检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：王欢江苏大学

学位级别：硕士

研究目的:　　通过在293细胞中建立tet-On诱导基因表达系统，检测该系统是否能诱导TROP2蛋白的表达，并探讨TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭功能方面的作用。　　研究方法:　　***-On-Advanced稳定细胞株的构建　　用tet-On-Advan... 详细信息

研究目的:　　通过在293细胞中建立tet-On诱导基因表达系统，检测该系统是否能诱导TROP2蛋白的表达，并探讨TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭功能方面的作用。　　研究方法:　　***-On-Advanced稳定细胞株的构建　　用tet-On-Advanced质粒转染293细胞，通过G418筛选，RT-PCR法检测四环素反应转录活化因子(rtTA)基因，筛选转染阳性克隆。通过pTRE-Tight-Luc载体转染上述阳性转染克隆，经强力霉素(DOX)诱导荧光素酶表达，用萤火虫荧光素酶试剂盒检测，验证tet-On系统，筛出稳定细胞株。　　***调节293细胞中TROP2蛋白的表达　　构建含TROP2基因的重组载体pTRE-Tight-TROP2:采用PCR扩增TROP2基因，提取pTRE-Tight质粒，EcoRⅠ与XbaⅠ双酶切TROP2基因与pTRE-Tight质粒，T4连接酶连接酶切产物，转化感受态DH5α，挑单克隆菌株摇菌，将菌液做模板，扩增TROP2基因，取阳性株提取重组质粒，送公司测序。　　将pTRE-Tight-TROP2转染进tet-On-Advanced稳定转染株，设立不同实验组:Ⅰ组:不转染pTRE-Tight-TROP2质粒组;Ⅱ组:转染pTRE-Tight-TROP2质粒且加DOX(1000ng/ml)组;Ⅲ组:转染pTRE-Tight-TROP2质粒且不加DOX组。RT-PCR检测不同组细胞的TROP2基因，FCM检测不同组细胞的TROP2蛋白表达。　　***2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用　　通过增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验与Transwell侵袭实验检测TROP2蛋白功能。　　研究结果:　　***-On-Advanced稳定细胞株的构建　　tet-On-Advanced质粒转染293细胞，经过G418筛选和亚克隆，获得21株单克隆细胞株，扩大培养。RT-PCR检测21株单克隆细胞株中四环素反应转录活化因子(rtTA)基因，结果显示，21株单克隆株中，有10株检测到rtTA基因，编号为1-10。从10株细胞株中，用萤火虫荧光素酶检测试剂盒挑选稳定转染细胞株，结果显示，加DOX组的荧光素酶活性检测结果明显高于不加DOX组，从中选出荧光度值高于3000的4株细胞（1、2、6、9、号细胞株）为候选细胞。考虑到本底的因素，1号细胞株被选出做为转染效果最好的细胞株，用于后续试验。　　***调节293细胞中TROP2蛋白的表达　　PCR法扩增TROP2基因，结果显示有大小为969bp的条带，与预期结果相符。TROP2基因与pTRE-Tight载体经双酶切、连接、转化DH5α感受态细菌、涂板，挑10个单克隆菌落进行摇菌，将菌液做模板，扩增TROP2基因，得2株阳性菌株。提取质粒，电泳显示大小均为3574bp，与预期结果一致。核酸序列分析结果证明其序列正确，表明所得质粒为重组质粒pTRE-Tight-TROP2。　　pTRE-Tight-TROP2重组质粒转染tet-On-Advanced稳定细胞株，经DOX诱导，RT-PCR法检测3组细胞中TROP2基因的表达水平，FCM法检测3组细胞中TROP2蛋白的表达水平。结果显示，加DOX组细胞中TROP2基因、蛋白的水平明显高于对照组。　　***2蛋白对细胞增殖、迁移与侵袭功能的作用　　MTT法检测细胞生长、增殖情况，结果显示，加DOX组细胞增殖速度明显比对照组细胞快;划痕实验与Transwell迁移实验用于检测细胞迁移功能，拍照记录、MTT检测与结晶紫染色结果显示，加DOX组细胞迁移能力明显高于对照组;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭功能，通过细胞计数及结晶紫染色，结果表明，相对于对照组，加DOX组细胞的侵袭功能明显升高。　　研究结论:　　在293细胞中成功构建了稳定的tet-on诱导表达系统，且诱导表达效果较为显著。构建重组质粒pTRE-Tight-TROP2，将其转染制各好的tet-On-Advanced稳定细胞株，在诱导剂DOX作用下，成功诱导了TROP2蛋白的表达，并通过一系列实验证明TROP2蛋白在促进细胞增殖、迁移与侵袭能力上有显著作用。

关键词： 293细胞 tet-on诱导表达系统 TROP2蛋白生物学功能细胞增殖细胞迁移

来源：评论

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可调控小鼠尿激酶原激活剂真核表达载体的构建及其在Huh7细胞中的表达

引用

生物技术通讯 2009年第3期20卷 307-310页

作者：孙世惠郭燕菊李军锋周小军于虹童贻刚周育森军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的:建立基于tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂(uPA)的诱导表达系统。方法:提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与ptet... 详细信息

目的:建立基于tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂(uPA)的诱导表达系统。方法:提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与ptet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清(诱导组),提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7(未诱导组)和正常培养Huh7(正常对照组)细胞及培养上清作为对照。结果:与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论:构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。

关键词： tet-on诱导表达系统尿激酶原激活剂真核表达系统

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制备tet调控BCR-ABL融合基因转基因小鼠的初步研究

制备Tet调控BCR-ABL融合基因转基因小鼠的初步研究

引用

作者：王海洋扬州大学

学位级别：硕士

慢性髓细胞白血病(Chronic Myeloid Leukaemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞异常的骨髓恶性增生性疾病,具有特征性融合基因——BCR-ABL。为进一步阐明CML的发生发展机理,人们一直在尝试制备BCR-ABL融合基因转基因小鼠实验模型。理想... 详细信息

慢性髓细胞白血病(Chronic Myeloid Leukaemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞异常的骨髓恶性增生性疾病,具有特征性融合基因——BCR-ABL。为进一步阐明CML的发生发展机理,人们一直在尝试制备BCR-ABL融合基因转基因小鼠实验模型。理想的CML实验动物模型应能有效地模拟人类CML疾病的临床表现,为CML的研究提供理想的实验研究平台。但是目前多数BCR-ABL转基因小鼠却表现为急性淋巴细胞白血病,试验结果并不令人满意。本实验室试图利用tet-On诱导系统定时定量的控制BCR-ABL融合基因,在小鼠出生后诱导P210bcr-abl表达,同时利用bcr启动子特异控制tet-On系统调控蛋白的表达,使P210bcr-abl在小鼠造血干细胞和髓系血细胞中特异表达。通过受时空控制的P210bcr-abl表达避免P210bcr-abl的胚胎毒性,制备符合人CML慢性期疾病表现的BCR-ABL转基因小鼠模型,用于CML发生、发展、转归和干预的基础和临床研究。在前期研究中,本实验室已经成功克隆了1.1 kb人bcr启动子并证实其在髓系细胞中具有相对组织特异性表达的特性,成功构建了pbcr-tet-On-tTs和pTRE2-BCR-ABL-Hyg两个重组质粒。在上述工作的基础上,我们首先将pbcr-tet-On-tTs和pTRE2-BCR-ABL-Hyg两个重组质粒共转染人急性髓细胞白血病细胞株HL-60细胞,采用强力霉素DOX诱导bcr启动子控制的调控蛋白rtTA在髓系血细胞中特异表达,双转染阳性的HL-60细胞中P210bcr-abl的表达与DOX浓度存在量效关系。在细胞水平验证tet-On调控的、特异性表达BCR-ABL融合基因表达系统的有效性后,我们将bcr-tet-On-tTS和TRE2-BCR-ABL基因元件通过显微注射的方法分别或共注射到ICR×C57BL/6杂交F1代鼠的雄原核中,试图制备tet-On系统调控融合基因BCR-ABL表达的转基因小鼠模型。转基因整合的鉴定是进行转基因动物制备的重要环节之一,聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)因其灵敏度高、操作简便等原因而成为转基因动物筛选的主要检测方法之一。为了提高PCR法筛选BCR-ABL融合基因转基因小鼠检测的准确性与可信度,我们从模板质量、引物、Taq酶浓度、Mg2+浓度、退火温度等方面对用于BCR-ABL融合基因转基因小鼠初筛的PCR方法进行优化,努力提高PCR反应的灵敏度与特异性。同时我们通过严格操作规范,协同紫外照射等方法来避免环境污染。在本研究中,我们在116只受体鼠中移植了2550个原核显微注射卵,共出生小鼠212只,显微注射的成功率为60.9%,小鼠出生率为8.3%。其中TRE2-BCR-ABL和bcr-tet-On-tTS双基因注射移卵1709个,出生小鼠37只,小鼠出生率为2.2%;TRE2-BCR-ABL单基因注射移卵281个,出生小鼠25只,小鼠出生率为8.9%;bcr-tet-On-tTS单基因注射移卵560个,出生小鼠150只,小鼠出生率为26.8%。我们对出生的转基因小鼠采用优化后的PCR方法进行了初筛,结果筛选到三只BCR-ABL基因阳性鼠,其中一只经Southern blot实验证实,其后代共有21只鼠,均未检测到BCR-ABL基因整合的阳性鼠。目前没有筛选到转pbcr-tet-On-tTS基因阳性的小鼠。目前,我们正在积极地分析原因,以期能够尽快获得tet-On系统调控融合基因BCR-ABL表达的转基因小鼠模型。

关键词：慢性髓细胞白血病转基因小鼠 tet-on诱导表达系统 BCR-ABL融合基因聚合酶链反应(PCR)

来源：评论

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tet-On系统诱导表达c-myc转基因小鼠及肿瘤模型的建立

Tet-On系统诱导表达c-myc转基因小鼠及肿瘤模型的建立

引用

作者：吴红扬州大学

学位级别：博士

tet-Off/tet-On系统是一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系,它是用大肠杆菌Tn10转座子中四环素操纵子原理来实施调控的。tet-Off/tet-On系统是比较成熟的真核生物外源基因诱导表达系统之一,具有高效、... 详细信息

tet-Off/tet-On系统是一种利用原核调控元件在真核细胞中定量并特异地控制外源基因表达的体系,它是用大肠杆菌Tn10转座子中四环素操纵子原理来实施调控的。tet-Off/tet-On系统是比较成熟的真核生物外源基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、开/关较严密等特点,已被成功地应用于细胞和转基因小鼠基因诱导表达的研究。c-myc是一种原癌基因,它是禽类骨髓瘤病毒v-myc的细胞同源序列,其编码的蛋白是核内特异性DNA结合蛋白。c-myc加速了G1-S细胞周期进程,从而促进细胞增殖,形成肿瘤;还刺激细胞凋亡,c-myc是一个B细胞凋亡和啮齿类动物体内胰岛分泌减少的强有力的引发者。本研究首先应用RT-PCR技术,从人的宫颈癌细胞中成功扩增出预期大小为1.32Kb的c-myc cDNA的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pTZ57R/T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该基因的克隆pTZ57R/T-c-myc。测序后将c-myc基因亚克隆入tet-On系统的pTRE2载体中,获得pTRE2-c-myc重组载体。为了便于转基因细胞的筛选,我们将pCEP4上的Hyg酶切补平后克隆到同样酶切补平的pTRE2-c-myc载体,获得pTRE2-c-myc-Hyg。用ptet-On质粒转染CHO细胞,通过G418筛选获得表达tet-On系统调节元件rtTA的阳性细胞CHO-ptet-On,经过有限稀释法获得16个转ptet-On基因的细胞单克隆。RT-PCR检测rtTA的表达后,将pTRE2-c-myc-Hyg基因转染能稳定表达rtTA的单克隆细胞,潮霉素筛选获得能诱导表达c-myc基因的CHO-ptet-On-pTRE2-c-myc-Hyg细胞,通过细胞亚克隆后得到转ptet-On-pTRE2-c-myc-Hyg基因细胞的单克隆15个。强力霉素(DOX)诱导转基因细胞后,RT-PCR、间接免疫荧光检测到c-myc的表达。Western Blot检测到com-myc基因

关键词： tet-on诱导表达系统 c-myc 转基因成神经管细胞瘤胰岛细胞瘤

来源：评论

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