转录和蛋白质水平上表达量均比较稳定,ROC22次之,而氮利用效率最低的甘蔗品种GT1 1基因表达波动最为剧烈。实验还发现施氮处理主要通过影响rbcS的表达来影响甘蔗的光合作用。3.对叶片中光合酶蛋白的Western blotting检测发现LSU在10月份时部分被降解为略小于全长的肽段,这可能与甘蔗进入成熟期净光合速率降低有关。4.在本研究条件下,施氮处理对甘蔗光合速率有明显的影响,虽然中氮处理和高氮处理的净光合速率相差不大,但都显著高于低氮处理。荧光定量PCR和Western blotting分析结果表明：氮主要通过影响rbcS基因的表达来影响Rubisco全酶含量。

关键词：甘蔗施氮光合作用 Rubisco pepc 实时荧光定量 PCR Western blotting

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