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第四届人畜共患病学术研讨会、2014年中国狂犬病年会、中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会

作者：刘凯孟丽军张亮黄小波文心田曹三杰四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心四川雅安 625014 四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心四川雅安 625014 四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室四川成都 611130 四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心四川雅安 625014 四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室四川成都 611130 农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测实验站四川雅安 6

本研究构建了日本乙型脑炎病毒(JEV)PrM ΔE基因与人组织纤溶酶原激活剂(tpa)信号肽序列融合表达真核质粒pVAX-tpa-PrM ΔE,并对构建的DNA疫苗进行了初步免疫试验研究。采用RT-PCR方法和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrM ΔE... 详细信息

关键词：日本乙型脑炎病毒 PrM ΔE基因 tpa信号肽序列 DNA疫苗免疫原性

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日本乙型脑炎病毒Pr MΔE与tpa信号肽融合基因DNA疫苗的研究

日本乙型脑炎病毒Pr MΔE与tPA信号肽融合基因DNA疫苗的研究

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第四届全国人畜共患病学术研讨会 2014年中国狂犬病年会中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会

作者：刘凯孟丽军张亮黄小波文心田曹三杰四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测实验站

本研究构建了日本乙型脑炎病毒(JEV)PrMΔE基因与人组织纤溶酶原激活剂(tpa)信号肽序列融合表达真核质粒pVAX-tpa-PrMΔE,并对构建的DNA疫苗进行了初步免疫试验研究。采用RT-PCR方法和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因... 详细信息

本研究构建了日本乙型脑炎病毒(JEV)PrMΔE基因与人组织纤溶酶原激活剂(tpa)信号肽序列融合表达真核质粒pVAX-tpa-PrMΔE,并对构建的DNA疫苗进行了初步免疫试验研究。采用RT-PCR方法和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因和tpa信号肽序列,并分别将其克隆至pMD 19-T载体,经鉴定正确后亚克隆至真核表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX-tpa-PrMΔE,对构建的重组质粒经鉴定正确后转染COS-7细胞,并利用间接免疫荧光试验检测质粒在细胞中的瞬时表达情况,同时利用制备的质粒免疫昆明小鼠,检测其JEV特异性血清IgG抗体水平、促脾淋巴细胞增长率,并以JEV CZ1株进行小鼠模型下的攻毒保护试验,进行DNA疫苗的攻毒保护率研究。结果显示,以RT-PCR方法和重叠PCR方法分别成功扩增出目的片段,通过对构建的重组质粒进行质粒PCR、酶切及测序鉴定,表明真核表达质粒pVAX-tpa-PrMΔE构建成功;间接免疫荧光试验结果显示重组质粒pVAX-tpa-PrMΔE在COS-7细胞中的表达产物可与鼠抗日本乙型脑炎病毒单克隆抗体发生特异性反应,显示出较好的反应原性;JEV特异性血清IgG结果显示,tpa信号肽序列的加入能明显增强PrMΔE基因DNA疫苗的特异性血清Ig G水平,且在42d后差异极显著(p<0.01);小鼠脾T淋巴细胞特异性增殖试验结果显示p VAX-tpa-PrMΔE组与空质粒对照组相、空白对照组相比差异极显著(p<0.01);攻毒试验结果显示本研究构建的重组DNA疫苗具有较好的攻毒保护率,能强有力的抵抗强毒株CZ-1的攻击。本研究成功构建了日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因与tpa信号肽序列融合基因DNA疫苗(pVAX-tpa-PrMΔE),为日本乙型脑炎病毒基因工程疫苗的进一步研究及应用奠定了基础。

关键词：日本乙型脑炎病毒 PrMΔE基因 tpa信号肽序列 DNA疫苗免疫原性

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日本乙型脑炎病毒PrMΔE与tpa信号肽融合基因DNA疫苗的研究

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中国兽医科学 2013年第4期43卷 351-357页

作者：刘凯孟丽军张亮黄小波文心田曹三杰四川农业大学预防兽医研究所猪病研究中心四川雅安625014 四川农业大学动物医学院人兽共患病研究室四川成都611130 农业部兽用药物与兽医生物技术四川科学观测试验站四川雅安625014

采用RT-PCR和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因和tpa信号肽序列,并将其插入载体pVAX1,将纯化后的重组质粒转染COS-7细胞,用间接免疫荧光法检测质粒在细胞中的瞬时表达情况,并用制备的质粒免疫昆明小鼠,检测其特异性血清... 详细信息

采用RT-PCR和重叠PCR方法分别扩增出日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因和tpa信号肽序列,并将其插入载体pVAX1,将纯化后的重组质粒转染COS-7细胞,用间接免疫荧光法检测质粒在细胞中的瞬时表达情况,并用制备的质粒免疫昆明小鼠,检测其特异性血清IgG抗体水平、促脾淋巴细胞增长率及攻毒保护率。结果显示,真核表达质粒pVAX-tpa-PrMΔE构建成功;间接免疫荧光试验显示,该质粒在COS-7细胞中的表达产物可与鼠抗日本乙型脑炎病毒单克隆抗体发生特异性反应,tpa信号肽序列能明显增强PrMΔE基因DNA疫苗的免疫原性,显著提高小鼠的体液免疫和细胞免疫水平,能强有力地抵抗强毒株CZ-1的攻击。结果表明,成功构建了日本乙型脑炎病毒PrMΔE基因与tpa信号肽序列融合基因DNA疫苗(pVAX-tpa-PrMΔE),为日本乙型脑炎病毒基因工程疫苗的进一步研究及应用奠定了基础。

关键词：日本乙型脑炎病毒 PrMΔE基因 tpa信号肽序列 DNA疫苗免疫原性

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猪乙型脑炎病毒DNA疫苗载体的构建及其免疫原性研究

猪乙型脑炎病毒DNA疫苗载体的构建及其免疫原性研究

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作者：孟丽军四川农业大学

学位级别：硕士

乙型脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种人畜共患虫媒性传染病。猪是该病毒在自然界最重要的贮存和增殖宿主,免疫接种疫苗是有效防制该病传播的重要方法。DNA疫苗是近年来JE预防的重要研究方向。本研究所构建的DNA疫苗以JEV的prM... 详细信息

乙型脑炎(JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种人畜共患虫媒性传染病。猪是该病毒在自然界最重要的贮存和增殖宿主,免疫接种疫苗是有效防制该病传播的重要方法。DNA疫苗是近年来JE预防的重要研究方向。本研究所构建的DNA疫苗以JEV的prM△E(prM基因以及编码E蛋白的N端的398个氨基酸序列的基因,即prM-E基因去掉E基因的膜锚定蛋白序列)为靶基因,融入了组织纤溶酶原激活物(tpa)的分泌型信号序列(signal sequence derived from tissue plasminogen activator)修饰目的基因prMAE,本研究还对此JEV DNA疫苗的免疫原性进行了研究,主要研究内容如下： 1. PVAX-prMAE和PVAX-tpa-prMAE真核表达质粒的构建采用RT-PCR扩增SA14-14-2株prM△E基因,将其插入pMD19-T载体,构建重组质粒19T-PrM△E。对19T-prM△E的核苷酸序列测定与分析表明：克隆的prM△E基因长度为1695 bp,可编码565个氨基酸残基。采用重叠PCR的方法扩增tpa信号肽序列,设计并合成两条互补的引物进行扩增,将其插入pMD19-T载体,构建重组质粒19T-tpa。对19T-tpa的核苷酸序列测定与分析表明：克隆的tpa信号肽序列全长69 bp,可编码23个氨基酸残基。研究以PVAX1为载体,构建了真核表达质粒PVAX-prM△E和PVAX-tpa-prM△E。对所构建质粒进行酶切、PCR和测序鉴定正确后,以脂质体转染法将构建的PVAX-tpa-prM△E和PVAX-prM△E真核表达质粒分别转染COS-7细胞,并以间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达。结果显示,转染的COS-7细胞呈现特异性荧光。表明上述构建的两种重组质粒可在体外正确表达,且表达的蛋白具有良好的免疫反应原性,PVAX-tpa-prM△E的蛋白表达量要明显大于PVAX-prM△E,说明tpa信号肽序列有效促进了目的蛋白的分泌表达。PVAX-tpa-prM△E和PVAX-prM△E表达载体的成功构建为JEV DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。 ***疫苗(PVAX-tpa-prM△E)的免疫原性研究分别将DNA疫苗PVAX-tpa-prM△E、PVAX-prM△E通过腿部肌肉注射6周龄昆明小鼠,间隔两周加强免疫一次,共免疫3次。分别在首疫后的14、35与42d通过间接ELISA测定免疫小鼠血清特异性JEV IgG抗体水平。结果表明：各免疫组均可有效诱导特异性JEV血清IgG抗体的产生,显示了JEV DNA疫苗良好的免疫原性。同时,PVAX-tpa-prMAE免疫组抗体水平在整个免疫过程中高于PVAX-prMAE免疫组,在免疫后42天差异极显著(P<0.01)。MTT法检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况,结果显示,PVAX-tpa-prMAE组小鼠特异性T淋巴细胞增殖SI值大大提高,出现可明显促进特异性淋巴细胞的增殖。因此将tpa信号肽序列融入质粒中是提高DNA疫苗免疫活性的有效途径。对三次加强免疫后的小鼠进行野毒株CZ-1脑内攻毒保护试验，观察小鼠的精神状态,记录小鼠的死亡情况,结果表明：PVAX-tpa-prMAE和PVAX-prMAE对小鼠均有较强的保护作用,分别为70%和50%,说明PVAX-tpa-prMAE疫苗比PVAX-prMAE疫苗对小鼠有更好的保护效果。

关键词：乙型脑炎病毒 prMΔE基因 DNA疫苗 tpa信号肽序列

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