检索结果-内蒙古大学图书馆

医学分子生物学杂志 2015年第4期12卷 187-191页

作者：张丽萍高越檀硕张敬之上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室、上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

目的研究慢病毒在感染细胞后，是否全部整合入染色体。方法用慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后．抽提培养2d和10d的细胞基因组DNA。通过定量PCR检测细胞基因组中LTR拷贝数，计算出整合率。分别取病毒感染3d和11d的细胞，离心重悬后取... 详细信息

目的研究慢病毒在感染细胞后，是否全部整合入染色体。方法用慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后．抽提培养2d和10d的细胞基因组DNA。通过定量PCR检测细胞基因组中LTR拷贝数，计算出整合率。分别取病毒感染3d和11d的细胞，离心重悬后取部分细胞放在荧光显微镜下拍照，在蛋白水平上验证此结论。结果①慢病毒载体在宿主细胞基因组内的平均整合率（47±16）％（n=10）；②细胞感染慢病毒后3d和11d的GFP照片也证实了慢病毒在宿主细胞基因组内部分整合。结论慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后，仅有部分的载体骨架是整合人基因组中的，整合入293T细胞基因组中的外源基因能够较长时间稳定表达。

关键词：慢病毒载体基因治疗转染整合

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Tet2与K562细胞中γ-globin激活表达之间的关系研究

Tet2与K562细胞中γ-globin激活表达之间的关系研究

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：路兆宁马晴雯曾凡一上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学医学院基础医学院卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:探讨羟甲基化酶Tet2(member of ten-eleven translocation family)在药物诱导K562细胞中γ-globin激活表达这一过程中发挥的作用以及可能的作用机制。方法:在K562细胞中转染shRNA表达质粒以下调Tet2的表达,同时在培养液中加氯化高... 详细信息

目的:探讨羟甲基化酶Tet2(member of ten-eleven translocation family)在药物诱导K562细胞中γ-globin激活表达这一过程中发挥的作用以及可能的作用机制。方法:在K562细胞中转染shRNA表达质粒以下调Tet2的表达,同时在培养液中加氯化高铁血红素(Hemin)或5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导K562细胞大量表达γ-globin。用氧化亚硫酸氢盐(oxidative bisulfite)将K562细胞基因组DNA处理后,PCR扩增γ-globin gene body上CpG位点相对密集区域,连接到T-vector克隆,测序后统计该区域甲基化和羟甲基化DNA所占的比例。以realtime PCR的方法检测这一过程中相关红系特异性转录因子与Tet2的表达量。结果:在γ-globin激活表达的过程中Tet2本身的表达量无显著性差异,但Tet2下调会抑制抑制药物诱导γ-globin激活的效率。γ-globin gene body上CpG位点的甲基化/羟甲基化修饰率几乎为0。关键红系转录因子GATA1和NFE4都随着Tet2的下调而下调,KLF1随着Tet2的下调反而有所上调。结论:Tet2在K562细胞γ-globin激活表达的过程中发挥作用,且相比其直接催化γ-globin DNA羟甲基化的功能而言,其作用的途径更有可能是调节转录因子的表达或与DNA的结合。

关键词：羟甲基化 globin

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表观遗传修饰改变与线粒体疾病

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医学分子生物学杂志 2015年第1期12卷 30-34页

作者：危新俊颜景斌上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学附属儿童医院上海市200040 温州医科大学检验医学院、生命科学学院浙江省温州市325035 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

线粒体功能失调是导致线粒体疾病的主要原因，因此了解线粒体功能的调节机制非常重要。近期的研究表明，表观遗传修饰的对象不仅包括细胞核DNA还包括线粒体DNA，表观遗传修饰的变化对线粒体功能的调节机制有重要影响。文章主要概括了线... 详细信息

线粒体功能失调是导致线粒体疾病的主要原因，因此了解线粒体功能的调节机制非常重要。近期的研究表明，表观遗传修饰的对象不仅包括细胞核DNA还包括线粒体DNA，表观遗传修饰的变化对线粒体功能的调节机制有重要影响。文章主要概括了线粒体DNA甲基化、细胞核基因组的DNA甲基化和微RNA（microRNA，miRNA）调控等表观遗传修饰与线粒体疾病发生的关联研究进展。

关键词：线粒体疾病表观遗传学 DNA甲基化线粒体DNA甲基化 miRNA

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乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

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中国生物工程杂志 2014年第7期34卷 49-55页

作者：张斯敏高越方彧聃张金脉张敬之上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室及上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现... 详细信息

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。

关键词：乳腺生物反应器 Cre loxP系统特异表达报告基因lacZ

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哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存研究进展：现存问题与未来展望

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中国科学：生命科学 2014年第7期44卷 663-675页

作者： MOUSSA Mahmoud 舒娟张雪洪曾凡一上海交通大学附属儿童医院、上海市儿童医院、上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海交通大学生命科学技术学院、生物工程系上海200240 上海市胚胎与生殖工程重点实验室、卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海200040 上海滔滔转基因工程股份有限公司上海201604 Department of Theriogenology Faculty of Veterinary Medicine Suez Canal University Ismallia 41522 Egypt 上海交通大学医学院、医学科学研究院发育生物学研究室上海200025

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据... 详细信息

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据,并成为体外受精不可缺少的环节.尽管哺乳动物卵母细胞和胚胎的冷冻保存技术的研发和应用取得了巨大进展,例如为可能不育的患者贮藏生殖潜能、卵子冻存库的建立以及卵母细胞和胚胎的跨国运输,但成功率仍达不到使用新鲜卵母细胞和胚胎的水平,还存在许多难题有待解决.本文针对低温保存技术中制约冷冻效率和成功率的主要问题进行了综述,旨在解决技术研发中遇到的瓶颈,为改进技术提供借鉴和参考,鼓励低温生物学研究者继续开展深入研究,加快推进冷冻保存技术在人类和动物辅助生殖技术中的实际应用.

关键词：冷冻保存哺乳动物卵母细胞胚胎问题

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临床基因治疗及其载体的研究进展

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国际遗传学杂志 2014年第1期37卷 29-36页

作者：高越张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室

自1989实施年第一例临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定... 详细信息

自1989实施年第一例临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定表达系统。目前基因治疗常使用病毒和非病毒载体,其中,病毒载体在临床基因治疗过程中得到更广泛地使用。文中总结了一些重要的临床基因治疗的病例,并对其相应的基因导入系统作一综述。

关键词：临床实验基因治疗病毒载体非病毒载体

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位点特异整合型微环DNA的构建及应用

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中国医药生物技术 2014年第1期9卷 13-19页

作者：刘浏周在威马晴雯上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所 200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后... 详细信息

目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后插入ΦC31整合酶基因表达盒,构建可获得微环DNA的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL和λattR序列可在LR克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及attB位点的微环DNA。以限制性内切酶酶切、定性以及定量PCR分析其重组效率。并将未经纯化的LR重组体系转染HeLa细胞,以流式细胞技术、克隆计数、ELISA等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平,并与传统质粒进行比较。结果 LR克隆酶可有效催化亲本质粒的重组,重组率达80%以上。重组体系中的微环DNA和微质粒无需纯化即可成功转染HeLa细胞,且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒。结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA的方法。

关键词：微环DNA LR克隆酶 Ф31整合酶位点特异性整合

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利用自裂解多肽T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因共同表达

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生物技术通讯 2014年第3期25卷 361-364页

作者：张俨马晴雯上海交通大学医学院上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细... 详细信息

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细胞,以FACS检测GFP基因的表达,RT-qPCR检测GFP、T2A和Neo的表达。结果:由T2A连接的GFP和Neo基因在mRNA水平上都有显著表达,且表达水平相当。结论:以T2A连接的基因在转入细胞后能正常翻译和表达,显示T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能,可作为一种构建多顺反子载体的有效工具用于牛耳皮肤成纤维细胞的基因转移,为其将来在转基因牛研制中的应用奠定了基础。

关键词：多顺反子载体自裂解多肽T2A 牛耳皮肤成纤维细胞

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慢病毒载体转录通读率检测方法的建立

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生物工程学报 2013年第7期29卷 1006-1015页

作者：何佳平方彧聃张帆孙凤强王娟张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方... 详细信息

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法。文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物。两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率。说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持。

关键词：慢病毒载体自灭活慢病毒载体转录通读率安全性

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稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

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生命科学研究 2013年第2期17卷 100-105页

作者：方彧聃何佳平张斯敏王娟任晓叶张金脉张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所中国上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室中国上海200040

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基... 详细信息

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.

关键词： HC11细胞系催乳素慢病毒载体乳腺特异性基因乳腺生物反应器

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