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聚乳酸纳米粒介导decoy片段调控大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达的体外研究

中华血液学杂志 2005年第9期26卷 534-538页

作者：胡豫王华芳孙望强谢长生魏文宁郑金娥姚军霞华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所武汉430022 华中科技大学材料技术与工程学院

目的探讨由聚乳酸纳米粒包裹的核因子(NF)-κΒdecoy寡核苷酸片段对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达活性的调控功能。方法以聚乳酸为材料,纳米沉积法制备载荧光标记NF-κΒdecoy-纳米粒混悬液,检测其物理表征、包封率和体... 详细信息

目的探讨由聚乳酸纳米粒包裹的核因子(NF)-κΒdecoy寡核苷酸片段对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达活性的调控功能。方法以聚乳酸为材料,纳米沉积法制备载荧光标记NF-κΒdecoy-纳米粒混悬液,检测其物理表征、包封率和体外释放情况。共聚焦显微镜和流式细胞术观察和检测培养的脑微血管内皮细胞摄取decoy-纳米粒的效率和细胞内分布,运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot技术分别比较摄取纳米粒的细胞在脂多糖(LPS)刺激下TFmRNA和P65表达的变化。结果制备的decoy-纳米粒平均粒径为162.1nm,多分散指数为0.118,体外释放实验显示经28d其总释放率达92.3%,流式细胞术检测到细胞对decoy-纳米粒摄取随浓度和作用时间的增加而增加,被摄取的decoy-纳米粒位于细胞胞浆内,RT-PCR结果提示经纳米粒包载的NF-κΒdecoy具有生物活性,可以显著抑制LPS作用下脑微血管内皮细胞的TF表达水平,Western blot结果显示核提取物中P65的表达显著降低。结论聚乳酸纳米粒能将NF-κΒdecoy寡核苷酸片段递送至细胞内,且能保持生物活性,该方法为脑血栓病基因治疗提供了依据。

关键词：聚乳酸纳米粒 decoy寡核苷酸片段核冈子κB 脑微血管内皮细胞组织因子血管内皮细胞组织因子 decoy寡核苷酸大鼠脑体外研究片段

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聚乳酸纳米粒介导decoy策略调控脑血管内皮细胞组织因子活性的研究

聚乳酸纳米粒介导decoy策略调控脑血管内皮细胞组织因子活性的研究

引用

作者：王华芳华中科技大学

学位级别：博士

脑血栓形成发生机制复杂，一直缺乏切实有效的防治方法。本研究运用近年来兴起的纳米技术，将干预基因片段定向导入脑血管内皮细胞，运用抑制组织因子的基因疗法探索防治脑血栓形成的新途径；研究中运用细胞生物学及分子生物学技术检测... 详细信息

脑血栓形成发生机制复杂，一直缺乏切实有效的防治方法。本研究运用近年来兴起的纳米技术，将干预基因片段定向导入脑血管内皮细胞，运用抑制组织因子的基因疗法探索防治脑血栓形成的新途径；研究中运用细胞生物学及分子生物学技术检测脑血栓疾病中血管内皮细胞表面组织因子表达及活性变化，明确其在脑血栓形成中的作用；进而应用decoy策略从转录水平研究组织因子活性的调控因素及机理；以聚乳酸为材料，通过表面修饰等方法，研制具有脑血管内皮细胞靶向性的纳米粒，以纳米粒为载体，将decoy寡核苷酸片段定向导入脑血管内皮细胞，通过干预组织因子活性实现对脑血栓形成的早期预防和治疗，为脑血管疾病的基因治疗从实验室迈向临床提供有力的基础。第一部分脑微血管内皮细胞组织因子的表达及调控机制研究目的：研究大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)中核因子κB(NF-κB)在组织因子(TF)表达调控中的作用；方法：分离、培养大鼠BMECs，分别经LPS、TNF-α刺激0、1h、2h、4h、8h、16h不同时间后，运用流式细胞术检测BMECs胞膜表面TF表达量的变化，RT-PCR检测TFmRNA表达水平的变化，WesternBlot检测刺激因子对细胞核内活化的NF-κB组份P65含量的影响；并观察NF-κB的特异性抑制剂PDTC对BMECs中TFmRNA表达水平的影响作用；结果：TF在BMECs细胞中的表达同刺激因子作用呈现时间依赖关系，10μg/mlLPS或100ng/mlTNF-α刺激1～2h时TFmRNA水平达到峰值，核内P65含量相应显著增高；经100μmol/LPDTC预处理的BMECs在刺激因子诱导下，TF表达水平不升高；结论：BMECs在受到炎症因子、细菌内毒素刺激时TF表达增高，NF-κB活化在LPS或TNF-α诱导的BMECsTF表达的转录调控中有重要作用。第二部分脑血管内皮细胞靶向性纳米粒载体的研制目的：制备聚乳酸(polylacticacid，PLA)纳米粒，研究该纳米载体在小鼠各脏器组织中的分布特征，探讨其对鼠脑组织的靶向性；方法：纳米沉积法制备空白及经聚山梨醇-80(T-80)表面修饰的PLA纳粒，原子力显微镜观测微观形貌、粒径，zeta电位/粒度分析仪分别测定粒度分布范围和zeta电位值；MTT比色法评价纳米粒的细胞毒性；荧光分光光度计检测并比较不同表面特性的PLA纳米粒在小鼠各脏器组织的分布，巨噬细胞吞噬实验评价T-80表面修饰对于PLA纳米粒逃避单核—巨噬系统吞噬的作用；透射电镜观察脑组织中纳米粒的分布区域，分析电镜对脑血管内皮细胞中叶绿素铜标记的纳米粒进行鉴定；结果：所制PLA纳粒为规整、均匀的球形颗粒，其等效粒径为162.1nm，多分散系数为0.108；T-80修饰的聚乳酸纳米粒能特异性地分布于小鼠脑组织，透射电镜及分析电镜证实脑微血管内皮细胞中有纳米粒的聚集；结论：T-80表面修饰的PLA纳米粒能较特异性地被鼠脑血管内皮细胞摄取，该载体可能成为选择性作用于脑血管内皮细胞的优良给药载体。第三部分载NF-κBdecoy聚乳酸纳米粒对脑微血管内皮细胞TF表达调控的体外研究目的：探讨由PLA纳米粒包裹的NF-κBdecoy寡核苷酸片段对体外培养的大鼠脑BMECs组织因子表达活性的调控功能；方法：制备包裹荧光标记NF-κBdecoy的纳米粒混悬液，检测其物理表征、包封率和体外释放情况。共聚焦显微镜和流式细胞术观察和检测培养的BMECs摄取载decoy-纳米粒的效率和细胞内分布，运用RT-PCR及Westernblot技术比较摄取纳米粒的细胞在LPS刺激下TFmRNA和胞核内P65表达丰度的变化；结果：制备的decoy-纳米粒平均粒径为302nm，多分散系数为0.036，体外释放实验显示经28天其总释放率达92.3％，流式细胞仪检测到BMECs对decoy-纳米粒平均摄取率达到(90.4±5.26)％，被摄取的decoy-纳米粒位于细胞胞浆内，RT-PCR结果提示经纳米粒包载的NF-κBdecoy具有生物活性，可以显著抑制LPS作用下脑微血管内皮细胞的TF表达水平，蛋白印迹结果显示核提取物中P65的丰度显著降低；结论：聚乳酸纳米粒能将NF-κBdecoy寡核苷酸片段递送至细胞内，且能保持生物活性，该方法为脑血栓病基因治疗的可能性提供了依据。第四部分载NF-κBdecoy聚乳酸纳米粒在脑微血栓形成动物模型中作用的研究目的：探讨由PLA纳米粒包裹的NF-κBdecoy寡核苷酸片段对大鼠脑皮质微血栓形成模型局部TF表达的调控作用；方法：光化学诱导法建立大鼠脑皮质微血栓形成模型，静

关键词：脑微血管内皮细胞组织因子 NF-κB 转录聚乳酸纳米微粒聚乳酸纳米粒 decoy寡核苷酸片段核因子κB 光化学诱导法原位杂交

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