[研究背景]链格孢霉引起的过敏性哮喘患病率逐年增加。利用链格孢霉粗提物行皮下特异性免疫治疗(subcutaneous allergen-specific immunotherapy,SCIT)是现阶段唯一能改变该疾病自然进程并取得长期疗效的治疗手段,但迄今为止,国际上对链格孢霉免疫治疗的疗效研究相对少见,且粗提物存在未标准化和安全性欠佳等缺点。在寻求新型免疫治疗制剂过程中,Alta1作为链格孢霉的主要致敏组分,其重组蛋白因易获得和质量稳定等特点,已在临床上被广泛应用于链格孢霉引起的过敏性疾病的分子诊断,而关于重组Alta 1(recombinant Alta 1,rAlta 1)在免疫治疗中的应用和疗效,至今未见报道。当前,免疫治疗的调控机制仍不明确。滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cells,Tfh)是近些年被认为调控过敏性疾病中免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)的生成和参与免疫治疗应答过程的新型T细胞亚群。调节性B细胞(regulatory B cells,Breg)和其产生的白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)作为负性调控介质,介导接受免疫治疗的机体产生免疫耐受。Tfh与Breg细胞是否参与链格孢霉和rAlt a 1的免疫治疗过程并受到影响,值得探索。T2型炎症是新近提出的一种哮喘内型,可分为T2-high和T2-low。已有研究证实真菌微生物群在T2型哮喘中表达的多样性,至于链格孢霉哮喘患者T2型炎症的临床特征如何,目前也无相关研究。因此,本研究拟着重评估链格孢霉和rAlt a 1的免疫治疗效果,探索Tfh与Breg细胞在免疫治疗中表达量的变化,同时分析链格孢霉哮喘患者内型的临床特征,旨在为此类患者的精准治疗提供依据。[研究目的]1.分析并评价链格孢霉过敏性哮喘患者接受SCIT的治疗效果。2.记录Tfh细胞和其亚型、Breg细胞在链格孢霉粗提物SCIT后的变化。3.明确粗提物SCIT后Tfh细胞和其亚型、Breg细胞与临床相关指标的相关性。4.探索纯化的rAlt a 1在哮喘小鼠模型中的有效治疗浓度,全面评估免疫治疗效果。5.明晰rAlt a 1免疫治疗后小鼠体内Tfh和Breg细胞表达量变化的情况。6.阐明有效浓度的rAlt a 1进行免疫治疗后,细胞因子相关的Tfh细胞和IL-10+Breg细胞的变化。7.分析链格孢霉哮喘患者T2-high和T2-low两种内型的临床特征。[研究方法]1.问卷、免疫学指标和肺功能评估接受链格孢霉SCIT患者的治疗效果。2.多因子检测技术分析血清中多种细胞因子的表达水平。3.流式细胞术检测外周血中循环Tfh细胞(circulating Tfh,cTfh)及其亚型、Breg细胞比例的变化。4.相关性分析明确粗提物SCIT后cTfh细胞和其亚型、Breg细胞与临床相关指标的相关性。5.合成并纯化rAlt a 1,验证纯度和免疫原性。6.构建皮下注射免疫治疗小鼠模型,设立rAlt a 1治疗浓度梯度:5μg、50μg、100 μg和 150 μg。7.通过评估肺组织炎症和气道阻力、检测支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)上清中细胞因子浓度、血清中免疫球蛋白和肥大细胞蛋白酶水平(mast cell protein-1,MCP-1)进行rAlt a 1治疗效果探索。8.流式细胞术检测不同浓度rAlt a 1治疗后小鼠脾脏中Tfh和Breg细胞的变化。9.纯化天然的Alt a 1(nature Alt a 1,nAlt a 1),构建以nAlt a 1和链格孢霉粗提物为对照组,有效治疗浓度rAlt a 1为实验组的免疫治疗小鼠模型,对比治疗效果。10.免疫组化二步法检测小鼠脾脏中B细胞淋巴瘤转录因子(transcriptionfactor B cell lymphoma 6,Bcl-6)的表达定位和强度。11.流式细胞术再次全面分析小鼠脾脏和淋巴结中IL-4+Tfh、IL-5+Tfh、IL-13+Tfh和IL-17A+Tfh细胞以及脾脏中IL-10+Breg细胞的表达情况。12.回顾性分析582例链格孢霉患者在T2-high和T2-low两种内型中年龄、性别、家族史、吸入激素情况、接受免疫治疗情况、宠物暴露史和T-IgE的差异。[研究结果]1.接受链格孢霉SCIT的患者症状和用药评分改善,肺功能第一秒用力呼气容积预计值(forced expiratory volume in the first second,FEV1%)提升。2.链格孢霉SCIT患者的血清中IgE和嗜酸性粒细胞表达水平可降低,但无统计学差异。3.血清中IL-4、IL-21、IL-5、IL-13和IL-17A的
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