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组织工程与重建外科杂志 2016年第6期12卷 331-334页

作者：王祥盛王贤松张智勇周广东刘伟曹谊林张文杰上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011 组织工程国家工程中心上海市200240

目的探讨金纳米团簇用于示踪可降解高分子支架的可行性,为非侵入成像方式监测体内组织工程支架降解提供方法和思路。方法用氯金酸和牛血清白蛋白(BSA)为原料合成金纳米团簇(Au Nanoclusters,Au NCs),进行相关表征及细胞毒性检测。以Au ... 详细信息

目的探讨金纳米团簇用于示踪可降解高分子支架的可行性,为非侵入成像方式监测体内组织工程支架降解提供方法和思路。方法用氯金酸和牛血清白蛋白(BSA)为原料合成金纳米团簇(Au Nanoclusters,Au NCs),进行相关表征及细胞毒性检测。以Au NCs标记聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA),制备Au NCs/PLGA支架,扫描电镜检测支架表面结构,荧光及CT扫描检测支架特性。将支架植入裸鼠皮下,应用荧光成像及Micro-CT扫描,以观测支架在体内的情况。结果合成的Au NCs具有荧光特性,无细胞毒性;纳米团簇标记的PLGA支架保持荧光特性,同时在CT扫描中可显影;Au NCs/PLGA支架可以在裸鼠皮下通过荧光成像及Micro-CT扫描来示踪。结论 Au NCs可作为组织工程支架的示踪剂,为非侵入成像方式监测体内高分子组织工程支架降解情况提供可能。

关键词：金纳米团簇支架材料非侵入成像

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软骨再生技术研究进展及其临床应用转化

软骨再生技术研究进展及其临床应用转化

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第十五届上海地区医用生物材料学术研讨会

作者：周广东曹谊林上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科上海市组织工程研究重点实验室组织工程国家工程研究中心

种子细胞来源不足、支架材料体内炎症反应、体外再生软骨力学强度不足、形态难以精确控制等难题一直是限制软骨再生技术研究与应用的瓶颈问题,也是人耳形态软骨一直未能从裸鼠背上转化为临床应用的核心问题.课题组经过十几年的研究,成... 详细信息

种子细胞来源不足、支架材料体内炎症反应、体外再生软骨力学强度不足、形态难以精确控制等难题一直是限制软骨再生技术研究与应用的瓶颈问题,也是人耳形态软骨一直未能从裸鼠背上转化为临床应用的核心问题.课题组经过十几年的研究,成功地建立了:1)软骨再生种子细胞(包括干细胞与软骨细胞)大规模扩增技术;2)体外软骨再生核心技术,包括再生软骨形态(耳、鼻、气管、半月板等)的精确控制技术;3)大动物各类软骨缺损(耳、气管、关节、半月板等)修复技术;4)软骨再生技术的安全性评价.在上述基础上,我们成功开展了组织工程耳、鼻、关节等多种软骨再生技术的临床应用,目前已获得了较好的临床效果,这些研究为软骨再生技术的进一步临床推广应用奠定了基础.

关键词：医用生物材料软骨再生技术种子细胞

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骨髓基质干细胞扩增体系研究

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组织工程与重建外科杂志 2016年第3期12卷 152-155,159页

作者：王婷婷何爱娟刘豫曹谊林唐胜建周广东潍坊医学院整形外科研究所山东省潍坊市261042 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011 组织工程国家工程研究中心上海市200241

目的比较三种不同培养体系对人骨髓基质干细胞（hBMSCs）增殖能力、表面标志和分化潜能的影响,探索hBMSCs适合的培养体系。方法获取hBMSCs,分别用DMEM、DMEM＋碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和无动物组份的间充质干细胞培养基（Mesench... 详细信息

目的比较三种不同培养体系对人骨髓基质干细胞（hBMSCs）增殖能力、表面标志和分化潜能的影响,探索hBMSCs适合的培养体系。方法获取hBMSCs,分别用DMEM、DMEM＋碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和无动物组份的间充质干细胞培养基（Mesenchymal Stem Cell Medium-animal component free,MSCM-acf）进行培养,反复传代至第6代,分别计数每种培养体系每个代次的细胞得率。取第4~6代细胞,用流式细胞仪对细胞表面标志进行检测,同时对各组第6代细胞分别向成软骨、成脂和成骨方向进行诱导分化。结果培养至第2代后,MSCM-acf培养体系细胞得率显著大于其他两组;流式细胞分析结果表明,MSCM-acf培养体系表面阳性标志CD73、CD90和CD105均大于99%,总的阴性标志表达小于2%,优于其他两组,尤其是DMEM＋bFGF培养体系;三组均保留了多向分化潜能,添加bFGF的培养体系成软骨分化明显优于其他两组,MSCM-acf培养体系成脂和成骨分化优于其他两组。结论 MSCM-acf培养体系可以实现hBMSCs干性维持下的大量扩增,是hBMSCs较为理想的培养体系。

关键词：骨髓基质干细胞培养体系细胞表面标志分化潜能

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人骨髓间充质干细胞来源细胞外基质(ECM)对维持小鼠ASCs干性的实验研究

人骨髓间充质干细胞来源细胞外基质(ECM)对维持小鼠ASCs干性的实...

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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：熊尧何晶张文杰周广东曹谊林刘伟上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程重点实验室

间充质干细胞(MSCs)在体外培养扩增过程中,由于细胞在体内所处的微环境被剥夺,其干性容易丢失.而细胞外基质(ECM)在干细胞所处的微环境中对维持细胞干性起到重要的作用.有研究表明BMSCs来源的ECM可以维持BMSCs的干性.本研究旨在证明该BM...

间充质干细胞(MSCs)在体外培养扩增过程中,由于细胞在体内所处的微环境被剥夺,其干性容易丢失.而细胞外基质(ECM)在干细胞所处的微环境中对维持细胞干性起到重要的作用.有研究表明BMSCs来源的ECM可以维持BMSCs的干性.本研究旨在证明该BMSCs来源的ECM是否也能维持体外扩增的小鼠脂肪干细胞(ASCs)的干性.将小鼠ASCs分别在ECM铺层培养瓶(ECM组)和未铺的普通培养瓶(Plastic组)中培养至第2代和第4代,然后收集细胞进行检测.结果显示,随着不断传代,ECM组中的ASCs一一直呈现成纤维细胞样的长梭形细胞形态,而Plastic组中的细胞逐渐变得大而铺展;细胞传3代或5代后,当细胞在间充质干细胞培养液(MesenPRO RSTM Medium)中培养时,两组细胞显现出相似的细胞动力学特性.但是当细胞在含10％血清的DMEM培养液中培养时,第3代和第5代的ECM组细胞较Plastic组细胞显示出更强的增殖能力(p＜0.01).当细胞以低密度(500个/10-cm培养皿)培养时,ECM组细胞较Plastic组能形成更多且更大的克隆,且两组细胞形成克隆数有显著差异(p＜0.05);另外,经诱导后的ECM组较Plastic组细胞呈现出更强的成脂、成骨以及成软骨能力.定量分析示ECM组油红O染色面积、茜素红染色面积和甲苯胺蓝染色面积较Plastic组明显更大(p＜0.05),定量PCR也显示ECM组细胞PPARγ、 aP2、C/EBP、Rux2、osteocalcin、Sox9、collagenⅡ和aggrecan等基因表达较Plastic组明显更高(p＜0.05).这些结果表明,人BMSCs来源的ECM能有助于维持培养小鼠ASCs的干性.

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骨髓单个核细胞与骨髓间充质干细胞促进大鼠皮瓣存活率的比较

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组织工程与重建外科杂志 2015年第2期11卷 90-94页

作者：许鹏唐郑雅陆阳周广东刘伟曹谊林张文杰上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011 组织工程国家工程中心上海市200241

目的比较来源于等量骨髓的单个核细胞与经扩增的间充质干细胞,促进大鼠随意皮瓣成活率的效果。方法取等质等量的大鼠骨髓,一半直接离心获得骨髓单个核细胞,一半经体外培养获得骨髓间充质干细胞,注射相等数量(n=6)的大鼠随意皮瓣。术后... 详细信息

目的比较来源于等量骨髓的单个核细胞与经扩增的间充质干细胞,促进大鼠随意皮瓣成活率的效果。方法取等质等量的大鼠骨髓,一半直接离心获得骨髓单个核细胞,一半经体外培养获得骨髓间充质干细胞,注射相等数量(n=6)的大鼠随意皮瓣。术后测量并计算皮瓣成活面积,取材,行组织学检测,计数CD31阳性血管数量。结果未经培养的骨髓单个核细胞组皮瓣的平均存活率为(71.6±8.4)%,培养的骨髓间充质干细胞组平均存活率为(66.2±3.1)%,这两组存活率均显著高于注射平衡液的对照组(55.9±3.4)%;注射细胞组之间平均存活率没有统计学差异。组织学血管密度计数显示,骨髓单个核细胞组和骨髓间充质干细胞组的微血管数量分别是(58.2±6.8)和(42.7±5.1),都显著高于PBS对照组(22.8±3.1),而骨髓单个核细胞组也显著高于骨髓间充质干细胞组。结论与不经培养的骨髓单个核细胞相比,通过体外扩增的骨髓间充质细胞,未能显著提高大鼠随意皮瓣的成活率。

关键词：随意皮瓣细胞治疗骨髓单个核细胞骨髓间充质干细胞

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组织工程人耳廓形态软骨--从理论到临床

组织工程人耳廓形态软骨--从理论到临床

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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：曹谊林组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

先天性小耳畸形发病率较高(约1/3000)，传统手工雕刻肋软骨进行耳再造的方法具有供区损伤大，耳廓形态难以控制，医生经验依赖性强等缺点，是整形外科一大挑战.组织工程是解决上述问题的理想途径.然而，自97年笔者首次在裸鼠体内构建出...

先天性小耳畸形发病率较高(约1/3000)，传统手工雕刻肋软骨进行耳再造的方法具有供区损伤大，耳廓形态难以控制，医生经验依赖性强等缺点，是整形外科一大挑战.组织工程是解决上述问题的理想途径.然而，自97年笔者首次在裸鼠体内构建出组织工程入耳廓形态软骨后，该技术一直未用于临床，其主要难点在于：1.如何寻找适合临床应用的种子细胞？2.如何控制并维持复杂逼真的人耳廓形态？3.如何避免移植物在免疫健全动物体内引发炎症反应.针对上述问题，本团队经过近20年持续研究，实现了如下技术突破：1.发现人残耳软骨细胞具有极强的增殖能力，且通过生长因子联合诱导，可将大规模扩增后去分化的残耳软骨细胞重分化构建大体积软骨，解决了种子细胞来源问题;2.通过计算机辅助设计及成型(CAD&CAM)等数字化手段，实现了病人个性化耳廓形态精确设计;并在原有聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)耳支架基础上，引入力学性能强且降解缓慢的聚己内酯(PCL)内核，显著提高了构建产物力学性能，解决了耳廓形态的体内长期维持问题;3.通过体外构建，使PGA/PLA支架得以充分降解，且自体软骨基质得以充分包裹构建产物，解决了大量残留支架材料在免疫健全动物体内引发异物反应的问题.通过整合上述技术，目前已顺利开展了5例多中心临床试验，最长随访期已达8个月，再造耳形态逼真，弹性良好，组织学显示移植物已形成了成熟软骨样组织.上述研究在国际上首次实现了组织工程人耳廓形态软骨的临床转化，充分展示了组织工程理念的临床应用前景，对其他组织工程技术的临床转化具有重要指导意义及参考价值.

关键词：

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BMSC体外构建软骨修复大动物关节负重区骨软骨复合缺损

BMSC体外构建软骨修复大动物关节负重区骨软骨复合缺损

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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：何爱娟刘豫周广东曹谊林组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011 组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241

骨软骨复合缺损是关节外科常见难题,组织工程与再生医学技术为解决这一难题提供了理想治疗手段。前期研究已证实应用骨髓基质干细胞(BMSC)复合支架材料可实现骨软骨缺损修复,但由于细胞材料复合物所固有的细胞易流失、大量材料引发炎症...

骨软骨复合缺损是关节外科常见难题,组织工程与再生医学技术为解决这一难题提供了理想治疗手段。前期研究已证实应用骨髓基质干细胞(BMSC)复合支架材料可实现骨软骨缺损修复,但由于细胞材料复合物所固有的细胞易流失、大量材料引发炎症反应、力学性能不足、操作不便等缺陷,导致修复成功率不高,难以满足规模化临床转化要求。我们认为体外构建能够解决上述问题。然而BMSC体外构建的组织工程软骨能否同时修复大面积的软骨/骨复合缺损？体外构建多长时间回植最佳？上述问题文献鲜有报道。本研究应用BMSC体外构建2周,4周,8周的组织工程软骨修复猪膝关节负重区大面积的骨软骨复合缺损。实验结果表明体外构建2周的组织工程软骨以纤维修复为主,而4周、8周的组织工程软骨则能成功实现骨软骨复合缺损修复且界面愈合良好。然而不足的是4周和8周的修复成功率并没达到预期的效果,我们认为手术创伤大,术后难以开展良好的护理及科学合理的康复锻炼等都是影响手术修复效果的重要因素。本研究证实了BMSC体外构建软骨能修复大动物的骨软骨复合缺损,为组织工程软骨的临床应用转化提供了有效的理论依据。

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骨髓基质干细胞构建半月板用于犬自体半月板置换

骨髓基质干细胞构建半月板用于犬自体半月板置换

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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：李丹刘豫周广东曹谊林组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011 组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241

半月板损伤是临床常见疾病。由于半月板大部分区域为无血管区，损伤后愈合能力较差，所以临床上多采用半月板部分或全部切除术来进行治疗。然而，随着对半月板功能及切除术后并发症认识的不断深入，我们已经意识到尽可能修复和保留半月...

半月板损伤是临床常见疾病。由于半月板大部分区域为无血管区，损伤后愈合能力较差，所以临床上多采用半月板部分或全部切除术来进行治疗。然而，随着对半月板功能及切除术后并发症认识的不断深入，我们已经意识到尽可能修复和保留半月板的功能的重要性。近年来，组织工程技术的不断发展为半月板损伤的修复和再造开辟了新途径，但迄今为止，国内外研究大多针对修复大型哺乳动物半月板的局部缺损，只有少量的几篇文献报道了关于应用软骨细胞构建完整半月板进行置换。然而软骨存在增殖能力有限，体外大量扩增后易发生老化及去分化等缺点限制了其在临床上的应用。

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软骨微环境调控骨髓基质干细胞再生特定软骨

软骨微环境调控骨髓基质干细胞再生特定软骨

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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：王婷婷刘豫周广东曹谊林组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

背景人体内软骨分为弹性、纤维及透明软骨三种类型,其在细胞种类、组织结构、基质成分及力学性能等方面存在显著差异.组织工程技术能否应用干细胞再生特定类型软骨及其调控机制目前尚不明确.前期研究证实软骨微环境对干细胞软骨再生具...

背景人体内软骨分为弹性、纤维及透明软骨三种类型,其在细胞种类、组织结构、基质成分及力学性能等方面存在显著差异.组织工程技术能否应用干细胞再生特定类型软骨及其调控机制目前尚不明确.前期研究证实软骨微环境对干细胞软骨再生具有重要调控作用.然而,特定软骨微环境能否调控干细胞再生指定类型软骨、哪些因素参与了调控作用等系列问题目前仍不明确.方法本课题以羊为模型,将骨髓基质干细胞(BMSC)及其体外成软骨诱导6周后的构建产物分别在弹性软骨、纤维软骨、透明软骨及皮下环境中定向自体移植,6个月后取出,通过大体外观、组织学、特殊染色及生化定量等方法鉴定再生软骨质量及类型,阐明不同类型软骨微环境对BMSC及其构建产物再生软骨类型的影响.结果取材样本的关节软骨修复区覆盖致密的透明软骨样组织,初步证实软骨微环境对BMSCs再生软骨有一定的调控作用.BMSC在其他微环境中的实验结果还有待进一步分析.

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残耳软骨细胞体外构建人耳廓形态软骨

残耳软骨细胞体外构建人耳廓形态软骨

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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：刘豫何爱娟殷宗琦周广东曹谊林组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

目的自曹谊林教授97年在裸鼠体内构建出入耳廓形态软骨后,该技术至今一直未用于临床,其重要原因之一在于如何利用病人自体来源细胞构建组织工程人耳廓形态软骨。本课题拟探讨利用小耳症患者自体的残耳软骨细胞(MC)构建人耳廓形态软骨... 详细信息

目的自曹谊林教授97年在裸鼠体内构建出入耳廓形态软骨后,该技术至今一直未用于临床,其重要原因之一在于如何利用病人自体来源细胞构建组织工程人耳廓形态软骨。本课题拟探讨利用小耳症患者自体的残耳软骨细胞(MC)构建人耳廓形态软骨的可行性。方法为获得足够数量的耳廓构建用种子细胞,我们首先通过克隆形成率、增殖曲线及细胞得率,考察MC在不同扩增体系下的增殖情况;为保证软骨形成质量,我们又考察了不同代次MC的成软骨能力,并优化了大规模扩增后的MC体外三维软骨构建体系;在上述基础上,尝试应用大规模扩增后的MC复合据羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)耳支架在体外构建人耳廓形态软骨,并开展裸鼠皮下移植评估。结论我们发现,MC具有极强的增殖能力,扩增至第8代仍保持旺盛的增殖活性,提示能够获得足够数量的病人自体种子细胞构建耳廓形态软骨。然而,MC在扩增过程中极易去分化,扩增至第3代的细胞已基本丧失软骨形成能力。可喜的是,通过生长因子联合诱导,大规模扩增后去分化的MC能够重新获得软骨形成能力。最终,将大规模扩增后的MC复合PGA/PLA耳支架后,成功在体外构建出了人耳廓形态软骨,并且该软骨植入裸鼠皮下后仍能维持原有形态,且软骨表型稳定,不会发生骨化或纤维化。上述研究证实了利用大规模扩增的MC构建人耳廓形态软骨的可行性,对组织工程人耳廓形态软骨的临床转化具有重要推动作用。

关键词：小耳症残耳软骨细胞体外构建组织工程人耳廓形态软骨

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