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神经解剖学杂志 2020年第1期36卷 29-34页

作者：梁婵婵王巧真蒋欣刘金梦徐进超郑怡雯王箐潍坊医学院生物科学与技术学院潍坊261053 潍坊医学院神经疾病与再生修复实验室潍坊261053 潍坊医学院临床医学院潍坊261053

目的:通过研究RhoA和ROCK2在sod1-g93a转基因小鼠脊髓内的表达变化以阐明Rho/ROCK信号通路在肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中的作用。方法:饲养sod1-g93a转基因小鼠和同窝野生型小鼠至发病早期、中期和晚期,部分小鼠冰上剥离新鲜脊髓组织,... 详细信息

目的:通过研究RhoA和ROCK2在sod1-g93a转基因小鼠脊髓内的表达变化以阐明Rho/ROCK信号通路在肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中的作用。方法:饲养sod1-g93a转基因小鼠和同窝野生型小鼠至发病早期、中期和晚期,部分小鼠冰上剥离新鲜脊髓组织,利用RT-PCR方法检测RhoA和ROCK2 mRNA的表达,利用Western Blot方法检测RhoA和ROCK2蛋白的表达;部分小鼠行心脏灌注并剥离其脊髓组织制成冰冻切片,利用免疫组织化学染色方法检测RhoA和ROCK2蛋白的表达。结果:在sod1-g93a鼠发病的早期、中期和晚期,转基因小鼠脊髓中RhoA和ROCK2的mRNA及蛋白表达均上调。免疫组织化学染色实验结果显示,野生型小鼠脊髓中RhoA和ROCK2弥散分布于胞质和突起中,阳性染色浅,sod1-g93a转基因小鼠脊髓中RhoA和ROCK2阳性染色深,大量聚集在细胞膜及细胞质。结论:RhoA和ROCK2在sod1-g93a转基因小鼠脊髓中异常高水平表达与ALS脊髓区病变密切相关,可能参与ALS疾病进程。

关键词：肌萎缩侧索硬化症脊髓 RhoA ROCK2 sod1-g93a转基因小鼠

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转录因子12在sod1-g93a转基因小鼠大脑皮层和纹状体中的表达与定位研究

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神经解剖学杂志 2019年第4期35卷 371-376页

作者：丁昊宇陈燕春郑怡雯徐进超周永佳林宝勇张皓云刘焕彩潍坊医学院临床医学院潍坊261053 潍坊医学院生物科学与技术学院潍坊261053 潍坊医学院附属医院潍坊261053

目的:检测转录因子12(TCF12)在sod1-g93a转基因小鼠不同年龄阶段大脑皮层和纹状体中的表达情况。方法:采用成年sod1-g93a转基因小鼠和野生型(WT)小鼠,分别在转基因小鼠肌萎缩性侧索硬化症(ALS)发病的早(95 d)、中(108 d)、晚(122 d)期... 详细信息

目的:检测转录因子12(TCF12)在sod1-g93a转基因小鼠不同年龄阶段大脑皮层和纹状体中的表达情况。方法:采用成年sod1-g93a转基因小鼠和野生型(WT)小鼠,分别在转基因小鼠肌萎缩性侧索硬化症(ALS)发病的早(95 d)、中(108 d)、晚(122 d)期取材制备标本。使用real time RT-PCR技术检测TCF12的mRNA表达情况,使用Western Blot技术检测TCF12蛋白表达情况,使用免疫荧光双标记技术检测TCF12在大脑皮层和纹状体的表达分布以及细胞类型分布。结果:在sod1-g93a转基因小鼠和WT小鼠的大脑皮层和纹状体中均检测到了TCF12分布,TCF12在神经元表达;在ALS发病早、中、晚期sod1-g93a转基因小鼠大脑皮层中的TCF12 mRNA和蛋白表达较WT小鼠显著升高(P<0.05,P<0.01);在发病中、晚期sod1-g93a转基因小鼠纹状体中的TCF12 mRNA和蛋白水平表达相较于WT小鼠显著升高(P<0.01)。结论:TCF12在sod1-g93a转基因小鼠发病中晚期大脑皮层和纹状体中表达升高,提示TCF12分子参与大鼠了ALS发病中、晚期神经元的退变进程。

关键词：肌萎缩性侧索硬化症(ALS) 转录因子12(TCF12) 大脑皮层纹状体 sod1-g93a转基因小鼠

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雄激素对sod1-g93a转基因小鼠发病机制作用的研究

雄激素对SOD1-G93A转基因小鼠发病机制作用的研究

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作者：史朋晓河北医科大学

学位级别：硕士

目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种进行性和致命性神经退行性疾病,累及运动皮层、脑干及脊髓前角运动神经元,逐渐出现进行性加重的衰弱和骨骼肌萎缩，最终导致瘫痪和死亡[1]。临床特征是上、下运动神... 详细信息

目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种进行性和致命性神经退行性疾病,累及运动皮层、脑干及脊髓前角运动神经元,逐渐出现进行性加重的衰弱和骨骼肌萎缩，最终导致瘫痪和死亡[1]。临床特征是上、下运动神经元受损的症状并存，而感觉和括约肌功能一般不受影响，其发病机制尚不明确。约5-10%为家族性ALS（familialALS，fALS），90-95%是散发性ALS（sporadic ALS, sALS）。大约20%家族性ALS病例及4%散发性ALS病例与铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Znsuperoxide dismutase1，sod1）突变有关。 ALS是一种多因子疾病，遗传和环境因素，如毒素和感染，通过协同作用影响疾病的发生和发展[2]。流行病学研究表明职业，如接触重金属或化工、机械或电气创伤和剧烈的体育活动等可能影响ALS的发病率。年龄和性别是与本病重要的相关危险因素[3,4]，可影响疾病的发生发展及临床表现。事实上，ALS多为中年发病，发病年龄高峰为45-70岁，男女发病率未2.6：1[5]，导致这一差异的原因尚不清楚，暗示性激素可能参与该病的发生。在过去的10多年里，一些研究证实性激素对发育期和成人正常神经活动具有显著的营养作用[6,7]，尤其是雄激素（睾酮和双氢睾酮）可影响体内脊髓和脑干运动神经元的形态和存活[8,9]，脱氢表睾酮和硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）为主要的循环类固醇,可以抑制谷氨酸介导的神经毒性[10]作用。此外，研究证明雌激素通过也可基因组和非基因效应发挥明显的神经保护作用[11]。本研究在此基础上，在无菌条件下对50天雄鼠进行去势手术，应用免疫组化方法研究了sod1-g93a转基因小鼠腰髓的形态学变化情况，应用免疫印迹法研究突变sod1蛋白、自噬标示物LC3Ⅱ和P62、氧化应激标示物HO-1和gCLM及凋亡指标CASPASE3随病程进展表达变化，探讨雄激素对雄性sod1-g93a转基因小鼠病情变化及发展的影响，研究导致ALS发病具有明显性别差异的可能机制，为以后ALS的诊断和个体化治疗提供实验依据。方法： 1转基因鼠的繁殖动物实验过程严格遵守河北省实验动物管理办法规定，所有sod1-g93a转基因鼠均饲养在恒温（25-27℃）、恒湿、无特定病原菌（specific pathogen free，SPF）环境中，喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料和无菌水。为维持B6SJL-TgN（sod1-g93a）1gur转基因小鼠突变基因稳定下传，用B6SJL sod1-g93a/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖，两种小鼠均购自美国Jackson实验室（Bar Harbor, ME, USA）。于3-4周时剪取子代鼠尾部组织进行基因鉴定，以明确否携带有hsod1基因。 2实验分组取7周左右雄鼠，根据鉴定结果，随机分为四组，后进行手术处理，分为阳性去势组、阳性假手术组、阴性去势组和阴性假手术组。依据sod1-g93a小鼠的发病规律分为症状前期（60天）、症状早期（100-120天）和终末期（130-150天）,在这3个时间点取材。阳性组为sod1-g93a转基因小鼠，阴性组为各时期非转基因同窝对照小鼠，四组均在每个时间点留取6只小鼠。症状前期取自出生后60天，体重无减轻且无临床症状，评分4分，症状早期指体重开始减轻、出现步态异常，评分2分。终末期指小鼠体重减轻20%以上，仰卧30秒不能翻身，评分0分。 3实验方法 3.1取材各组小鼠各个时期用10%的水合氯醛腹腔内注射麻醉后，分别以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓等所需组织迅速投入液氮速冻后于-80℃冰箱保存。 3.2免疫组化法腰髓经4%多聚甲醛固定采用震荡切片;切成30μm切片;0.01M PBS洗5分钟×3次,0.3%过氧化氢浸泡15分钟以封闭组织内源性过氧化物酶;0.3%Triton打孔30分钟;10%马血清封闭约30分钟;一抗封闭过夜;洗去一抗，加二抗封闭2小时;洗去二抗，加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素室温1小时;DAB染色3-10分钟;蒸馏水终止染色，铺片，晾干;脱水;透明;封片 3.3免疫印迹（Western blotting）分别提取腰髓总蛋白，用BCA法测蛋白浓度。每个样品蛋白上样量为80μg，用10%或13%SDS-PAgE电泳后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉（PBS稀释）室温封闭1小时后，分别加兔抗ACTIN抗体（1:600）兔抗P62抗体（1:1500）、兔抗gCLM（1:1000）、兔抗HO-1（1:1000）、羊抗sod1抗体（1:500）、兔抗LC3Ⅱ（1:1500）及兔抗caspase3（1:1500）4℃摇床过夜。次日，TPBS洗膜4次，每次5分钟。然后分别加

关键词：肌萎缩侧索硬化 sod1-g93a转基因小鼠去势手术假手术 sod1 LC3Ⅱ P62 gCLM HO-1 CASPASE3

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Parkin蛋白在sod1-g93a转基因小鼠腰髓中的表达

Parkin蛋白在SOD1-G93A转基因小鼠腰髓中的表达

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作者：孙丽燕河北医科大学

学位级别：硕士

目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性、进行性神经系统变性疾病。其发病机制主要涉及氧化应激损伤、谷氨酸兴奋毒作用、线粒体功能异常、细胞内钙离子超载、免疫异常及蛋... 详细信息

目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种选择性累及上、下运动神经元的慢性、进行性神经系统变性疾病。其发病机制主要涉及氧化应激损伤、谷氨酸兴奋毒作用、线粒体功能异常、细胞内钙离子超载、免疫异常及蛋白异常聚集等几个方面，但确切的发病机制尚未明确。目前ALS仍缺乏有效的治疗方法，病人的存活期一般仅为3到5年。 Parkin由Kitada等人首先克隆并且命名，是常染色体隐性遗传少年型帕金森病(Autosomal recessive juvenile parkinsonism，ARJP)的致病基因。Parkin作为泛素化E3连接酶，其N-末端为泛素化结构，C-末端为RINg结构。RINg结构由两部分组成，即RINg1、RINg2，其拥有泛素化连接酶的活性，直接参与了泛素化过程。有研究表明：过表达Parkin能够保护神经元，可以抵抗因过表达或内源性底物蛋白积聚而产生的毒性侵害。正常情况下，当线粒体膜电位发生改变时，一部分Parkin从胞浆转移至线粒体，发挥泛素化作用，同时激活线粒体自噬。此外，Parkin蛋白对运动神经元的保护作用，还表现在其与抗凋亡蛋白Bcl-2相互作用，发挥抗凋亡功能。Parkin蛋白的酶活性丧失，将影响泛素蛋白酶体系（Ubiquitin-proteasomesystem, UPS）的功能，导致未泛素化的底物蛋白异常聚集，造成细胞损伤，最终导致细胞死亡。研究发现：在帕金森病（Parkinson’s disease, PD）和阿尔茨海默病（Alzheimer ’s disease, AD）患者尸检组织中，均发现Parkin蛋白的表达量存在改变。PD、AD与ALS都是神经系统变性疾病，存在选择性神经元的丢失，发病机制均涉及到异常蛋白聚集、氧化应激、兴奋性毒性、线粒体功能障碍和凋亡等途径。 sod1-g93a转基因小鼠是目前研究ALS较理想的动物模型之一。本实验欲通过对sod1-g93a转基因小鼠腰髓中Parkin蛋白表达量的研究，观察Parkin蛋白在sod1-g93a转基因小鼠腰髓中变化情况，分析Parkin蛋白在ALS中潜在的作用及意义，进一步探讨ALS可能存在的发病机制。方法：选用sod1-g93a转基因小鼠，本实验分为对照组和实验组。选取100天的阴性小鼠作为对照组，实验组按时间点分为症状早期（60d），症状期与终末期三个亚组，各组5只小鼠。10%水合氯醛(350mg/Kg体重)腹腔麻醉小鼠后，摘除小鼠双侧眼球放血，取小鼠的腰髓，称重后立即放于液氮中，然后放-80℃超低温冰箱保存直至Western blot时使用。4%多聚甲醛经心脏灌注，之后剥离小鼠腰髓，用4%多聚甲醛浸泡保存组织至免疫组化时使用。利用免疫组化和western blot分析方法，观察sod1-g93a转基因小鼠腰髓Parkin蛋白免疫活性与表达量情况，进一步分析sod1-g93a转基因小鼠不同时期，Parkin蛋白表达量的变化。结果： 1利用免疫组化方法观察sod1-g93a转基因小鼠腰髓前角细胞Parkin免疫活性:随着病情的进展，小鼠腰髓Parkin免疫活性表达逐渐降低。终末期组基本上无Parkin蛋白免疫活性表达。 2利用Western blot技术检测sod1-g93a转基因小鼠腰髓Parkin蛋白表达含量：随着sod1-g93a转基因小鼠病情进展，Parkin表达含量逐渐减少。与对照组比较，症状期、终末期Parkin表达量减少，差别具有统计学意义（P<0.05）。与症状早期和症状期组分别比较，终末期组Parkin表达量减少，差别均具有统计学意义（P<0.05）。症状早期组与阴性对照组比较无明显变化。结论：通过对sod1-g93a转基因小鼠腰髓中Parkin蛋白免疫活性及表达量的研究分析，实验结果表明：Parkin蛋白免疫活性与表达量随着疾病进展逐渐减少，终末期基本上无Parkin蛋白免疫活性表达。随着疾病进展，Parkin蛋白逐渐减少，可能会影响Parkin泛素连接酶作用的发挥，使泛素化蛋白酶体系的作用减弱，进而导致Parkin对细胞内异常蛋白的降解作用下降，异常蛋白在细胞内聚集，对细胞形成毒性损伤，最终导致细胞死亡。对sod1-g93a转基因小鼠中Parkin蛋白的研究，可能会为探索ALS发病机制提供一定线索。

关键词：肌萎缩侧索硬化 Parkin 泛素化泛素蛋白酶体系 sod1-g93a转基因小鼠

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脑Ras同源蛋白与雷帕霉素哺乳动物靶蛋白在sod1-g93a转基因小鼠中的研究

脑Ras同源蛋白与雷帕霉素哺乳动物靶蛋白在SOD1-G93A转基因小鼠中...

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作者：刘星河北医科大学

学位级别：硕士

目的：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种以累及上下运动神经元为特点，继而导致患者出现进行性加重的肌肉无力与肌萎缩，而其感觉常不受累的神经系统变性疾病。临床研究显示，该病患者常于发病后的3-5年内因出... 详细信息

目的：肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种以累及上下运动神经元为特点，继而导致患者出现进行性加重的肌肉无力与肌萎缩，而其感觉常不受累的神经系统变性疾病。临床研究显示，该病患者常于发病后的3-5年内因出现呼吸肌受累的症状而死亡。在ALS患者中约有90%～95%为散发性，剩余的5%～10%则为家族性，而在家族性ALS中，约有20%是由于Cu/Zn超氧化物歧化酶（sod1）基因突变而导致的。目前的研究认为，ALS的病因有很多，但无论是氧化应激的异常、异常蛋白的聚集、谷氨酸的兴奋性毒性、还是免疫学因素、自噬的异常和轴索运输的障碍，其结果均是造成了神经元的大量死亡，从而造成发病。随着研究的逐渐深入，自噬及其调节的异常逐渐被人们所关注。细胞内存在着多种调节自噬的途径，通过这些途径，细胞能更好地适应外环境的变化与内环境的改变，因此使其能够在不利条件下得以生存，保证机体功能的正常。在众多调节细胞自噬的途径中，较为重要的一条便是脑Ras同源蛋白(Ras homolog enriched in brain，Rheb)与雷帕霉素哺乳动物靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)途径。Rheb是鸟苷酸结合蛋白RAS超家族中的一员，参与机体调节的多个方面，研究证实，Rheb可以通过影响结节蛋白(TSC)进而达到对mTOR的调节作用。而mTOR是一种苏/丝氨酸激酶，在细胞生长中具有重要的地位。mTOR可以调节基因的转录，参与蛋白质的翻译，调控核糖体的合成及抑制细胞的自噬等。研究已经证实，在家族性ALS中存在sod1的异常聚集，可以推断作为细胞清除内部异常物质聚集的自噬可能产生了异常，那么具有调节自噬作用的Rheb-mTOR途径是否发生了异常？这仍需要进一步的研究。 sod1-g93a转基因小鼠因其能较好的模拟家族性ALS的发病过程，是目前研究家族性ALS最为理想的动物模型之一。本实验欲研究Rheb与mTOR在sod1小鼠腰髓前角中的相关变化，探讨二者在ALS发生及发展过程中的相关作用。方法：选取sod1-g93a转基因小鼠为实验组，根据病程分为60天组（症状前期）、症状期组、终末期组，选取100天的阴性小鼠作为对照组，每组8只。用10%水合氯醛(350mg/Kg)腹腔注射以麻醉小鼠，麻醉后处死小鼠，取腰髓后迅速置于EP管中，之后投入液氮冷冻，于-80℃低温冰箱保存；以4%多聚甲醛经心脏灌注小鼠，随后将小鼠腰髓剥离，以4%多聚甲醛溶液浸泡、固定组织。利用Western blot技术及免疫组织化学技术检测Rheb与mTOR在各组小鼠腰髓中的含量，同时观察sod1-g93a转基因小鼠腰髓运动神经元的形态。利用spss17.0统计软件对所得数据进行统计分析。结果： ***1-g93a转基因小鼠腰髓Rheb的含量：首先，免疫组织化学显示：sod1-g93a转基因小鼠组腰髓神经元较阴性对照组数量减少，腰髓前角内Rheb免疫活性下降。其次，利用Western blot技术检测sod1-g93a转基因小鼠腰髓Rheb表达量，结果显示：sod1-g93a转基因小鼠组与阴性对照组Rheb含量相比有所下降，其差别有统计学意义。随疾病的进展，sod1-g93a转基因小鼠腰髓中Rheb含量逐渐减少，各期之间存在显著性差异。 2. sod1-g93a转基因小鼠腰髓mTOR的含量：首先，免疫组织化学显示：sod1-g93a转基因小鼠组腰髓神经元较阴性对照组数量减少，腰髓前角内mTOR免疫活性下降。其次，利用Western blot技术检测sod1-g93a转基因小鼠腰髓mTOR表达量，结果显示：sod1-g93a转基因小鼠组与阴性对照组mTOR含量相比有所下降，其差别具有统计学意义。随疾病的进展，sod1-g93a转基因小鼠腰髓中mTOR含量逐渐减少，终末期较症状前期减少更为明显。 3. sod1-g93a转基因小鼠腰髓中Rheb与mTOR的相关性：应用统计学分析Rheb与mTOR的相关性，其结果显示：它们的相关系数为0.804，Rheb与mTOR呈正相关。结论：通过对sod1-g93a转基因小鼠腰髓前角细胞的形态学观察与Rheb、mTOR的含量测定，本实验表明：随着疾病的进展，sod1-g93a转基因小鼠腰髓中Rheb及mTOR的含量是降低的，而二者含量的下降导致了sod1-g93a转基因小鼠的腰髓神经元可能出现自噬异常，而异常的自噬又可能进一步导致大量异常sod1在神经元内积累，最终导致了神经元的凋亡，继而导致ALS的发生。

关键词：肌萎缩侧索硬化脑Ras同源蛋白雷帕霉素哺乳动物靶蛋白 sod1-g93a转基因小鼠免疫组织化学免疫印记法

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健脾益肺方治疗ALS动物模型hsod1-g93a转基因小鼠的疗效和机制研究

健脾益肺方治疗ALS动物模型hSOD1-G93A转基因小鼠的疗效和机制研究

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作者：周志坚广州中医药大学

学位级别：硕士

目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一类主要累及运动神经元的进展性神经变性病,目前尚无有效的治疗方法。本研究拟通过不同浓度的健脾益肺方治疗ALS的动物模型hsodl-g93a转基因小鼠,通过检测模型小鼠的运动功... 详细信息

目的：肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一类主要累及运动神经元的进展性神经变性病,目前尚无有效的治疗方法。本研究拟通过不同浓度的健脾益肺方治疗ALS的动物模型hsodl-g93a转基因小鼠,通过检测模型小鼠的运动功能和脊髓前角运动神经元的存活情况来评价健脾益肺方的疗效,检测脊髓的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽(gSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(gSH-PX)活性来评价健脾益肺方的抗氧化自由基作用。为中药组方治疗ALS动物模型的疗效及作用机制提供初步的实验依据。方法：一、试剂和设备(一)健脾益肺方组成：黄芪9g,党参4.5g,白术4.5g,茯苓1g,麦冬3g,陈皮0.5g,法夏0.5g,杏仁1g,射干1g,石菖蒲0.5g,白附子0.5g,僵蚕0.5g,制马钱子0.1g,炙甘草2g。全部购买无糖颗粒剂型,批号：YPA2L0002,购自江阴天江药业有限公司。(二)***和gSH-Px的检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；焦油紫购自Sigma-Aldrich公司,其他普通试剂为国产分析纯。二、实验动物及分组(一)hsodl-g93a转基因小鼠购买自南京大学-南京生物医药研究院。(二)动物分组：应用8周龄的hsodl-g93a转基因小鼠共24只,按数字编号随机分为四组,每组6只。(1)生理盐水组(2)低浓度健脾益肺方组(2.86g／Kg)(3)中浓度健脾益肺方组(5.72g／Kg)(4)高浓度健脾益肺方组(11.44g／Kg),选同窝8周的普通野生型小鼠共6只为正常对照组,灌注生理盐水。观察小鼠的运动功能及生存期,终末期时分别取各组实验鼠各3只,进行脊髓前角运动神经元的尼氏染色,另每组3只进行抗氧化自由基实验。三、具体实验步骤(一)健脾益肺组方治疗后模型小鼠的体重变化每日实验前采用电子秤称量模型小鼠的体重,并做好记录。(二)健脾益肺组方治疗后模型小鼠发病时间、生存期及运动功能的评估1.发病时间(每日评定)采用Weydt 4分法进行评定：4分：没有运动功能异常；3分：悬尾时出现后肢颤抖；2分：步态异常；1分：至少1个后肢出现拖曳；0分：将鼠翻身成仰卧位30s内无法翻回俯卧位。发病评价：回顾性分析(超过2周),以Weydt＜4分的初始时间作为发病开始。2.生存期死亡时间：将鼠翻身为仰卧位30s内无法翻回俯卧位即Weydt为0分,登记为死亡。3.运动功能(1)悬尾实验：悬提鼠尾,观测后肢的伸张及其曲腰情况,并予评分。2分：正常；1分：部分正常；0分：缺失。(2)牵引实验：将小鼠放于30公分长的铁丝上,小鼠5分钟内掉落的次数(小鼠掉落后,立刻将其放置铁丝上继续实验)。(3)跑台实验：将小鼠放在疲劳转棒仪上,以转速16圈／分钟连续5分钟,登记每组小鼠的平均掉棒次数(小鼠掉棒后,立即将其放置回疲劳转棒仪上继续实验)。(三)健脾益肺组方治疗后的病理改变应用4%的多聚甲醛经心脏灌注,后固定24小时,蔗糖梯度脱水,用OCT包埋,取脊髓的腰段进行冰冻切片(切片厚度20μm),每隔3片取1片。应用焦油紫进行尼氏染色。前角运动神经元的计数标准：具有清晰可辨的尼氏结构,清晰的细胞核和核仁,胞体较大的多角细胞。(四)健脾益肺组方治疗机制的探讨抗氧化自由基：硫代巴比妥酸法检测MDA的含量；亚硝酸盐法测定sod的活性；二硫代二硝基苯甲酸法测定gSH的含量；二硝基苯甲酸法测定gSH-Px的活性,按照试剂盒说明书操作。结果：1.体重的变化8周龄模型小鼠开始进行体重测定,第8-12周各组间的体重无显著性差异,至第12周开始,生理盐水组模型小鼠体重开始减轻,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重仍缓慢增加；第13周开始,低浓度、中浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重也开始下降,而高浓度组模型小鼠体重仍在缓慢增加；约15周开始,高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重开始下降,同生理盐水组模型小鼠比较,低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠体重下降趋势较慢,且呈浓度正相关性。低浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异不具有统计学意义；中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠与生理盐水组模型小鼠比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。2.对发病时间和生存期的影响生理盐水组的模型小鼠在(101.5±3.45)天出现临床症状,即Weydt 4分法,评分<4分时(为发病时间),模型小鼠在病程中会出现后肢无力,悬尾时后肢震颤、后伸乏力的表现,至终末期时双侧后肢呈牵直样强直、背部屈曲,终因饮食艰难、呼吸无力而死亡,平均存活时间为(133.2±2.32)天。低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠的发病时间分别为(103.3±2.16)天、(109.5±1.87)

关键词：健脾益肺方肌萎缩侧索硬化 sod1-g93a转基因小鼠

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健脾益肺方对hsod1-g93a转基因小鼠小胶质细胞活化的影响

健脾益肺方对hSOD1-G93A转基因小鼠小胶质细胞活化的影响

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2017年第五次世界中西医结合大会

作者：杨碧莹广东省中医院大学城医院

目的:本研究拟采用hsod1-g93a转基因小鼠,给予不同浓度健脾益肺方灌胃处理,并通过评估其体重变化、运动功能、生存期等指标观察健脾益肺方的疗效;并评价健脾益肺方对ALS模型小鼠的疗效及抗炎的作用机制。方法:24只8周龄hsod1-g93a转基... 详细信息

目的:本研究拟采用hsod1-g93a转基因小鼠,给予不同浓度健脾益肺方灌胃处理,并通过评估其体重变化、运动功能、生存期等指标观察健脾益肺方的疗效;并评价健脾益肺方对ALS模型小鼠的疗效及抗炎的作用机制。方法:24只8周龄hsod1-g93a转基因小鼠随机分为:生理盐水组、低浓度健脾益肺方组、中浓度健脾益肺方组和高浓度健脾益肺方组,每组6只;6只8周龄同窝普通野生型小鼠共设为阴性对照组;模型小鼠按分组予生理盐水或不同浓度健脾益肺方灌胃,阴性对照组予等量生理盐水灌胃。测定小鼠体重、Weydt评分、悬尾试验、衣架试验、疲劳转棒试验等行为学评价,确定发病时间及生存期。免疫荧光法检测腰段脊髓前角NeuN、CD11b及NF-κB(p65、p-p65)表达情况。NeuN阳性细胞计数、CD11b阳性激活型小胶质细胞计数:每只小鼠随机取5个视野,取平均值。脊髓腰段前角的NF-κB p65、NF-κB p-p65:测定p-p65平均荧光强度,及p65荧光强度的核浆比。结果:体重变化:治疗前,生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方3个治疗组模型小鼠体重差异没有统计学意义(P>0.05)。发病期、生存期:生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方三组治疗组模型小鼠的发病时间依次为:(88.83±4.12)、(101.33±5.75)、(108.83±6.68)、(113.50±10.74)日龄。运动功能:衣架悬挂试验:与生理盐水组比较,各组不同浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠的衣架悬挂试验均更晚出现衣架悬挂试验掉落次数增长的情况,3组治疗组在14-16周龄时间段内的衣架悬挂试验掉落次数呈缓慢增长趋势,到第16周龄开始3组健脾益肺方治疗组模型小鼠的衣架悬挂试验掉落次数均呈快速增长趋势。组织免疫荧光:(一)NeuN免疫荧光表达对到达终末期的ALS模型小鼠进行心脏灌注固定,取腰段脊髓冰冻切片,荧光显微镜下观察腰段脊髓前角NeuN阳性细胞。(二)CD11b免疫荧光表达:对终末期的生理盐水组和不同浓度的三组治疗组模型小鼠的腰段脊髓前角在荧光显微镜下观察,CD11b阳性细胞表现为胞体呈不同程度地增大,细胞突起增粗、变短,呈激活的小胶质细胞。结论:体重变化:治疗前,生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方3个治疗组模型小鼠体重差异没有统计学意义(P>0.05)。发病期、生存期:生理盐水组和低浓度、中浓度、高浓度健脾益肺方三组治疗组模型小鼠的发病时间依次为:(88.83±4.12)、(101.33±5.75)、(108.83±6.68)、(113.50±10.74)日龄。运动功能:衣架悬挂试验:与生理盐水组比较,各组不同浓度健脾益肺方治疗组模型小鼠的衣架悬挂试验均更晚出现衣架悬挂试验掉落次数增长的情况,3组治疗组在14-16周龄时间段内的衣架悬挂试验掉落次数呈缓慢增长趋势,到第16周龄开始3组健脾益肺方治疗组模型小鼠的衣架悬挂试验掉落次数均呈快速增长趋势。组织免疫荧光:(一)NeuN免疫荧光表达对到达终末期的ALS模型小鼠进行心脏灌注固定,取腰段脊髓冰冻切片,荧光显微镜下观察腰段脊髓前角NeuN阳性细胞。(二)CD11b免疫荧光表达:对终末期的生理盐水组和不同浓度的三组治疗组模型小鼠的腰段脊髓前角在荧光显微镜下观察,CD11b阳性细胞表现为胞体呈不同程度地增大,细胞突起增粗、变短,呈激活的小胶质细胞。

关键词：健脾益肺方肌萎缩侧索硬化 sod1-g93a转基因小鼠小胶质细胞

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AAV9-OPTN对肌萎缩侧索硬化模型小鼠自噬通路的作用机制研究

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脑与神经疾病杂志 2025年第2期33卷 77-81页

作者：温迪李秋生李媛媛王燕燕刘亚坤河北医科大学第二医院神经内科石家庄050000 河北医科大学第二医院肝胆外科石家庄050000

目的探索以自我互补双链腺相关病毒9为载体介导的视神经病变诱导反应蛋白(AAV9-OPTN)对肌萎缩侧索硬化(ALS)sod1-g93a转基因模型小鼠自噬通路的作用。方法采用ALS的转基因sod1-g93a突变型小鼠动物模型,在其出生后30~40 d龄时采用随机的... 详细信息

目的探索以自我互补双链腺相关病毒9为载体介导的视神经病变诱导反应蛋白(AAV9-OPTN)对肌萎缩侧索硬化(ALS)sod1-g93a转基因模型小鼠自噬通路的作用。方法采用ALS的转基因sod1-g93a突变型小鼠动物模型,在其出生后30~40 d龄时采用随机的方法分配到治疗组及对照组,治疗组鞘内注射AAV9-OPTN,对照组鞘内注射AAV9-gFP。在注射40~50 d后,利用蛋白印迹技术检测腰髓中OPTN含量的变化,利用免疫荧光染色观察OPTN的定位情况,同时利用免疫荧光染色观察自噬通路相关蛋白p62、TBK1、LC3的染色情况及荧光含量变化。结果蛋白印迹结果显示鞘内注射AAV9-OPTN后,腰髓中OPTN的蛋白含量显著高于gFP对照组,免疫荧光染色OPTN的荧光强度显著高于溶剂对照组(~均P<0.01)。对自噬通路蛋白的免疫荧光染色结果显示,AAV9-OPTN治疗组中TBK1、LC3的荧光强度显著高于对照组,而p62的荧光强度降低,与对照组差异比较均有统计学意义。结论AAV9-OPTN可以转导至小鼠腰髓中并诱导OPTN蛋白表达,能够激活sod1-g93a转基因小鼠模型中的自噬通路。

关键词：肌萎缩侧索硬化 sod1-g93a转基因小鼠腺相关病毒9 视神经病变诱导反应蛋白自噬通路

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夹脊电针对ALS-sod1g93a转基因小鼠腰髓前角BDNF表达影响的机制研究

夹脊电针对ALS-SOD1G93A转基因小鼠腰髓前角BDNF表达影响的机制研...

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作者：季莹黑龙江中医药大学

学位级别：硕士

目的:以ALS-sod1转基因小鼠为实验对象,通过夹脊电针对小鼠生存期、发病时间和行为学的影响,并以BDNF为切入点,探讨夹脊电针对小鼠腰髓前角BDNF表达的影响,为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。方法:第一部分夹脊电针对ALS-sod1转基因小鼠... 详细信息

目的:以ALS-sod1转基因小鼠为实验对象,通过夹脊电针对小鼠生存期、发病时间和行为学的影响,并以BDNF为切入点,探讨夹脊电针对小鼠腰髓前角BDNF表达的影响,为夹脊电针治疗ALS提供实验依据。方法:第一部分夹脊电针对ALS-sod1转基因小鼠生存期、发病时间和行为学的影响:***-sod1转基因小鼠的鉴定:ALS-sod1转基因小鼠为本实验的实验对象,日龄30天进行PCR鉴定,鉴定方案和引物序列来自美国Jackson实验室,根据小鼠病情进展观察其表型特征。2.分组及处置:ALS-sod1转基因小鼠24只,按随机数字表法随机分为电针组、手针组、模型组各8只,日龄60天开始进行干预,模型组予以捆绑固定;手针组在模型组基础上对小鼠双侧L1～2、L5～6夹脊穴进行针刺干预;电针组在手针组的基础上,对躯干同侧电针治疗,频率为2Hz;20min/次,2次/周,共4周。3.神经功能评分及行为学测试:悬尾试验、称重、转棒实验观察小鼠发病及疾病进展。第二部分夹脊电针上调ALS-sod1转基因小鼠腰髓前角BDNF的机制研究:1.分组及处置:ALS-sod1转基因小鼠24只,同窝野生型小鼠6只,按随机数字表法随机将24只转基因小鼠分为电针组、手针组、模型组各6只,同窝野生型小鼠6只作为阴性对照,电针组、手针组、模型组处置同上一实验,阴性对照组与模型组相同时间同一时长抓握。2.尼氏染色:日龄120天时,观察各组小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化。3.免疫组化法:日龄120天时,检测各组小鼠腰髓前角BDNF的表达。结果:***-sod1转基因小鼠的表型鉴定:转基因小鼠日龄90天左右,悬尾实验中出现后肢震颤或伸展无力,100-120天左右出现行动缓慢及后肢拖拽,150天左右小鼠完全瘫痪,达到生存期终点。2.体重:与模型组比较,手针组小鼠体重下降趋势得到了一定的缓解,但无统计学意义(P>0.05),电针组能明显延缓小鼠体重降低的情况,有显著性差异(P<0.05);与手针组比较,电针组小鼠体重丢失的情况得到了延缓,但无显著性差异(P<0.05)。3.转棒实验:手针组和电针组小鼠转棒能力于19周开始到21周的时间段里,同模型组比较,改善明显(P<0.05,P<0.01),且电针组改善程度更好(P<0.01)。4.发病时间及生存期:与模型组比较,电针组小鼠发病时间明显延后,具有显著性差异(P>0.05),手针组小鼠发病时间亦发生推迟,但无显著性差异(P<0.05)。与模型组比较,手针组小鼠生存期延长,有显著性差异(P<0.05),电针组生存期延长更明显,有显著性差异(P<0.01);与手针组比较,电针组小鼠生存期延长了 6天,有显著性差异(P<0.05)。5.形态学:尼氏染色观察小鼠腰髓前角运动神经元数目和形态,阴性对照组腰髓前角神经元内含有丰富虎斑样尼氏小体,细胞形态清晰;模型组小鼠腰髓前角组织明显疏松水肿、空泡化,神经细胞结构被破坏,胞体中可见蓝色呈不规则块状的尼氏体,数量明显减少,运动神经元数量减少(P<0.01);手针组和电针组较模型组小鼠腰髓前角运动神经细胞数目增多(P<0.05,P<0.01),电针组手针组增多更明显(P<0.05),手针组和电针组小鼠腰髓前角运动神经元中的尼氏体明显增多。6.夹脊电针对ALS-sod1转基因小鼠腰髓前角BDNF的表达的影响:免疫组化染色结果显示,模型组小鼠腰髓前角BDNF的表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,手针组和电针组BDNF的表达明显升高(P<0.01),且电针组优于手针组(P<0.05)。结论:1.夹脊电针能够改善ALS-sod1转基因小鼠行为学指标,延缓发病,延长生存期。2.夹脊电针可以改善ALS-sod1转基因小鼠腰髓前角运动神经元形态学变化。3.夹脊电针可能通过上调ALS-sod1转基因小鼠腰髓前角BDNF的表达,发挥神经元保护作用。

关键词：夹脊电针肌萎缩侧索硬化 BDNF sod1-g93a转基因小鼠生存期

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丁苯酞对sod1-g93a转基因鼠脊髓前角运动神经元Nrf2及HO-1表达的影响

丁苯酞对SOD1-G93A转基因鼠脊髓前角运动神经元Nrf2及HO-1表达的...

引用

作者：闫欣河北医科大学

学位级别：硕士

目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种慢性进行性神经系统变性疾病，选择性累及上、下运动神经元，表现为进行性加重的肌肉无力和萎缩，最终因呼吸肌麻痹死亡，目前尚无有效治疗方法。该病约5%-10%有家族... 详细信息

目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种慢性进行性神经系统变性疾病，选择性累及上、下运动神经元，表现为进行性加重的肌肉无力和萎缩，最终因呼吸肌麻痹死亡，目前尚无有效治疗方法。该病约5%-10%有家族史，为家族性肌萎缩侧索硬化（FamilialAmyotrophic Lateral Sclerosis,FALS），另外约90%为散发性肌萎缩侧索硬化(Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis,SALS)，两者临床表现和病理表现相似。研究发现20%FALS的发病与编码Cu/Zn超氧化物歧化酶（Cu/Znsod1）的基因突变有关，SALS的发病与谷氨酸兴奋毒性、自身免疫机制、氧化应激、神经丝异常、线粒体功能异常等有关，各种因素相互影响，且均与氧化应激相关，因此氧化应激有是目前肌萎缩侧索硬化治疗研究的重点。研究发现ALS的发病机制与氧化应激有关，氧化应激与ALS的关系也是近年来研究的热点。机体抗氧化防御系统包括酶系和非酶系抗氧化防御系统。ARE（抗氧化反应元件，antioxidant response element）是多种抗氧化酶/解毒酶基因5’侧翼所共有的一段增强子序列，这段序列是诱导激活所必须。而抗氧化剂发挥神经元保护作用的关键分子即是Nrf2蛋白。在多种组织中Nrf2/ARE信号通路的激活都可诱导一系列内源性的细胞保护基因的上调，其中包括抗抗氧化酶、氧化蛋白、解毒和抗炎的蛋白。在神经组织中这些抗氧化酶和抗氧化蛋白的表达增多，可对抗由谷氨酸、过氧化氢及多巴胺等引起的氧化损伤。HO-1就是其中一种重要的抗氧化蛋白，它能分解血红素，生成一氧化氮、自由铁和胆绿素。胆绿素及其代谢生成的胆红素是一种生理性的自由基清除剂，可以抵抗氧化应激保护神经元。因此Nrf2/ARE信号通路的激活有望成为神经变性疾病治疗的新靶点。丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)是我国近年来开发的一个新型抗脑缺血药物。它是芹菜种子的提取物。在2002年，首次被中国国家食品药品监督管理局批准应用于中风患者。实验证明，它的神经保护作用机制是多方面的，包括减少氧化应激损伤、增加缺血区脑血流量、抑制炎症反应、重构缺血区微循环、改善线粒体的功能和抗细胞凋亡等。因此，丁苯酞可能对sod1-g93a转基因小鼠发病过程有一定影响。本研究通过免疫组化、蛋白印迹技术观察丁苯酞对肌萎缩侧索硬化sod1-g93a鼠发病过程中脊髓前角运动神经元Nrf2及HO-1表达的影响，进一步了解丁苯酞神经保护作用机制，为ALS治疗研究及开发丁苯酞用途提供依据。方法： 1动物模型的建立转人类sod1-g93a小鼠和同窝非转基因小鼠是由美国Jackson Lab引进的B6SJL-BTg（sod1-g93a）1gur/J半合子雄鼠与B6SJLF1/J+/+雌鼠1:1杂交繁殖而来，通过剪取小鼠尾尖提取DNA，用聚合酶连反应（PCR）鉴定小鼠是否携带突变的sod1-g93a基因。 2动物分组及处理筛选鉴定出sod1-g93a阳性的小鼠48只，并随机将其分为低、中、高剂量丁苯酞组和安慰剂组，选同窝hsod1-g93a阴性小鼠作为阴性对照组，每组各12只，雌雄各半。通过灌胃的方法每天给转基因小鼠服用丁苯酞和玉米油。于小鼠6周龄起分别按照60mg/kg、120mg/kg、180mg/kg的剂量对三个治疗组小鼠进行灌胃，安慰剂组给予同等量（10ml/kg）的玉米油灌胃，一天一次。 3发病时间及生存期观察参考Vercelli等的1-5分评分法进行评分，4分为发病时间，1分为死亡时间。5分：无运动功能障碍4分：将小鼠悬吊时出现后肢伸展异常或震颤3分：明显的后肢无力、步态异常2分：双后肢完全瘫痪，爬行仅靠前肢1分：双后肢完全瘫痪，并且将小鼠仰卧后20s内小鼠不能翻转 4免疫组化用10%水合氯醛将小鼠麻醉后，心脏灌注4%多聚甲醛固定20min，快速取出小鼠脊髓腰段以4%多聚甲醛固定48h，振动切片30μm厚，免疫组织化学法观察髓前角神经元Nrf2、HO-1表达分布。 5免疫印迹 10%水合氯醛腹腔注射将小鼠麻醉后，新鲜取小鼠脊髓腰段，液氮速冻，-80℃储藏，提取总蛋白用蛋白免疫印迹的方法检测各组小鼠腰髓Nrf2、HO-1蛋白表达。 6统计学方法采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计处理。各组数据均用x±SEM表示。Kaplane-Meier（K-M）生存曲线用于发病时间和生存时间的统计分析。其他数据采用单因素方差分析或秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。结果： 1发病时间与生存期低（60mg/kg）、中（120mg/kg）和高剂量（180mg/kg）治疗组分别使sod1-g93a转基

关键词：肌萎缩侧索硬化 sod1-g93a转基因小鼠氧化应激丁苯酞神经元保护作用

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