检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物工程杂志 2006年第2期26卷 13-19页

作者：卢忠民赵宝昌大连医科大学生物化学和分子生物学教研室大连116027

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入了GGC序列,使IL-18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了rgd模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichia Pastoris酵... 详细信息

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入了GGC序列,使IL-18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了rgd模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichia Pastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达。用Sephadex G-100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白。研究表明,IL-18在体外对黑色素瘤细胞株B16没有作用,而IL-18-rgd抑制作用明显,IC50=8·10μmol/L;应用小鼠动物模型研究结果显示,IL-18及IL-18-rgd均对黑色素瘤细胞B16有抑制作用,且IL-18-rgd比IL-18的作用强;同时,对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoicmembrane,CAM)血管生成的抑制实验发现,IL-18-rgd对CAM血管生成的抑制作用也比IL-18强。但IL-18-rgd仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力。结果提示,IL-18-rgd在具有抗炎,抗感染作用的同时增添了抑制肿瘤血管新的功能。

关键词： IL-18 rgd模体毕赤酵母 B16细胞

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含rgd模体的人白细胞介素18(IL-18)突变体的酵母表达及其抗血小板聚集活性

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中国生物化学与分子生物学报 2005年第6期21卷 775-780页

作者：卢忠民赵宝昌大连医科大学生物化学和分子生物学教研室大连116027

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了rgd模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS1... 详细信息

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了rgd模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达.用SephadexG100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白.对该蛋白进行了血小板聚集抑制实验和对GPⅡbⅢa与Fn结合的抑制实验.含rgd模体的重组IL18(IL18rgd)显示了较强的体外抑制血小板聚集活性,IC50=8.8μmolL;并具有与GPⅡbⅢa的竞争结合活性,IC50=8.0μmolL.该含有rgd模体的重组IL18仍保存对PBMC诱导产生IFNγ能力.结果表明,此IL18rgd嵌合体在具有抗炎,抗感染的同时增添了新的抑制血小板聚集功能.

关键词： IL-18 rgd模体毕赤酵母血小板聚集人白细胞介素18

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表面展示rgd模体重组噬菌体的构建和鉴定

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扬州大学学报（农业与生命科学版） 2017年第4期38卷 9-13,24页

作者：夏文龙余树培郭长明朱善元张鑫宇夏晓莉孙怀昌扬州大学兽医学院/江苏省重要动物疫病与人兽共患病协同创新中心江苏扬州225009 江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室江苏泰州225300

将rgd多肽编码序列克隆至辅助噬菌体M13KO7 PⅢ基因中,获得重组载体M13KO7-rgd,包装噬菌粒pAAV-GFP后获得重组噬菌体颗粒,通过透射电子显微镜观察形态,Western-blot鉴定PⅢ-rgd融合序列的表达。将其转导不同哺乳动物细胞,荧光显微镜观... 详细信息

将rgd多肽编码序列克隆至辅助噬菌体M13KO7 PⅢ基因中,获得重组载体M13KO7-rgd,包装噬菌粒pAAV-GFP后获得重组噬菌体颗粒,通过透射电子显微镜观察形态,Western-blot鉴定PⅢ-rgd融合序列的表达。将其转导不同哺乳动物细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达。结果表明:成功获得展示rgd模体的重组噬菌体颗粒,且具有典型丝状噬菌体形态特征,转导不同细胞系后有绿色荧光蛋白表达,提示该重组噬菌体能够导入哺乳动物细胞,为动物基因工程疫苗载体的研发提供新的思路。

关键词：重组噬菌体 rgd模体基因导入

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rgd模体在肿瘤诊断与靶向治疗方面的研究现状

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国际病理科学与临床杂志 2012年第4期32卷 312-315页

作者：毕建华崔艳花孙明忠刘淑清大连医科大学七年制2008级辽宁大连116044 大连医科大学生物化学教研室辽宁大连116044 大连医科大学生物技术系辽宁大连116044

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginyl-glycyl-aspartic acid,rgd)模体是一类含有rgd序列的短肽,有环形和线性两类,可以竞争性结合整合素受体,阻止肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡,通过阻断整合素-斑点黏附激酶途径,... 详细信息

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginyl-glycyl-aspartic acid,rgd)模体是一类含有rgd序列的短肽,有环形和线性两类,可以竞争性结合整合素受体,阻止肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡,通过阻断整合素-斑点黏附激酶途径,抑制肿瘤细胞黏附、增殖、侵袭、转移。该类肽与整合素结合成为抗肿瘤药物设计的靶点。随着对其分子机制的深入研究,越来越多的含rgd模体的药物被运用于肿瘤的早期诊断和临床抗肿瘤的治疗。

关键词： rgd模体肿瘤分子影像靶向治疗

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重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-rgd3表达及对Hela细胞活性的影响

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生物工程学报 2009年第5期25卷 686-694页

作者：张丕桥王继红刘欣褚丹李庆伟辽宁师范大学海洋生物功能基因与蛋白质组学研究所大连116029

为研究重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-rgd3的抗肿瘤活性,确定其生物学地位及意义,本研究提取成体七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺组织总RNA,经RT-PCR获得cDNA序列长度为357bp的目的基因片段,将其克隆于pET23b载体,获得带有组氨酸标签的分... 详细信息

为研究重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-rgd3的抗肿瘤活性,确定其生物学地位及意义,本研究提取成体七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺组织总RNA,经RT-PCR获得cDNA序列长度为357bp的目的基因片段,将其克隆于pET23b载体,获得带有组氨酸标签的分子量为15kD的基因重组蛋白rLj-rgd3的高效可溶性表达,通过组氨酸亲和层析纯化蛋白。采用MTT法检测不同浓度rLj-rgd3对bFGF诱导下的Hela细胞增殖的抑制作用,结果表明rLj-rgd3能显著抑制Hela细胞的增殖,IC50为2.6μmol/L。rLj-rgd3作用后的Hela细胞经Hoechst染色及DNAladder检测结果显示,细胞均发生凋亡。rLj-rgd3对Hela细胞黏附玻连蛋白(VN)作用的实验结果为有效抑制。采用Transwell细胞培养板对bFGF诱导下的Hela细胞迁移实验表明,rLj-rgd3能够抑制Hela细胞的迁移,且抑制率达60%。采用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-rgd3对Hela细胞浸润行为实验显示,以bFGF为趋化剂的Hela细胞穿透Matrigel的浸润行为明显受到抑制。以上研究表明,rLj-rgd3具有典型的rgd毒素蛋白的功能,有望应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的生物学意义。

关键词：七鳃鳗 rgd模体整合素基因重组抗肿瘤

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N-端引入rgd序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究

N-端引入RGD序列的葡激酶突变体的构建、表达、纯化及性质研究

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作者：狄静芳河北师范大学

学位级别：硕士

血栓性疾病特别是脑血栓、心肌梗塞、深度静脉血栓等均有较高的致死、致残率,溶栓治疗法是治疗此类疾病的常规疗法。自从二十世纪八十年代以来,已先后开发了多种溶栓制剂,现已被广泛应用于临床,例如:重组组织型纤溶酶原(recombinant tis... 详细信息

血栓性疾病特别是脑血栓、心肌梗塞、深度静脉血栓等均有较高的致死、致残率,溶栓治疗法是治疗此类疾病的常规疗法。自从二十世纪八十年代以来,已先后开发了多种溶栓制剂,现已被广泛应用于临床,例如:重组组织型纤溶酶原(recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA)、尿激酶(UK)、重组链激酶(recombinant streptokinase,r-SK)等,这些溶栓制剂各有优缺点,其中以rt-PA疗效最佳,但因其价格昂贵使用范围受到很大限制。科研工作者正在努力寻找一种既有较好溶栓疗效价格又便宜的新一代溶栓制剂。天然葡激酶(staphylokinase,SAK)是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种蛋白质。临床研究表明,重组葡激酶(r-SAK)具有与rt-PA相当的溶栓活性,且有更高的纤维蛋白专一性,除此之外,它能在大肠杆菌中高效表达,生产成本低,是一种很有应用前景的溶栓制剂。但临床试验表明,使用r-SAK后仍有一定的再梗塞率,而活化后血小板聚集反应是成功溶栓后再栓塞的主要原因,因此在溶栓的同时进行抗凝、抗血小板聚集治疗是一种积极的预防再栓塞的治疗策略。GPIIb/IIIa拮抗剂能与纤维蛋白原竞争性结合血小板表面的GPIIb/IIIa受体,能够抑制血小板聚集通路的最后一步,具有很强的抑制血小板聚集的作用。国内外根据rgd(Arg-Gly-Asp)序列已设计了许多GPIIb/IIIa受体阻断剂,用于抑制血小板聚集。为研制兼具溶栓和防栓功能的新型溶栓剂,降低溶栓后再栓塞的发生率,本试验设计在SAK分子的N-端引入rgd序列,构建四个新型双功能SAK突变体分子,研究其表达和纯化,并分析其生物学活性。本实验采用PCR介导的定点突变的方法,通过设计N-端包含rgd短肽序列的突变引物,以野生型葡激酶(wild type staphylokinase,WT-SAK)质粒为模板,PCR克隆得到SAK突变体基因;将突变后的SAK基因序列与表达载体pBV220质粒连接后,转化大肠杆菌BL21进行表达;应用阳离子交换层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析连续三步层析法纯化表达产物,并对所得纯化产物进行生物学活性鉴定。实验结果显示,SAK突变体蛋白在大肠杆菌BL21中的表达量占菌体蛋白总量的50%以上;三步连续层析纯化后其纯度可达97%以上;测得其纤溶比活性分别为10.8×104HU/mg、10.1×104HU/mg、11.0×104HU/mg、11.2×104HU/mg,不低于WT-SAK的纤溶活性(9.8×104HU/mg);并且具有明显的抗血小板聚集活性,实验测得血小板聚集抑制率分别为10.72%、12.36%、19.71%、21.65%,明显高于WT-SAK(3.98%);ELISA分析结果表明,SAK突变体中大肠杆菌菌体蛋白残留量均小于0.1%,符合《中国药典》2005版中规定的要求。本实验中,突变体基因在大肠杆菌中获得高效表达,得到了高纯度、高活性的SAK突变体蛋白。突变体既保留了野生型葡激酶的纤溶活性,同时又具有了抗血小板聚集功能,为新型双功能SAK的研制奠定了良好的基础。

关键词：葡激酶 rgd模体抗血小板聚集

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去纯化标签的重组七鳃鳗rLj-rgd3（H-）的中试纯化工艺研究

去纯化标签的重组七鳃鳗rLj-RGD3（H-）的中试纯化工艺研究

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作者：孙琳辽宁师范大学

学位级别：硕士

Lj-rgd3是来自于日本七鳃鳗口腔腺的分泌蛋白，由118个氨基酸残基组成，因含有3个rgd(精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)模体而得名。除此之外，Lj-rgd3还含有一对半胱氨酸和17个组氨酸。rLj-rgd3是本课题组前期通过基因克隆手段获得的带有组... 详细信息

Lj-rgd3是来自于日本七鳃鳗口腔腺的分泌蛋白，由118个氨基酸残基组成，因含有3个rgd(精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸)模体而得名。除此之外，Lj-rgd3还含有一对半胱氨酸和17个组氨酸。rLj-rgd3是本课题组前期通过基因克隆手段获得的带有组氨酸（His）纯化标签的Lj-rgd3基因重组蛋白，为一带有质粒上6个His的融合蛋白。大量实验结果表明，rLj-rgd3蛋白具有抗血管新生，抗肿瘤细胞迁移，浸润等功能，有望成为抗血栓及抗肿瘤新药，本课题组正在对其进行抗肿瘤、抗血栓临床前研究。本研究目的：rLj-rgd3(H-)是在rLj-rgd3蛋白基础上去除His纯化标签的基因重组蛋白，其所含序列与Lj-rgd3基因推导序列完全相同。根据《中华人民共和国药典》关于基因重组蛋白药物的要求，所使用的基因重组蛋白中不得含有融合的纯化标签，故本研究的目的就是通过分子克隆手段将rLj-rgd3上的His标签去除掉，以获得不带任何纯化标签的rLj-rgd3(H-)，并对其进行蛋白发酵及纯化的中试工艺研究。研究方法：利用分子克隆方法在Lj-rgd3基因后加入终止密码子，再构建回原pET23b载体，使重组质粒上的His标签不表达。利用氯化钙转化方法将重组质粒转化入BL21大肠杆菌中以终浓度1mM的IPTG低温过夜诱导表达，并将该蛋白命名为rLj-rgd3(H-)。本课题利用20L、90L不同规格的发酵罐进行菌体高密度发酵条件摸索，利用BIO-RAD和AKTA蛋白纯化系统，采用GE公司的亲和层析柱HisTrap·HP(Ni2+柱)、Talon(Co2+柱)、HiTrap IMAC(Cu2+柱)；阳离子交换层析柱（SP FF柱、SP HP柱）；疏水层析HiTrap Phenyl HP、Phenyl FF LS、HitrapButyl FF柱；肝素亲和层析柱进行蛋白纯化工艺研究。在制剂研究中，通过添加山梨醇、氯化钠、甘氨酸、维C等不同稳定剂或抗氧化剂等药物敷料，来进行药物制剂配方优化的初步研究。并对初步优化的rLj-rgd3(H-)进行生物学功能验证。研究结果：本课题利用分子生物学方法成功构建了pET23b-rgd3(H-)重组载体，并获得了蛋白的可溶性表达。高密度发酵实验结果表明，20L的发酵罐可生产出2.76kg菌体。纯化工艺采用组氨酸亲和层析、SP柱离子交换层析，疏水层析三步完成。同时，在纯化的蛋白中加入维C、山梨醇、甘氨酸、氯化钠等保护剂，经SDS-PAGE检测，这些保护剂对纯化蛋白都有很好的稳定和保护作用。关于其功能的实验表明其同样具有抗血管新生功能、抗血栓形成功能。结论：本课题完成了去纯化标签rLj-rgd3(H-)蛋白的基因克隆与表达、发酵及纯化工艺优化，并对其制剂处方进行了初步研究,并证明其具有抗血栓及血管新生活性。随着课题的深入，将完成rLj-rgd3(H-)的药学研究，为利用其进行抗血栓、抗肿瘤的临床前研究及IND申报提供实验数据和受试药品。

关键词：日本七鳃鳗 rgd模体基因重组发酵纯化

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重组日本七鳃鳗rLj-rgd2与其4种突变体蛋白对Lewis细胞生物活性的比较

重组日本七鳃鳗rLj-RGD2与其4种突变体蛋白对Lewis细胞生物活性的...

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作者：刘洋辽宁师范大学

学位级别：硕士

Lj-rgd2含有两个rgd模体,分子质量为8kD,是来自于日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白,具有典型rgd毒素蛋白的特征。为了研究Lj-rgd2的结构与其功能具有怎样的关系,本文采用基因突变的方法,对野生型Lj-rgd2进行基因突变,即对其具有功能的rgd模体... 详细信息

Lj-rgd2含有两个rgd模体,分子质量为8kD,是来自于日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白,具有典型rgd毒素蛋白的特征。为了研究Lj-rgd2的结构与其功能具有怎样的关系,本文采用基因突变的方法,对野生型Lj-rgd2进行基因突变,即对其具有功能的rgd模体进行缺失突变,因为Lj-rgd2基因的重复序列较多,无法执行定点突变,故合成其突变体的全基因序列,以pET23b作为其突变体的载体,用CaCl转化法转入表达菌*** BL21中。Lj-rgd2的突变体包括：缺失第一个rgd基因,保留第二个rgd基因的突变体Lj-738;缺失第二个rgd基因,保留第一个rgd基因的突变体Lj-739;缺失两个rgd基因的突变体Lj-740;将两个rgd基因全部突变为KGD基因的突变体Lj-741。本课题对野生型和突变后的4个突变体类型进行了部分生物学活性的比较,从而确定其结构与功能的关系。具体流程为：载有突变体全序列基因的pET23b转化到表达菌*** BL21中,IPTG诱导带有目的基因的表达菌表达目的蛋白,经组氨酸亲和层析获得纯化的可溶性目的蛋白。获得的可溶性目的蛋白,分别作用于Lewis细胞,从而鉴定他们的生物学活性。细胞增殖实验(MTT法)结果表明,rLj-rgd2和其4个突变体蛋白均以剂量依赖方式抑制bFGF诱导的Lewis细胞的增殖,rLj-rgd2、 rLj-738、rLj-73、 rLj-740、 rLj-741的IC50值分别为1.23μmol/L、1.11μmol/L.1.18μmol/L、1.03μmol/L;通过Transwell细胞培养板检测rLj-rgd2及其4种突变体蛋白对由bFGF诱导的Lewis细胞迁移的抑制作用,其结果表明,rLj-rgd2及其4种突变体蛋白rLj-738、 rLj-739、 rLj-740、 rLj-741均能抑制Lewis细胞的迁移,抑制率分别为30%、31%、31%、34%、25%;将人工基质膜Matrigel固定到Transwell培养板的多聚碳酸盐膜上以模仿体内环境,从而研究rLj-rgd2与4种突变体蛋白对Lewis细胞浸润的抑制作用,结果显示,rLj-rgd2及其4种突变体蛋白均能抑制由bFGF诱导的Lewis细胞穿透Matrigel的浸润行为,抑制率为22%、24%、32%、32%、24%;rLj-rgd2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞骨架均有破坏作用;rLj-rgd2及其4种突变体蛋白均能诱导Lewis细胞的凋亡;对rLj-rgd2及其4种突变体蛋白作用于Lewis细胞的作用机理进行了初步的研究,结果表明rLj-rgd2及其4种突变体蛋白都能下调FAK、 ILK表达及FAK磷酸化水平。上述结果表明,rLj-rgd2抗Lewis肿瘤细胞的功能既与rgd模体也与富组氨酸结构相关,其中涉及的作用机制可能并不相同。

关键词：日本七鳃鳗 rgd模体肿瘤细胞基因突变

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重组日本七鳃鳗rLj-rgd3与其五种突变体蛋白抗血管新生活性的比较

重组日本七鳃鳗rLj-RGD3与其五种突变体蛋白抗血管新生活性的比较

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作者：张亚前辽宁师范大学

学位级别：硕士

Lj-rgd3为来自于七鳃鳗口腔腺的含有三个rgd模体的毒素蛋白,其除具有rgd模体这一典型rgd毒素蛋白特征外,还与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性。由于rgd毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同,为了研究Lj-rgd3结构与... 详细信息

Lj-rgd3为来自于七鳃鳗口腔腺的含有三个rgd模体的毒素蛋白,其除具有rgd模体这一典型rgd毒素蛋白特征外,还与富含组氨酸糖蛋白HRG具有序列同源性。由于rgd毒素蛋白及HRG都具有抑制血管新生的活性,但作用靶点不同,为了研究Lj-rgd3结构与功能的关系,本文对野生型Lj-rgd3进行了rgd模体缺失突变,包括:三个rgd的全缺失突变体Lj-112;仅保留第1位rgd的突变体Lj-113;仅保留第2位rgd的突变体Lj-114;仅保留第3位rgd的突变体Lj-115;将三个rgd全部突变为KGD的突变体Lj-116。本课题对上述突变体蛋白与野生型之间进行了生物学活性的比较,以确定其结构与功能的关系。具体方法为:将突变基因全序列合成后构建于pET-23b载体,对各蛋白进行IPTG诱导表达,经组氨酸亲和层析纯化。MTT结果表明,rLj-rgd3与各突变体蛋白均以剂量依赖方式抑制bFGF诱导的ECV304细胞增殖,rLj-rgd3的IC50为0.889μmol/L,rLj-112的IC50为0.160μmol/L,rLj-113的IC50为0.215μmol/L,rLj-114的IC50为0.143μmol/L,rLj-115的IC50为0.150μmol/L,rLj-116的IC50为0.529μmol/L。运用鸡绒毛尿囊膜(CAM)模型结果显示,rLj-rgd3与各突变体蛋白均能抑制CAM的血管新生,且同等剂量条件下rLj-112的作用较强。采用Transwell细胞培养板检测各蛋白对bFGF诱导下细胞迁移的抑制作用,结果表明,rLj-rgd3与突变体蛋白rLj-112、rLj-113、rLj-114、rLj-115和rLj-116均能抑制ECV304细胞的迁移,抑制率分别为50%、63%、42%、65%、70%和40%。利用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-rgd3与五种突变体蛋白对ECV304细胞浸润的抑制作用,结果显示,以bFGF为趋化剂的ECV304细胞穿透Matrigel的浸润行为均明显受到抑制,且rLj-112的抑制功能较强。整合素连接激酶ILK-1的ELISA实验结果表明,rLj-rgd3与五种突变体蛋白均能下调ECV304细胞ILK-1的表达。上述结果表明,野生型rLj-rgd3与其五种不同的突变体蛋白rLj-112、rLj-113、rLj-114、rLj-115和rLj-116均具有抑制血管新生功能,且突变体Lj-112的活性相对于野生型和其他突变体蛋白较高,这说明Lj-112为HRG功能蛋白,而野生型Lj-rgd毒素蛋白与HRG序列的同源性并未使野生型抗血管新生功能得到协同加强,二者的抗血管新生功能涉及了不同的信号通路。而Lj-rgd3不同位置rgd缺失突变体的血管新生抑制功能均强于野生型的结果也表明,Lj-rgd3的三个rgd模体间的抗血管新生功能也不是协同加强的,这其中的机制应与类HRG蛋白的信号通路有关。

关键词：七鳃鳗 rgd模体去整合素突变体血管新生

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重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-rgd3对人肝癌BEL-7402细胞的抑制作用

重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3对人肝癌BEL-7402细胞的抑制作用

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作者：张素杰辽宁师范大学

学位级别：硕士

rLj-rgd3含有三个rgd（Arg-Gly-Asp）模体,分子的质量为13.5k D,是一种来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌液的毒素蛋白。rLj-rgd3具有极强的抗肿瘤功能,已经被证明对人宫颈癌以及黑色素瘤等多种肿瘤有抑制作用。但目前还没有报道证实rLj-rgd3... 详细信息

rLj-rgd3含有三个rgd（Arg-Gly-Asp）模体,分子的质量为13.5k D,是一种来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌液的毒素蛋白。rLj-rgd3具有极强的抗肿瘤功能,已经被证明对人宫颈癌以及黑色素瘤等多种肿瘤有抑制作用。但目前还没有报道证实rLj-rgd3对人肝癌BEL-7402细胞是否有影响。肝癌是常见的肿瘤之一,预后差,极易发生转移,患者生存率很低,给患者造成极大的痛苦。因此,本论文将探究重组七鳃鳗毒素蛋白rLj-rgd3对人肝癌BEL-7402细胞的影响。为了研究rLj-rgd3对人肝癌BEL-7402细胞的影响,本论文针对rLj-rgd3对肿瘤的增殖、迁移、浸润、凋亡等几个关键性步骤的功效进行了测定。细胞增殖实验（MTT法和吉姆萨染色法）表明,亲和层析纯化后的rLj-rgd3能够呈剂量依赖性地抑制人肝癌BEL-7402细胞的增殖,其作用的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为5μM。Transwell法和细胞划痕实验结果证实,rLj-rgd3对b FGF（basic fibroblast growth factor）诱导的BEL-7402细胞迁移具有抑制作用,且呈剂量依赖性。利用人工基质膜Matrigel和Transwell细胞培养板模仿体内细胞外基质环境。细胞浸润实验的结果显示,rLj-rgd3对b FGF诱导的BEL-7402细胞浸润具有抑制作用,且呈剂量依赖性。接下来,本论文对rLj-rgd3能否引起BEL-7402细胞发生凋亡进行了测定。Hochest 33258染色、TUNEL-FITC染色和流式实验结果显示,rLj-rgd3能呈剂量依赖性方式显著诱导BEL-7402细胞发生凋亡。这表明了诱导细胞凋亡是rLj-rgd3抑制BEL-7402细胞增殖的基础。此外,鬼笔环肽-FITC染色结果表明rLj-rgd3能以剂量依赖性方式破坏BEL-7402细胞的骨架。最后,通过Western blot法进一步研究了rLj-rgd3作用于BEL-7402细胞的机制。结果表明其能抑制AKT的磷酸化,促使BEL-7402细胞的抗凋亡基因Bc L-2表达下调,促凋亡基因BAX表达上调,以及促使Caspase-8裂解成41 k Da亚单位的水平增加。综上所述,rLj-rgd3能够抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖、迁移、浸润,并且最终能够诱导人肝癌细胞BEL-7402发生凋亡。随着对rLj-rgd3的深入研究,rLj-rgd3有望成为治疗人肝癌新的药物。

关键词： rgd模体人肝癌BEL-7402细胞迁移浸润细胞凋亡

来源：评论

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