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第十一届全国再生医学(干细胞与组织工程)学术研讨会暨第七届全国组织工程与再生医学大会

作者：殷宗琦刘豫周广东曹谊林组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 组织工程国家工程研究中心(上海国睿生命科技有限公司) 上海200241 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

目的利用带PCL(polycaprolactone,聚己内酯)内核的PGA/PLA(聚羟基乙酸/聚乳酸)三明治结构材料复合软骨细胞构建组织工程软骨,探讨带PCL内核材料在体外和体内构建组织工程软骨的可行性。方法实验组将PGA用10％ PLA包埋处理后,在两层PGA... 详细信息

目的利用带PCL(polycaprolactone,聚己内酯)内核的PGA/PLA(聚羟基乙酸/聚乳酸)三明治结构材料复合软骨细胞构建组织工程软骨,探讨带PCL内核材料在体外和体内构建组织工程软骨的可行性。方法实验组将PGA用10％ PLA包埋处理后,在两层PGA/PLA支架间内嵌一层网格状PCL,高温(＞65℃)后加压使熔化的PCL与上下两层PGA/PLA支架紧密结合,对照组使用相同重量的PGA(10％ PLA包埋),再接种细胞。复合物经体外及体内培养后取材,行大体观察、激光轮廓扫描、组织学、组织化学、免疫组化及糖氨聚糖(GAG)定量等检测。结果实验组形成了形态良好的PCL——软骨复合体,标本切面显示PCL与外层软骨结合紧密。对照组复合物卷曲变形,丧失原有的形态。组织学可见均有成熟软骨陷窝、异染基质及Ⅱ型胶原表达。结论应用带PCL内核材料可以构建组织工程软骨,并且有足够的强度对抗植入皮下所带来的张力从而维持原先复杂精确的形状。

关键词： PCL PGA PLA 软骨组织工程

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聚己内酯/壳聚糖与聚己内酯/聚乳酸支架与人脂肪来源干细胞的生物相容性研究

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中国男科学杂志 2015年第8期29卷 18-22页

作者：姚海军赵阳周哲肖冬冬张明郑大超何创龙吴稼晟王忠上海交通大学医学院附属第九人民医院泌尿外科上海200011 东华大学化学化工与生物工程学院生物材料与组织工程研究室上海交通大学材料科学与工程学院金属基复合材料国家重点实验室

目的对比人脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells,hADSCs）与聚己内酯/聚乳酸（Polycaprolactone/Polylactide,PCL/PLA）和聚己内酯/壳聚糖（Polycaprolactone/chitosan,PCL/CS）复合支架的生物相容性,为进一步体内组织修复提供依据.方法体外分离、培养和扩增hADSCs,分别制备PCL/PLA、PCL/CS复合支架,扫描电镜观察支架材料的表面情况.取材料浸提液培养hADSCs,CCK-8法检测细胞活力,评价支架的细胞毒性.hADSCs传代扩增后,接种到支架材料上,裸鼠皮下培养2周,HE染色观察细胞在支架上的生长情况.结果 hADSCs与成纤维细胞相似,呈“梭形”,并以集落形式生长.扫描电镜观察PCL/CS孔径在100μm左右,孔隙率为88.76％,而PCL/PLA支架孔径则在40μm左右,孔隙率为91.45％.hADSCs在PCL/CS浸提液中培养1、3、7天的相对增殖率分别为98.6％、101.6％、110.3％,而PCL/PLA组为98.1％、100.7％、108.4％,说明hADSCs在两种浸提液中均保持较高的增殖率,即两种合成支架均无细胞毒性.hADSCs复合两种支架体内培养后,HE染色后可见有大量细胞长入PCL/CS支架内部,同时免疫组化HLA-Ⅰ检测发现,支架材料内部分细胞阳性表达,说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于人,即hADSCs.而在PCL/PLA内部渗透进入的细胞不如PCL/CS支架组.结论 PCL/CS和PCL/PLA支架安全无毒,hADSCs在PCL/CS支架上显示更好的细胞相容性,该支架可以作为hADSCs的载体材料,用于组织工程膀胱修复的研究.

关键词：干细胞组织支架组织工程生物相容性材料

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家兔作为胎龄期骨髓间充质干细胞动物模型的实验研究

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组织工程与重建外科杂志 2015年第2期11卷 99-103页

作者：周权祁美武张智勇周广东叶金艳周晓南华大学湖南省衡阳市421000 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011 石埠子镇卫生院山东省潍坊市462100 湖南省肿瘤医院整形外科湖南省长沙市410013

目的建立以家兔为对象的胎龄期BMSC研究动物模型。方法通过人工授精方法,获得孕期3周的孕兔4只,行剖腹产术取出胎兔20只,冲取胎兔骨髓,以贴壁培养法进行体外扩增培养。测量第3代胎兔BMSC的生长曲线,克隆形成率,并进行成骨、成脂及成软... 详细信息

目的建立以家兔为对象的胎龄期BMSC研究动物模型。方法通过人工授精方法,获得孕期3周的孕兔4只,行剖腹产术取出胎兔20只,冲取胎兔骨髓,以贴壁培养法进行体外扩增培养。测量第3代胎兔BMSC的生长曲线,克隆形成率,并进行成骨、成脂及成软骨诱导分化。另外,将原代细胞冻存30 d后复苏,测量其第3代生长曲线,对冻存前后增殖能力的变化进行观察。扫描电镜观察胎兔BMSC与β-TCP形成细胞材料复合物的体外形态。将BMSCs-β-TCP复合物植入裸鼠皮下,于术后1、3、6个月分别取材,行HE、VG、Masson染色观察。结果胎兔来源的BMSC于倒置相差显微镜下观察,细胞饱满均匀,呈梭形或倒三角形状;传代后各代细胞形态未发生明显变化,生长曲线相差不大;成骨、成脂以及成软骨诱导观察到钙结节、脂肪空泡、黏多糖。冻存30 d后复苏,其第3代生长曲线与冻存前相比未见明显变化。电镜下观察,与β-TCP复合7 d后,细胞能均匀紧密贴合于材料上,伸展良好分布均匀。植入裸鼠皮不同时间点取材行HE、VG、Masson染色,均显示有新生骨组织生成。结论以家兔为研究动物模型,可以在胎龄期获取并分离得到BMSC,并可在异位构建组织工程骨,是间充质干细胞动物研究的新选择。

关键词：骨髓间充质干细胞种子细胞骨组织工程家兔

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明胶/聚己内酯纳米纤维电纺膜在表皮组织工程中的应用

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组织工程与重建外科杂志 2014年第2期10卷 61-68页

作者：吴巍段惠川张文杰曹谊林上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市200011 上海组织工程研究重点实验室上海市200011

目的观察明胶/聚己内酯(GT/PCL)纳米纤维电纺膜应用于表皮组织工程的可行性。方法测定HaCaT细胞(人类表皮细胞系)与电纺膜的生物相容性,并对于接种细胞前后该膜片的机械性能进行评价。应用CCK-8法检测细胞增殖情况。体内研究检测GT/PCL... 详细信息

目的观察明胶/聚己内酯(GT/PCL)纳米纤维电纺膜应用于表皮组织工程的可行性。方法测定HaCaT细胞(人类表皮细胞系)与电纺膜的生物相容性,并对于接种细胞前后该膜片的机械性能进行评价。应用CCK-8法检测细胞增殖情况。体内研究检测GT/PCL纳米纤维电纺膜构建的组织工程化表皮修复裸鼠皮肤缺损的效果。结果 HaCaT细胞能够在膜片上很好地附着和增殖,该膜片具有良好的生物相容性。机械性能测试显示,该膜片具有足够的力学特性以用于移植。体内研究表明,应用GT/PCL纳米纤维电纺膜构建的组织工程化表皮能够修复裸鼠的皮肤缺损。结论 GT/PCL纳米纤维电纺膜是一种适合构建组织工程化表皮的支架材料。

关键词：表皮组织工程纳米纤维电纺膜明胶聚己内酯

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瘢痕疙瘩成纤维细胞低密度培养的克隆能力分析

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组织工程与重建外科杂志 2014年第2期10卷 82-84,99页

作者：曲淼武晓莉柴岗上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011

目的比较瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)和正常真皮成纤维细胞(NFs)间克隆形成能力的差异,探讨瘢痕疙瘩中病理性干细胞是否存在,及其对瘢痕疙瘩发生发展的影响。方法利用酶消化法获得瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的原代细胞,以4 000个/皿的密度接种... 详细信息

目的比较瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)和正常真皮成纤维细胞(NFs)间克隆形成能力的差异,探讨瘢痕疙瘩中病理性干细胞是否存在,及其对瘢痕疙瘩发生发展的影响。方法利用酶消化法获得瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的原代细胞,以4 000个/皿的密度接种,进行低密度培养,2周后观察细胞克隆的形成及形态变化。结果低密度培养条件下的瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞都可形成克隆,但KFs可形成明显的克隆集落,NFs形成的克隆不明显且松散。KFs克隆形成率高于NFs,为(0.80±0.21)%,而NFs为(0.18±0.06)%,两者间差异显著(P<0.05)。结论低密度培养条件下,瘢痕疙瘩成纤维细胞的克隆形成能力高于正常皮肤成纤维细胞,可能与瘢痕疙瘩组织中存在病理性瘢痕疙瘩干细胞有关。

关键词：瘢痕疙瘩低密度培养克隆形成率瘢痕疙瘩干细胞

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软骨细胞膜片修复山羊气管的实验研究

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组织工程与重建外科杂志 2014年第3期10卷 135-140页

作者：陶然刘浥陈洁何爱娟周广东曹谊林上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011 上海市组织工程国家工程研究中心 200241

目的探讨软骨细胞膜片技术构建的组织工程软骨,修复大型哺乳动物气管缺损的方法。方法取6头山羊耳廓软骨细胞为种子细胞,利用细胞膜片技术构建软骨组织。膜片体外培养6周,回植到动物腹部皮下;3例在皮下埋置8周后包裹于硅胶管上,移植到... 详细信息

目的探讨软骨细胞膜片技术构建的组织工程软骨,修复大型哺乳动物气管缺损的方法。方法取6头山羊耳廓软骨细胞为种子细胞,利用细胞膜片技术构建软骨组织。膜片体外培养6周,回植到动物腹部皮下;3例在皮下埋置8周后包裹于硅胶管上,移植到颈旁进行再血管化和塑形,8周后带肌肉蒂修复气道缺损(带蒂移植组);另3例在皮下埋置16周后,直接用于气道缺损修复(游离移植组)。动物气管缺损范围均为3个气管环长的全段缺损。结果所有膜片在体外培养6周后,均能形成较为成熟的软骨样组织。带蒂移植组在皮下埋置8周后能形成成熟软骨组织,移植到颈旁肌肉能成功再血管化和塑形。气管缺损修复术后,带蒂移植组均能带T型管长期存活(14周),但拔出T型管后均在2周内死亡。取材时发现,带蒂移植组修复段组织工程软骨仍然存活,并在相应部位维持了很好的管壁外形,但是没有软骨外壁的部位发生明显塌陷;内壁结缔组织增生严重,阻塞管腔。游离移植组在皮下埋置16周后,也形成了成熟软骨组织。移植修复后,在T型管存在的情况下,均在术后2周内死亡。取材发现,修复段气道均发生了严重的组织坏死感染,并波及周边组织;组织学观察仅能发现少数散在的组织工程软骨组织。结论软骨细胞膜片技术是稳定可靠的组织工程软骨构建方法;在气道复杂环境中,游离移植的软骨补片会在短时间内发生坏死;带蒂移植能保证修复段组织的存活,但是完整的软骨外壁和内壁提前(或尽快)上皮化是修复成功的关键。

关键词：组织工程化软骨细胞膜片气道重建上皮化

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以PECAM-1为标志去除残留未分化胚胎干细胞的研究

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组织工程与重建外科杂志 2014年第6期10卷 301-304页

作者：王玲唐郑雅付炜张文杰上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海市200011 组织工程国家工程研究中心

目的以血小板内皮细胞黏附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1）为标志,去除小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）中残留未分化的细胞,以去除其致瘤性,为ESCs在研究中的安全应用提供思路。方法 ... 详细信息

目的以血小板内皮细胞黏附分子-1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1）为标志,去除小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）中残留未分化的细胞,以去除其致瘤性,为ESCs在研究中的安全应用提供思路。方法将小鼠R1胚胎干细胞株在撤去白血病抑制因子的培养基中悬浮培养6 d,体外自发分化形成类胚体,消化打散后,以PECAM-1为标志进行磁珠分选,得到阳性与阴性细胞群体,分别以2×10^6个/点注射入裸鼠背部皮下,6-8周后观察畸胎瘤形成情况,组织学分析瘤体构成。结果裸鼠背部成瘤结果显示,PECAM-1^＋细胞群注射8个点中7个成瘤,成瘤率87.5%;而PECAM-1^-细胞群注射8个点中1个成瘤,成瘤率12.5%。PECAM-1^＋细胞群与PECAM-1^-细胞群成瘤率具有统计学差异（P=0.01）。结论应用PECAM-1可去除体外分化过程中的残留未分化ESCs,并去除其致瘤性。

关键词：胚胎干细胞残留血小板内皮细胞黏附分子-1

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软骨细胞生物打印后细胞活力分析

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组织工程与重建外科杂志 2014年第1期10卷 11-13页

作者：曲淼沈聪聪侯亦康许佑荣柴岗高晓燕上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室200011 上海市周浦医院 201318

目的：初步确立软骨细胞的二维生物打印方法，实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后的细胞活力。方法取原代软骨细胞，常规培养至第2代。实验分2组：打印组，快速成型组织打印机进行二维细胞打印，X轴间隔300μm， Y轴间隔1500μm，激... 详细信息

目的：初步确立软骨细胞的二维生物打印方法，实现对细胞喷射过程的控制并保持打印后的细胞活力。方法取原代软骨细胞，常规培养至第2代。实验分2组：打印组，快速成型组织打印机进行二维细胞打印，X轴间隔300μm， Y轴间隔1500μm，激光共聚焦显微镜观察，经生物打印后培养2 h，Live/Dead viability Kit测定细胞活力，激光共聚焦显微镜观察细胞荧光染色情况；对照组除细胞悬液不行打印，其余操作同打印组。结果打印组细胞激光共聚焦显微镜观察，“细胞墨滴”在二维组织中均匀分布，满足二维设计细胞打印的要求，每个“细胞墨滴”含细胞15-35个。细胞活力测试显示，打印组细胞活力与对照组无明显区别。结论通过生物打印技术可实现软骨细胞在二维平面上的定向、定量规则分布，为进一步的细胞三维打印乃至器官打印体系奠定基础。

关键词：软骨细胞细胞打印组织工程

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低分子凝胶M2和交联透明质酸作为可注射性软骨再生支架的可行性研究

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组织工程与重建外科杂志 2014年第6期10卷 305-308,313页

作者：殷宗琦李萍李丹刘浥汪振星刘豫冯传良周广东上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室组织工程国家工程研究中心上海市200041 上海交通大学材料科学与工程学院上海市200240

目的探讨以低分子量凝胶M2和交联透明质酸(Hyaluronic acid,HA)作为可注射性支架材料,在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法常规分离、体外单层培养新生猪耳软骨细胞,将获得的软骨细胞以50×106 cells/m L和100×106cells/... 详细信息

目的探讨以低分子量凝胶M2和交联透明质酸(Hyaluronic acid,HA)作为可注射性支架材料,在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法常规分离、体外单层培养新生猪耳软骨细胞,将获得的软骨细胞以50×106 cells/m L和100×106cells/m L的浓度分别与M2凝胶混合,以100×106 cells/m L的浓度与交联HA混合,分别注射于裸鼠皮下,并于8周后取材。以单纯M2凝胶及单纯HA作为对照组。通过大体观察、组织化学检查、湿重测定、力学检测、蛋白聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量测定,判断低分子量凝胶M2及交联透明质酸在体内形成软骨的能力。结果实验组3组均可形成软骨样组织块。其中,M2+高浓度细胞组体积最大、质地较硬、表面光滑,软骨细胞位于成熟的陷窝中;M2+低浓度细胞组形成与高浓度细胞组质地相似的组织块,但体积相对较小;HA组形成不成熟的组织块,硬度差,含有的细胞数和分泌的基质最少。同时,实验组3组的力学和GAG含量结果也证实M2+高浓度细胞形成的软骨更加成熟。各组间具有显著性差异。2个对照组未有类软骨组织形成。结论低分子凝胶M2与软骨细胞的生物相容性优于交联HA,更适合作为可注射性支架材料用于组织工程化软骨的构建。

关键词：低分子凝胶交联透明质酸可注射支架材料组织工程化软骨

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柠檬酸酸蚀后再植牙根表面的脱矿研究

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组织工程与重建外科杂志 2014年第5期10卷 259-262页

作者：朱文婷汪俊岑莲上海交通大学医学院附属第九人民医院儿童口腔科上海口腔医学重点实验室上海市200011 组织工程国家工程研究中心上海市200241 华东理工大学化工学院上海市200237

目的研究不同脱矿方法酸蚀牙根后,根面形貌的变化及胶原纤维暴露面积,探索牙根再植的最佳存活条件。方法收集离体狗牙,制备5 mm×5 mm大小的根片,随机分为7组:A组未经酸蚀处理,即空白对照组;B组采用30%柠檬酸浸泡处理1 h;其余5组使... 详细信息

目的研究不同脱矿方法酸蚀牙根后,根面形貌的变化及胶原纤维暴露面积,探索牙根再植的最佳存活条件。方法收集离体狗牙,制备5 mm×5 mm大小的根片,随机分为7组:A组未经酸蚀处理,即空白对照组;B组采用30%柠檬酸浸泡处理1 h;其余5组使用浸有30%柠檬酸溶液的小棉球擦拭牙面,时间分别为3 min、5 min、10 min、20 min和30 min,设为C-3、C-5、C-10、C-20、C-30组。处理后样本扫描电镜观察根面微观形貌。热重分析仪SDT检测酸蚀处理对牙根无机物损耗的影响。在根面接种骨髓间充质细胞,观察细胞早期附着及增殖情况。结果未处理的根面可见明显玷污层,经柠檬酸浸泡1 h后根表面光滑,未见有暴露的胶原纤维。而使用擦拭方法处理的根面不仅能去除玷污层,而且能暴露胶原纤维,且随擦拭时间的变化暴露的胶原量也有明显差异。C-5组根面暴露的胶原面积高于C-3组,而处理时间超过10 min的根面可以发现牙骨质的大面积脱矿,牙本质小管暴露,且胶原纤维也随着牙骨质的剥脱而破坏。此外,接种在酸蚀根面的细胞附着形态较好,增殖活性强于未处理根面。结论柠檬酸根面擦拭处理5 min为理想的再植牙根表面处理方式。

关键词：柠檬酸根面处理细胞定植

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