检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：屈东明广西医科大学

学位级别：博士

目的在哮喘病理生理过程中,气道平滑肌细胞(ASMC)的表型转换是引起气道重塑的重要机制。我们前期研究发现HMGB1参与支气管哮喘气道重塑过程,在小鼠哮喘动物模型上,拮抗HMGB1活性后降低了小鼠气道ASM厚度,但其机制仍未完全了解。本研究... 详细信息

目的在哮喘病理生理过程中,气道平滑肌细胞(ASMC)的表型转换是引起气道重塑的重要机制。我们前期研究发现HMGB1参与支气管哮喘气道重塑过程,在小鼠哮喘动物模型上,拮抗HMGB1活性后降低了小鼠气道ASM厚度,但其机制仍未完全了解。本研究初步探讨HMGB1对大鼠气道平滑肌细胞表型转换的影响及相关机制。方法采用原代培养技术培养SD大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)。ASMC用含10%FBS的DMEM培养24小时,换用无血清的DMEM继续培养24小时,使细胞生长同步。1ASMC分为4组:1对照组:仅用2%血清DMEM处理ASMC;2HMGB1 100ng/ml组:用HMGB1 100ng/ml2%血清DMEM处理ASMC;3HMGB1 500ng/ml组:用HMGB1 500ng/ml2%血清DMEM处理ASMC;4HMGB1 1000ng/ml组:用HMGB11000ng/ml 2%血清DMEM处理ASMC。各组种在六孔板培养24h后。干预结束,用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞用于检测后续各项指标。2采用划痕实验、transwell检测HMGB1对ASMC的迁移能力的影响。免疫荧光观察不同浓度HMGB1对ASMC骨架重排的影响。流式细胞术检测不同浓度HMGB1 ASMC的细胞周期分布影响。Western blot(WB)检测不同浓度HMGB1 ASM细胞PCNA、α-smooth muscle actin(α-actin)和SM-22α蛋白表达的影响。3分组:对照组,HMGB11000ng/ml组,HMGB1+抗RAGE组,HMGB1+抗TLR2组、HMGB1+抗TLR4组,收集各组标本后分别WB检测ASMCα-actin和SM-22α表达;免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。(4)分组:对照组,HMGB11000ng/ml组,HMGB1+LY29400组和LY29400组,收集各组标本后WB检测ASMC的α-actin和SM-22α的表达。免疫荧光观察各组ASMC骨架重排变化。(5)分组:对照组,HMGB1 1000ng/ml组,HMGB1+抗RAGE组和HMGB1+LY29400组,WB检测各组ASMC AkT磷酸化水平。结果1、HMGB1能增强划痕实验、transwell中ASMC的迁移能力,随着HMGB1浓度升高,对ASMC的迁移能力的影响也越强。在荧光显徽镜下观察到:HMGB1可刺激ASMC骨架重排,肌丝增多,细胞多呈板状,呈现出较强张力状态;随着HMGB1浓度升高,作用越强。应用LY294002、抗RAGE受体后,可减弱HMBG1的作用,使肌丝减少。2、流式细胞术结果显示:HMGB1 500ng/ml组、HMGB1 1000ng/ml组的ASMC跃出Gl期,进入G2期、S期的细胞比例明显增加,与对照组、HMGB1 100ng/ml组相比较,G2期、S期的细胞比例的差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组与HMGB1 100ng/ml组相比较,G2期、S期的细胞比例的差异无统计学意义(P>0.05)。3、HMGB1诱导ASMC的PCNA蛋白表达显著增加(P<0.05),且随着浓度的增加蛋白表达增加明显。4、HMGB1诱导ASMC SMA-22α和α-SMA蛋白表达显著减少(P<0.05),且随着浓度的增加蛋白表达减少更明显。5、与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+抗RAGE组ASMC的α-actin和SM-22α表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);与HMGB11000ng/ml组比较,HMGB1+抗TLR2组和HMGB1+抗TLR4组ASMC的α-actin和SM-22α表达无统计学差异(P>0.05)。6、与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1 1000ng/ml+LY294002组的ASMC的α-actin和SM-22α表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);7、与对照组比较,HMGB11000ng/ml组的AkT磷酸化水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与HMGB1 1000ng/ml组比较,HMGB1+LY294002组和HMGB1+抗RAGE组ASMC的AkT磷酸化水平降低(P<0.05)。结论HMGB1显著增加ASMC的增殖、迁移能力,促使ASMC骨架重排,调节ASMC表型标志物的表达,从而HMGB1诱导了ASMC表型转换。HMGB1可能通过RAGE、pi3k信号通路诱导ASMC表型转换。以上研究内容有助于对ASM重塑的新机制尤其气道平滑肌表型转换提供新的见解,并有助于为哮喘的气道重塑提供新的治疗靶点。第一部分:SD大鼠气道平滑肌细胞原代培养和鉴定目的建立SD大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)原代培养方法并鉴定,为相关研究提供试验材料。方法6-8周龄雄性健

关键词： HMGB1 气道平滑肌细胞表型转换受体 SD大鼠气道平滑肌细胞原代培养免疫荧光鉴定 HMGB1 气道平滑肌细胞增殖迁移 HMGB1 表型转换 RAGE pi3k信号通路

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中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究

中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究

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作者：关雪娃吉林大学

学位级别：博士

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是以持续气流受限为特征的进行性炎症加重疾病,目前居疾病死亡原因第三位。COPD的急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)是导致COPD患者死亡的主要原因,具体临床症状表现为脓样痰液增加、呼吸困难、咳嗽及喘息等。呼吸道感染能够引起AECOPD的发生,主要包括病毒和细菌感染,其中细菌感染占AECOPD发病原因的50%左右。从AECOPD患者下呼吸道分离出的细菌包括不可分型流感嗜血杆菌(nontypeable haemophilus infuenza,NTHi)、卡他莫拉菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌等,其中NTHi是COPD患者痰液中最常见的细菌。因此,明确NTHi诱导AECOPD的发生机制有助于深入了解疾病进程并进行有效干预。中性粒细胞是机体抵抗外源性感染的重要防线,在趋化因子的募集作用下能够迅速迁移至感染部位发挥吞噬作用。但过量的中性粒细胞聚集会导致中性粒细胞弹性蛋白酶、金属蛋白酶以及氧化活性物质的过度分泌,进而引起局部组织损伤。中性粒细胞伪足的形成及细胞骨架肌动蛋白的重塑对细胞迁移发挥重要作用,这一过程受磷脂酰肌醇(PtdIns)3-激酶(phosphatidylinositol(PtdIns)3–kinases,pi3k)信号通路的主要调节。化学趋化剂(如N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸,fMLP)刺激后,中性粒细胞表面G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)被激活,Gβγ亚基解离并激活pi3k,磷酸化下游效应因子蛋白激酶B(protein kinase B,AkT),促进F-肌动蛋白(F-actin)极化聚集在细胞边缘伪足区域,进而参与中性粒细胞的迁移。中性粒细胞被认为是COPD患者气道中最常见的炎症细胞之一,气道中性粒细胞的增多与NTHi感染密切相关。临床上将外周血中性粒细胞绝对值>7.5×10～9/L定义为中性粒细胞增多症。NTHi通过感染内皮细胞,产生一系列的炎症因子和趋化因子(如(interleukin,IL)-1β、IL-8等),募集大量中性粒细胞迁移至气道,而气道中性粒细胞的过度迁移则会导致患者肺功能下降与气道功能障碍。因此,深入探讨中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD发生中的作用,抑制中性粒细胞迁移从而降低气道炎症是预防治疗AECOPD疾病的关键性科学问题。目前,AECOPD的临床治疗包括吸入性支气管扩张剂、皮质类固醇及抗生素等,但受机体不良反应及耐药性的限制,并不能有效控制疾病的发展,因此,迫切需要安全有效的新型AECOPD治疗药物。有研究显示,人参等植物源药物具有抗炎作用,且无明显副作用,其主要活性成分为人参皂苷。目前从人参中已鉴定出100余种单体,其中人参皂苷Rg3单体具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤和抗疲劳等。近来研究发现人参皂苷Rg3具有治疗呼吸道疾病的作用,如:人参皂苷Rg3可以通过调节癌细胞岩藻糖基化以及p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPk)和核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路,抑制上皮-间质转化和肺癌的侵袭;人参皂苷Rg3能够抑制NF-κB的活性并减少相应炎症细胞因子的分泌;人参皂苷Rg3通过调节pi3k/AkT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路可减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱发的急性肺损伤。综上,本文的研究目的是基于NTHi诱导的AECOPD模型,探讨中性粒细胞在AECOPD发生中的作用,明确人参皂苷Rg3能否通过抑制中性粒细胞的迁移进而调节气道炎症,从而对AECOPD起到治疗作用,并基于超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)的代谢组学方法初步探讨人参皂苷Rg3对AECOPD小鼠内源性代谢物和相关代谢途径的作用机制。一、NTHi诱导小鼠AECOPD的发生方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为4组(n=16),正常对照(Normal Control,NC)组,不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)感染组,香烟烟雾(Cigarette Smoke,CS)组和联合作用(NTHi+CS)组。其中CS和NTHi+CS组应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,NC和NTHi组暴露于正常空气。于第14周末,NTHi和NTHi+CS组小鼠滴鼻接种NTHi,NC和CS组滴入等量生理盐水。24 h后将各组小鼠麻醉固定。肺功能仪检测小鼠肺功能损伤情况,苏木精-伊红(hematoxylin-e

关键词：慢性阻塞性肺疾病急性加重不可分型流感嗜血杆菌中性粒细胞 pi3k信号通路人参皂苷Rg3

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小分子化合物As2S2对白血病干细胞的杀伤效应及其作用机制的初步研究

小分子化合物As2S2对白血病干细胞的杀伤效应及其作用机制的初步...

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作者：洪振亚华中科技大学

学位级别：博士

第一部分小分子化合物As2S2对白血病细胞的杀伤效应及其作用机制的研究目的观察As2S2对白血病细胞的杀伤效应，揭示其杀伤机制，探索联用pi3k抑制剂pi-103时二者对白血病细胞的治疗获益。方法以不同浓度的As2S2作用白血病细胞不同时间... 详细信息

第一部分小分子化合物As2S2对白血病细胞的杀伤效应及其作用机制的研究目的观察As2S2对白血病细胞的杀伤效应，揭示其杀伤机制，探索联用pi3k抑制剂pi-103时二者对白血病细胞的治疗获益。方法以不同浓度的As2S2作用白血病细胞不同时间后，应用MTT试验检测As2S2对白血病细胞的增殖抑制；流式细胞术及MGG染色检测As2S2及pi-103单用或联用时对白血病细胞、脐血单个核细胞及白血病患者骨髓单个核细胞的分化及凋亡诱导作用；克隆形成实验检测As2S2对白血病细胞克隆的清除能力；细胞免疫荧光、Western blot、Real-time PCR及Real-timePCR array检测As2S2对PML和pi3k信号通路中多个信号分子的蛋白及转录水平的调控。结果As2S2以时间、剂量依赖性方式抑制白血病细胞增殖、诱导其凋亡，抑制白血病细胞的克隆形成能力。As2S2作用后，PML蛋白的表达被显著下调，但转录水平无明显变化。pi3k信号通路中关键蛋白磷酸化水平短时间内被激活，随着作用时间的延长则转为下调，该通路基因变化的总体趋势是被下调。As2S2和pi-103联用对白血病细胞的凋亡诱导起到了协同增强的效应，但对正常的单个核细胞无明显的毒副作用。结论As2S2可能通过降调PML蛋白表达、长时间作用后抑制pi3k信号通路对白血病细胞显示出的时间、剂量依赖性杀伤效应，pi-103可协同增强上述效应，但对正常的单个核细胞无明显的毒副作用，具有较高的治疗指数。第二部分小分子化合物As2S2对白血病干细胞的杀伤效应及其作用机制的初步研究目的检测小分子化合物As2S2单用或联用pi-103时对白血病干细胞的杀伤效应，初步研究其作用机制。方法应用流式细胞术分选白血病干细胞；经As2S2及pi-103单独或联合处理后，流式细胞术检测各组白血病干细胞的凋亡和分化；克隆形成实验检测药物干预后白血病干细胞及正常造血干细胞克隆形成能力的变化；多色流式细胞仪检测As2S2作用后白血病干细胞内p-AkT473表达的动态变化。结果流式细胞术分选的CD34+CD38-细胞占患者骨髓细胞总数的75．4％，分选纯度为96．4％。anti-ki67-Hoechst染色分析表明G0期细胞占83．9％，G1细胞期占7．93％。500 nmol／L的As2S2和1μmol／L pi-103分别单独作用时，细胞凋亡诱导效应并不明显，而两者联用时，凋亡率则从17．26％跃升至31．02％。As2S2和pi-103均有一定程度的白血病细胞克隆清除能力，二者联用时对白血病细胞克隆的清除能力显著增强。在有效清除白血病克隆的药物浓度范围内，二者对正常造血干细胞的克隆形成能力无明显影响。流式细胞术检测显示，As2S2处理组细胞CD11b表达升高，pi-103处理组CD11b表达无明显变化，As2S2与pi-103联用组较As2S2处理组CD11b表达升高更明显。6例白血病标本中，CD34+CD38-Lin-的细胞群体内p-AkT473的表达在As2S2作用细胞1 b时上调，在24h时下调。结论As2S2能有效诱导白血病干细胞的凋亡，促进其分化，抑制其自我更新及增殖能力，pi-103可协同增强上述效应。

关键词： As2S2 PML pi3k信号通路白血病选择性杀伤 As2S2 PML pi3k信号通路白血病干细胞选择性杀伤

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奶牛围产期脂肪因子变化对胰岛素信号通路的影响

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黑龙江畜牧兽医 2022年第2期 32-37页

作者：宁茂曹杰中国农业大学动物医学院北京100193

奶牛围产期出现能量负平衡,动员体脂供能并释放游离性脂肪酸(free fat acid, FFA)是酮病的始发因素,且由于泌乳期外周胰岛素抵抗和产后胰岛素水平降低,胰岛素作为抑制FFA释放的关键激素并不能很好地发挥其生理作用。文章旨在阐述奶牛围... 详细信息

奶牛围产期出现能量负平衡,动员体脂供能并释放游离性脂肪酸(free fat acid, FFA)是酮病的始发因素,且由于泌乳期外周胰岛素抵抗和产后胰岛素水平降低,胰岛素作为抑制FFA释放的关键激素并不能很好地发挥其生理作用。文章旨在阐述奶牛围产期与脂代谢和糖代谢相关的主要胰岛素信号通路,包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, pi3k)通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPk)通路等,以及脂肪因子通过这些通路对胰岛素敏感性的影响,为进一步研究酮病的发病机制及防控靶点提供理论基础。

关键词：胰岛素 pi3k信号通路 MAPk信号通路瘦素脂联素 IL-6 TNF-α IL-1β

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乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制

乳源MFG-E8对老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的分子机制

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作者：李贺哈尔滨工业大学

学位级别：博士

少肌症是由增龄而引起的骨骼肌蛋白代谢失衡,造成肌肉功能障碍,行动能力下降。药物、抗阻力运动以及营养干预是预防和治疗少肌症的有效方式。乳脂肪球膜蛋白具有预防和治疗少肌症的作用,但其成分复杂,作用机制尚不明确。本文从乳脂肪球... 详细信息

少肌症是由增龄而引起的骨骼肌蛋白代谢失衡,造成肌肉功能障碍,行动能力下降。药物、抗阻力运动以及营养干预是预防和治疗少肌症的有效方式。乳脂肪球膜蛋白具有预防和治疗少肌症的作用,但其成分复杂,作用机制尚不明确。本文从乳脂肪球膜蛋白中分离纯化出一种能够促进C2C12细胞增殖和分化的高丰度蛋白—乳脂肪球表皮生长因子-8（MFG-E8）,系统地研究了MFG-E8的结构、性质、生物学特性,MFG-E8促C2C12细胞增殖、分化、骨骼肌再生的作用机制,并通过大鼠体内实验进一步并阐明了MFG-E8促进老年少肌症大鼠骨骼肌修复和再生的作用机制。采用DEAE-52纤维素阴离子交换色谱技术,从乳脂肪球膜蛋白中筛选、分离及纯化出一种具有促进C2C12细胞增殖活性的蛋白组分—MFG-E8,其纯度为98.33%。采用LC-MS/MS、傅里叶红外光谱（FT-IR）、圆二色谱（CD）及生物信息学方法,对MFG-E8的结构和性质进行了分析;MFG-E8由431个氨基酸组成,分子量为47.82 k Da,二级结构以β结构为主（～70%以上）,α-螺旋（～5%）和无规则卷曲（～25%）所占比例较低,其三级结构为不规则球状蛋白;MFG-E8是一种具有疏水腔的亲水性球蛋白,分子内有两个跨膜区域、3个磷酸化位点及2个N-端糖基化位点;根据蛋白质-蛋白质之间相互作用和kEGG Pathway分析,MFG-E8能够参与调节血管生成、凋亡细胞清除、细胞粘附、蛋白质代谢等生物学过程,这些过程主要与ILk/Akt、αvβ6-ERk以及αvβ6/PkC等信号通路有关。MFG-E8促进C2C12细胞增殖作用与其浓度和作用时间具有显著相关性,200μg/m L MFG-E8对C2C12细胞作用48 h,细胞增殖率最大（35.8%）;MFG-E8能够降低G0/G1期和S期细胞数量,增加G2/M期细胞数量,促进C2C12细胞增殖;MFG-E8使C2C12细胞内线粒体数量增加,为细胞增殖提供能量;MFG-E8上调Myo D、Myo G以及My HC的表达,促进C2C12细胞融合成多核肌管。基于对C2C12细胞差异蛋白组分析,MFG-E8可使细胞内8种蛋白质（60S核糖体蛋白L29、NADH脱氢酶、胰岛素降解酶、Hsp40同型蛋白、组蛋白H3、丝/苏氨酸蛋白磷酸酶PGAM5、细胞周期蛋白以及丝/苏氨酸蛋白磷酸酶2A）高表达,这些蛋白质能够介导磷酸脂酰基醇3激酶（pi3k）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPk）、氧化磷酸化以及腺苷酸激活蛋白激酶（AMPk）四种信号通路调控细胞增殖和凋亡过程。q RT-PCR和western blot试验从分子水平证明了MFG-E8促进细胞增殖主要通过介导pi3k和ERk信号通路。MFG-E8能够激活pi3k信号通路,上调Akt的磷酸化表达量,使C2C12细胞内线粒体数量增加,进而修复损伤C2C12细胞。基于western blot和q RT-PCR试验证明了MFG-E8能够激活pi3k/Akt信号通路,促进雷帕霉素靶蛋白（m TOR）的ser2448位点磷酸化,上调下游P70S6k磷酸化表达量,最终促进C2C12细胞增殖。此外,活化的Akt能够上调成肌分化因子（Myo D）、肌细胞生成素（Myo G）以及肌球蛋白重链（My HC）的表达,使C2C12细胞分化融合形成多核肌管。MFG-E8和乳清浓缩蛋白（WPC）能够降低老年少肌症模型大鼠血清中丙二醛（MDA）、脂褐素、甘油三酯（TG）、非酯化脂肪酸（NEFA）和酮体含量降低,超氧化物歧化酶（SOD）活性和胰岛素生长因子-1（IGF-1）含量提高;腓肠肌纤维横截面积增加、细胞核数量增多、细胞间水肿和腊样变性现象消失,对大鼠腓肠肌具有修复和再生作用。基于q RT-PCR和western blot试验,从分子水平证明了MFG-E8和WPC均能够激活pi3k/Akt信号通路,调节腓肠肌蛋白质代谢过程;MFG-E8通过pi3k/Akt/m TOR/P70S6k信号通路,促进腓肠肌蛋白合成代谢;WPC通过pi3k/Akt/m TOR/4E-BP信号通路,抑制腓肠肌蛋白分解代谢;WPC和MFG-E8协同作用能够增强MFG-E8抑制腓肠肌蛋白分解代谢过程。

关键词：少肌症骨骼肌再生 C2C12成肌细胞 MFG-E8 pi3k信号通路

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人类SGkL基因和九个低分子量GTP酶基因的克隆及其功能初步研究

人类SGKL基因和九个低分子量GTP酶基因的克隆及其功能初步研究

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作者：戴方彦复旦大学

学位级别：博士

由于生物基因组进化中的保守性,具有某一功能的基因在不同物种之间常具有一定的同源性.这种同源性对于新基因的功能研究具有提示式的指导作用.而利用这种基因间的同源性,有目的的克隆基因家族新成员,已经成为一种新基因克隆的有效策略.... 详细信息

由于生物基因组进化中的保守性,具有某一功能的基因在不同物种之间常具有一定的同源性.这种同源性对于新基因的功能研究具有提示式的指导作用.而利用这种基因间的同源性,有目的的克隆基因家族新成员,已经成为一种新基因克隆的有效策略.该论文分为两部分,第一部分是利用酵母双杂交技术对一个已获克隆的人丝氨酸/苏氨酸激酶进行功能上的探讨,鉴定了人糖原合成激酶3 Beta是该激酶的一个下游靶蛋白;第二部分是以若干已知具有重要功能和相似结构的基因信息探针,分离和鉴定了Ras超家族中的9个新成员,并初步研究了它们在人肝癌细胞中的表达变化情况.

关键词： SGkL GSk-3β 酵母双杂交 pi3k信号通路克隆表达肝癌

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加味黄连温胆汤调控pi3k通路改善代谢综合征大鼠胰岛素抵抗的研究

加味黄连温胆汤调控PI3K通路改善代谢综合征大鼠胰岛素抵抗的研究

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作者：邓晓威黑龙江中医药大学

学位级别：博士

目的：通过研究加味黄连温胆汤对代谢综合征大鼠各异常组分、脂肪细胞因子及骨骼肌P13k信号通路的干预作用,探讨该方药对MS大鼠脂肪细胞因子与该信号通路的影响,以及二者间的相互作用,并且对加味黄连温胆汤干预该信号通路的机制进行研... 详细信息

目的：通过研究加味黄连温胆汤对代谢综合征大鼠各异常组分、脂肪细胞因子及骨骼肌P13k信号通路的干预作用,探讨该方药对MS大鼠脂肪细胞因子与该信号通路的影响,以及二者间的相互作用,并且对加味黄连温胆汤干预该信号通路的机制进行研究。方法：利用高脂高糖高盐饲料喂养8周龄雄性SD大鼠20周,饲喂20周后,一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,30mg/kg)。建立MS模型大鼠后,将MS大鼠随机分为5组,即：模型组、西药组、高、中、低剂量组。西药组给予格华止干预；黄连温胆汤高、中、低剂量组予不同剂量的加味黄连温胆汤灌胃；模型组给予蒸馏水灌胃。各组大鼠灌服相应药物4周。实验期间动态测量各组大鼠基础指标,包括：体重、腹围、收缩压、空腹血糖、血清胰岛素、血脂等,并计算HOMA-IR、Lee's指数同时作为筛选模型的评价标准。药物干预后除检测上述指标外,采用比色法测定FFA,放射免疫法测定TNF-α及LEP,利用HE染色及免疫组化法测定大鼠骨骼肌IRS-1、GLUT-4,同时采用RT-PCR检测大鼠骨骼肌IRS-1mRNA表达情况,Western blot法检测大鼠骨骼肌IRS-1、P13k、GLUT-4蛋白表达。结果： 1.利用高脂高糖高盐饲料饲喂及注射STZ后的大鼠与空白组大鼠相比,大鼠体重、收缩压、空腹血糖、血清胰岛素、TC及TG等指标明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05)。 2.药物干预后,黄连温胆汤高剂量组大鼠体重、收缩压、Lee's指数、内脏脂肪重量、内脏脂肪体重比、FBG、FINS、***及TC均降低,与模型组相比,均具有统计学意义(P<0.05)。 3.药物干预后,黄连温胆汤高剂量组大鼠FFA、TNF-α、LEP水平与模型组相比显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。 4.药物干预后,黄连温胆汤高剂量组大鼠骨骼肌IRS-1mRNA的表达高于模型组大鼠,且差异具有统计学意义(P<0.05)。 5.药物干预后,黄连温胆汤高剂量组大鼠骨骼肌IRS-1、P13k、GLUT-4蛋白表达水平与模型组相比显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。 6.在相关性研究中发现,FFA、LEP、TNF-α三者与IRS-1均有相关性,且三者与IRS-1均成负相关,以IRS-1与LEP呈负相关最为显著(r=-0.641,P<0.01)。结论： 1.加味黄连温胆汤具有降低MS大鼠体重、收缩压、血糖、血清胰岛素作用,同时可以调脂、减轻大鼠胰岛素抵抗,但以高剂量效果显著。 2.加味黄连温胆汤在不同程度上降低MS大鼠脂肪细胞因子如：FFA、LEP、TNF-α水平,从而减轻炎症反应。这可能与加味黄连温胆汤可以降重、降糖、调脂、减轻胰岛素抵抗有关。 3.加味黄连温胆汤可以上调MS大鼠骨骼肌IRS-1mRNA表达,进而激活IRS-1-pi3k-GLUT-4信号转导通路,提高大鼠骨骼肌对葡萄糖的吸收与利用水平,改善胰岛素抵抗。 4.加味黄连温胆汤可能通过降低MS大鼠脂肪细胞因子：FFA、LEP、TNF-α水平来上调MS大鼠骨骼肌IRS-1、P13k及GLUT-4蛋白的表达,从而增强MS大鼠骨骼肌胰岛素信号转导,改善糖代谢及IR,这可能是加味黄连温胆汤防治MS的机制之一。

关键词：代谢综合征加味黄连温胆汤胰岛素抵抗 pi3k信号通路脂肪细胞因子

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甲基莲心碱抗血小板活性及抗血栓作用的研究

甲基莲心碱抗血小板活性及抗血栓作用的研究

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作者：周雅君华中科技大学

学位级别：博士

第一部分：甲基莲心碱对小鼠血小板的作用及抗血栓作用的研究 　　目的:血小板在形成病理性血栓,引发中风,诱发动脉粥样硬化等心脑血管疾病过程中发挥着重要作用。本研究旨在观察甲基莲心碱对小鼠血小板的聚集、黏附... 详细信息

第一部分：甲基莲心碱对小鼠血小板的作用及抗血栓作用的研究 　　目的:血小板在形成病理性血栓,引发中风,诱发动脉粥样硬化等心脑血管疾病过程中发挥着重要作用。本研究旨在观察甲基莲心碱对小鼠血小板的聚集、黏附、解聚及抗血栓作用的影响。 　　方法:本部分实验下腔静脉抽取小鼠血液,分离出PRP或制成洗涤血小板,利用比浊法测定甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP和U46619诱导的血小板聚集的抑制作用,同时也观察甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP和U46619诱导的已聚集血小板的解聚作用;由于血小板颗粒释放的量同荧光强度正相关,由此测定甲基莲心碱对胶原、凝血酶和U46619诱导血小板聚集时释放的作用;利用体外血栓实验观察甲基莲心碱对血小板在体外形成血栓的影响;利用急性肺血栓模型观察甲基莲心碱对小鼠体内血栓形成的抑制作用。 　　结果:①5min内,3μMNef能抑制胶原、凝血酶、U46619和ADP诱导的血小板聚集,并能使胶原、ADP和U46619诱导的已聚集的血小板解聚;1μMNef能完全抑制胶原诱导的血小板聚集,能明显使胶原、ADP和U46619诱导的已聚集的血小板解聚;0.3μMNef均不能完全抑制凝血酶及U46619诱导的血小板聚集,亦不能使胶原、凝血酶、ADP和U46619诱导的已聚集的血小板发生解聚现象。②0.3μMNef、1μMNef、3μMNef能明显抑制胶原、凝血酶和U46619诱导的血小板释放。③在体外血栓实验中,0.3μMNef、3μMNef均能明显减少血小板黏附面积,与阳性药阿司匹林组相比,3μMNef能明显减少血小板黏附面积。④在甲基莲心碱对小鼠急性肺血栓的影响实验中,与模型组相比,3mg/kgNef和6mg/kgNef均能使小鼠的死亡率降低;免疫组化结果显示:与模型组相比,阿司匹林组和6mg/kgNef组的血栓形成明显减少。 　　结论:甲基莲心碱能明显抑制小鼠的血小板聚集和释放,亦可使已聚集的血小板解聚,能明显抑制小鼠血小板体外的黏附和血栓的形成,能明显减少小鼠急性肺血栓模型中的血栓形成。 　　第二部分：甲基莲心碱对正常人血小板的作用研究 　　目的:为了进一步研究甲基莲心碱对血小板的相关作用,本实验采用人血小板进行研究,观察其对人血小板的相关作用,并试图寻找其抗血小板及抗血栓作用的相关作用机制。 　　方法:本部分实验取人上臂肘静脉抽取血液,分离出PRP或制成洗涤血小板,利用比浊法测定甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP、U46619和Adr诱导的血小板聚集的抑制作用;同样利用比浊法观察甲基莲心碱对胶原、凝血酶、ADP、U46619和Adr诱导的已聚集血小板的解聚作用;用固定的胶原蛋白和纤维蛋白原同血小板相作用,同时观察甲基莲心碱对血小板黏附及扩展的影响;利用体外血栓实验观察甲基莲心碱对血小板在体外形成血栓的影响;用流式细胞术观察甲基莲心碱对预先孵育血小板和对已活化血小板的P-选择素的表达、PAC-1的表达和同纤维蛋白原结合的影响;采用WesternBlot实验方法,观察不同时间点胶原诱导血小板聚集时甲基莲心碱对pi3kp85、Akt、pi3kp110、GSk3β、p38MAPk、PkC、PLCγ2、Syk、JNk、ERk、eNOS和VASP蛋白磷酸化的影响。 　　结果:①5min内,3μMNef均能明显抑制胶原、凝血酶、U46619、ADP和Adr诱导的血小板聚集和已聚集的血小板解聚,1μMNef能明显抑制胶原、凝血酶、U46619、ADP和Adr诱导的血小板聚集,并能明显使ADP、凝血酶和Adr诱导的已聚集的血小板解聚,0.3μMNef能明显抑制胶原、U46619、ADP和Adr诱导的血小板聚集,但均不能使ADP、胶原、凝血酶、U46619和Adr诱导的已聚集的血小板发生解聚现象。②在体外黏附实验中,3μMNef、1μMNef使血小板黏附数量、黏附面积均明显减少;在体外扩展实验中,3μMNef使血小板黏附数量和面积均明显减少,1μMNef使血小板黏附数量减少。③体外血栓实验中,3μMNef能明显减少血小板黏附面积。④当甲基莲心碱预处理血小板后,3μMNef能使P-选择素、PAC-1表达降低,并减少纤维蛋白原的结合,0.3μMNef能使PAC-1的表达降低;甲基莲心碱作用于已活化的血小板时,3μMNef和0.3μMNef能使PAC-1的表达降低,但仅3μMNef减少纤维蛋白原的结合,Nef对P-选择素的表达无影响。⑤WesternBlot结果显示,甲基莲心碱抑制胶原诱导的血小板聚集实验中,反应30s时能明显抑制p-AkT、p38MAPk的活性,反应300s时能明显抑制pi3kp85

关键词：甲基莲心碱抗血小板活性急性肺血栓抗血栓机制 pi3k信号通路

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青蒿琥酯对大鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障的保护及机制研究

青蒿琥酯对大鼠蛛网膜下腔出血后血脑屏障的保护及机制研究

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作者：左世伦第三军医大学

学位级别：博士

背景和目的蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)主要发生于相对年轻的人群,其导致的高死残率对社会和家庭造成了巨大的损失。目前认为,SAH的病理生理机制主要涉及脑神经血管网络,该网络包含脑内大血管下游所有的小血管以及与... 详细信息

背景和目的蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage,SAH)主要发生于相对年轻的人群,其导致的高死残率对社会和家庭造成了巨大的损失。目前认为,SAH的病理生理机制主要涉及脑神经血管网络,该网络包含脑内大血管下游所有的小血管以及与这些血管相关的所有细胞。血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)是神经血管网络中最为重要的结构之一,它的损伤与SAH后发生的血管性脑水肿有着极为紧密的联系。因此,保护BBB免受损伤将有助于SAH病人的康复。青蒿琥酯,作为半合成水溶性的青蒿素衍生物,已经成为脑型疟疾和其他各种重型疟疾的标准治疗药物。青蒿琥酯的抗疟作用高效、安全且耐受良好。而且,大量的研究也指出,其具有广泛的药理学活性,例如抗寄生虫、抗肿瘤、抗炎和抗微生物等。我们知道,神经系统疾病的发生涉及多种病因和复杂的病理生理机制。近来的研究也显示单一作用机制和具有严重副作用的药物不可能用于治疗神经系统疾病。因此,具有多种作用效应的青蒿琥酯可能在预防和治疗神经系统疾病方面具有重要的应用潜力。更为重要的是,青蒿琥酯能特异性地在脑组织中保持高浓度。新近研究发现,青蒿琥酯能够缓解小鼠实验性脑型疟疾导致的BBB损伤,而且这种缓解与疟原虫的杀灭无关。另外,FTY720(S1P1的激动剂)联合青蒿琥酯治疗小鼠脑型疟疾可以明显减轻BBB的损伤并提高其存活率。因此,我们有理由相信青蒿琥酯对SAH具有治疗作用。1-磷酸鞘氨醇受体-1(Sphingosine-1-phosphate receptor-1,S1P1)主要表达于血管内皮细胞上。S1P1特异性地与Gi/o家族结合,在维持血流依赖性血管网络方面具有重要的作用。在小鼠体内全部或仅内皮细胞上敲除S1P1基因都会对血管丛产生极为严重的后果。以往的研究指出,激活S1P1可保护多种卒中模型导致的脑损伤,如:增加S1P的表达可以提高S1P1的活性,进而阻止SAH后小鼠早期脑损伤的发展。但是,对S1P1在保护受损脑组织中涉及的下游信号通路并没有完全弄清。研究显示,S1P1既可通过激活pi3k/Akt信号通路抑制凋亡、阻止Fox O3a活化并最终促进PC12细胞的存活;也可使心肌细胞在缺氧条件下存活;还可促进脂肪干细胞分化成为表达内皮型NO合酶的内皮样细胞等。因此,pi3k是s1p1分子一个极为重要的下游效应器。而且,taddei等人发现激活pi3k/akt分子可以灭活gsk-3β并阻止β-catenin的核转位,这样有利于解除其对claudin-5表达的抑制并最终增加claudin-5的表达。类似研究也指出,小鼠脑出血后激活pi3k/akt信号通路可以减少gsk-3β的激活并稳定β-catenin,最终增加紧密连接蛋白claudin-3和claudin-5的表达。众所周知,紧密连接蛋白claudin-3和claudin-5对维护bbb的完整性极为重要。高效地促进claudin-3和claudin-5的表达,可以有效地缓解各种中枢神经系统疾病导致的bbb损伤。基于上述研究成果,我们推测sah后给予青蒿琥酯可以激活s1p1进而保护bbb的完整性。我们利用脑血管内穿法来构建sah大鼠模型,进而研究sah后青蒿琥酯对bbb的保护效应和潜在机制。材料与方法整个课题研究包括在体和离体实验两部分。脑血管内穿法被用于构建大鼠sah模型。1、18分sah分级评分法被用于评价大鼠sah后24和72小时的出血量,以此来判断模型构建成功与否。2、改良garcia神经功能评分被用于检测大鼠sah后24和72小时的神经系统功能。3、脑水肿程度则通过检测大鼠sah后24和72小时的脑水含量来进行评价。4、血脑屏障完整性则通过检测大鼠sah后24小时脑组织的伊文斯蓝渗出量、伊文斯蓝的自发荧光以及透射电镜来进行评估。5、大鼠sah后24小时s1p1表达量则通过免疫组化染色来进行检测。6、westernblot被用于检测大鼠sah后24或72小时,s1p1、sphk1、sphk2、p-akt/akt、p-gsk3β/gsk3β、p-β-catenin/β-catenin、claudin-3和claudin-5蛋白的表达情况。此外,离体实验中,s1p1的表达量也使用westernblot来检测。7、cck-8被用于检测大鼠脑血管内皮细胞在给予青蒿琥酯24小时后的活性。8、在体实验中,sirna的抑制效果则使用rt-pcr来进行评估。9、自发性高血压大鼠血压的测定,则使用mrbp血压测量仪在2%高盐溶液给予后,每周检测一次。10、sah后24或72小时,青蒿琥酯的治疗作用通过神经功能评分、脑水含量、伊文斯蓝渗出量、伊文斯蓝自发荧光和透射电镜进行评价。11、青蒿琥酯对sah后bbb保护涉及的具体分子机制,则通过分别给予不同拮抗剂

关键词：蛛网膜下腔出血血脑屏障青蒿琥酯 pi3k信号通路紧密连接蛋白

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胰岛素及其信号通路在黄斑蓝子鱼LC-PUFA合成调控中的作用及机制研究

胰岛素及其信号通路在黄斑蓝子鱼LC-PUFA合成调控中的作用及机制...

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作者：刘丽杰汕头大学

学位级别：博士

胰岛素（insulin）是一种重要的调节人和动物血糖的肽类激素。其对动物肝脏脂类代谢的调控作用主要是促进脂类的合成代谢（脂肪生成作用）和抑制脂类的分解代谢。胰岛素已被证实可以提高哺乳动物长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）合成关键... 详细信息

胰岛素（insulin）是一种重要的调节人和动物血糖的肽类激素。其对动物肝脏脂类代谢的调控作用主要是促进脂类的合成代谢（脂肪生成作用）和抑制脂类的分解代谢。胰岛素已被证实可以提高哺乳动物长链多不饱和脂肪酸（LC-PUFA）合成关键酶FADS1、FADS2的m RNA表达水平和酶活性,然而在硬骨鱼中鲜有相关报道。黄斑蓝子鱼（Siganus canaliculatus）是一种植食性海水硬骨鱼类,具有将C18 PUFA转化为LC-PUFA的能力,且其整个LC-PUFA合成途径的关键酶基因（包括Δ6Δ5 fads2、Δ4 fads2、elovl5和elovl4）已被克隆,是研究鱼类LC-PUFA合成调控机制的理想模式鱼类。为此,本论文以黄斑蓝子鱼肝细胞系（*** hepatocyte line,SCHL）为材料,借助转录组测序技术,从转录水平和细胞信号通路方向,探究胰岛素在黄斑蓝子鱼LC-PUFA合成调控中的作用及机制。主要的研究内容和取得的结果、结论如下:一、胰岛素可促进黄斑蓝子鱼肝细胞LC-PUFA合成关键酶基因的表达用不同剂量（0、40、80、120、200 nM）胰岛素,无血清条件下处理SCHL细胞不同时间（6 h、12 h）,结果表明,胰岛素可提高Δ6Δ5 fads2和elovl5的m RNA表达水平,且促进效果与处理剂量和时间有关:12 h的促进效果比6 h的更明显;两个基因的m RNA相对表达量均随胰岛素剂量的增加而呈现先升高后降低的变化,借助Origin作图软件添加的趋势线分析,当胰岛素剂量为65 nM（处理时间为12 h）时,对Δ6Δ5 fads2和elovl5的促进效果最显著。用65 nM胰岛素处理SCHL细胞12 h,进行脂肪酸组成测定和分析,结果显示,胰岛素处理组的花生四烯酸（ARA,20:4n-6）占比显著高于对照组,EPA（20:5n-3）和DHA（22:6n-3）有增加的趋势;依赖Δ6Δ5 Fads2催化的18:2n-6到18:3n-6,以及18:3n-3到18:4n-3的转化率显著提高（P<0.05）;依赖Elovl5催化的18:3n-3到20:3n-3和20:5n-3到22:5n-3的转化率有增加的趋势。结果说明,胰岛素可以提高黄斑蓝子鱼肝细胞LC-PUFA合成关键酶的m RNA表达水平和酶活性,进而促进LC-PUFA生成。二、胰岛素处理的黄斑蓝子鱼肝细胞转录组测序结果与分析对65 nM胰岛素处理12 h的SCHL细胞样品进行转录组测序分析,共组装得到了69,116个平均长度为1383 bp的单基因簇（unigenes）,其中63.72%的unigenes得到注释。与未经胰岛素处理的对照组相比,胰岛素处理组有250个unigenes被上调,277个被下调,共有130个差异表达基因（DEGs）富集到了157个kEGG pathways中,其中有10个DEGs富集到了8个脂质代谢相关的信号通路。转录组结果中,胰岛素可显著提高蓝子鱼Δ6 fads2的m RNA表达水平,而elovl5、转录因子srebp1和lxrα、pi3k信号通路重要基因（pik3ca、pdk1、prkci、akt2、mtor）均有上调趋势。基于转录组数据,筛选出了其他可能参与胰岛素调控LC-PUFA合成过程的目的基因,其中,ampkα和calm的m RNA表达量分别有下调和上调的趋势,而creb1、plcb3和hsp90a被胰岛素显著上调。使用与转录组测序同一批次处理的细胞样品进行RT-q PCR实验,获得的结果与RNA-seq结果基本一致,即胰岛素显著提高了黄斑蓝子鱼Δ6 fads2、elovl5、srebp1、lxrα、pdk1、prkci、akt2、mtor、calm、creb1、plcb3等基因的m RNA表达水平,pik3ca和ampkα分别有上调和下调的趋势。这说明转录因子Lxrα和Srebp1,以及pi3k信号通路相关基因很有可能参与胰岛素对LC-PUFA合成的调控。此外,根据转录组数据筛选的其他目的基因,如ampkα、calm、creb1、plcb3、hsp90a等,也可能参与了胰岛素对蓝子鱼LC-PUFA合成的调控。三、胰岛素通过pi3k信号通路参与黄斑蓝子鱼LC-PUFA合成调控的验证首先,从黄斑蓝子鱼中克隆得到pi3k信号通路的三个重要基因pik3ca、akt2和prkci（分别编码蛋白pi3kα、Akt2和Pkcλ）的开放阅读框（ORF）序列,其核苷酸长度和编码的氨基酸数目分别为3207 bp和1068,1449 bp和482,1767bp和588。氨基酸序列比对和相似度比较的结果显示,黄斑蓝子鱼pi3kα、Akt2和Pkcλ的氨基酸序列具有典型且保守的结构域,与其他物种相应基因的氨基酸序

关键词：黄斑蓝子鱼长链多不饱和脂肪酸合成胰岛素 pi3k信号通路调控机制

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