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骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

上海口腔医学 2010年第4期19卷 403-409页

作者：邹多宏赵君夏伦果张秀丽蒋欣泉黄远亮同济大学口腔医学院上海200072 同济大学附属东方医院口腔科上海200120 上海交通大学医学院附属第九人民医院.口腔医学院口腔颌面外科上海200011 上海交通大学医学院附属第九人民医院.口腔医学院口腔组织工程实验室上海200011

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用。方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克... 详细信息

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用。方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4)。用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Western印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果。为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建。结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致,转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想。通过测序结果比对,插入序列完全正确,pLenti-mi-VHL构建成功。结论:成功构建了BMSCs的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础。

关键词： VonHippel-Lindau基因骨髓基质细胞 siRNA干扰低氧诱导因子

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应用比较蛋白质组学技术筛查组织工程化软骨力学性能相关蛋白

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中华整形外科杂志 2013年第1期29卷 49-54页

作者：丁金萍刘宏伟晏丹叶明亮邹汉法刘伟张文杰曹谊林周广东上海交通大学医学院附属第九人民医院整形外科、上海市组织工程研究重点实验室上海200011 中科院大连化学物理研究所湖南省郴州市人民医院

目的应用比较蛋白质组学分析方法筛选组织工程化软骨成熟过程中变化显著的细胞外基质蛋白，通过线性相关分析，研究与软骨力学性能相关的蛋白。方法分离人胎儿软骨细胞培养并扩增，接种到聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架材料，体外... 详细信息

目的应用比较蛋白质组学分析方法筛选组织工程化软骨成熟过程中变化显著的细胞外基质蛋白，通过线性相关分析，研究与软骨力学性能相关的蛋白。方法分离人胎儿软骨细胞培养并扩增，接种到聚羟基乙酸／聚乳酸（PGA／PLA）支架材料，体外培养4周后随机分为3组，每组6例，A组继续体外培养6周、B组回植裸鼠体内培养6周、c组回植裸鼠体内培养12周。取材后进行大体观察、湿重及体积测定、组织学及生物力学等相关检测，比较体内外构建软骨与天然软骨形成质量上的差异。同时进行蛋白质组学分析，选择细胞外基质中比值大于2倍的蛋白与相应各组杨氏模量做相关性分析，根据相关系数筛选与软骨力学性能最相关的蛋白。结果3组均能在体内外形成透明软骨样组织，c组和B组软骨外观近似天然成人软骨，组织学显示大量成熟软骨陷窝，而A组形成的软骨组织结构较松散，组织学可见不规则肥大软骨陷窝。c组湿重和生物力学检测分别为（372．5±35．4）mg和（8．68±2．65）MPa，明显高于B组的（346±34．5）mg和（3．25±1．24）MPa（P〈0．01），而A组为（184．4±12．28）mg和（0．7±0．23）MPa。应用蛋白质组学技术检测到细胞外基质中共44个差异蛋白，选择胞外基质中C组和A组之间差异最大的6个蛋白，与相应各组杨氏模量进行线性相关分析，发现核心蛋白聚糖（Decorin）、软骨粘附素（Chondroadhefin）和纤调蛋白（Fibromodulin）与软骨力学性能变化显著相关（P〈0．05）。结论蛋白质组学技术能够提供大量的蛋白质信息，组织构建与比较蛋白质组学技术相结合，有利于进一步分析组织工程化软骨胞外基质蛋白与力学性能的关系。

关键词：组织工程软骨蛋白质组学

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携带人TGF-β_1腺病毒载体的构建及鉴定

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上海交通大学学报（医学版） 2006年第10期26卷 1134-1137页

作者：夏万尧刘伟王丹茹丁文龙钟梅芳刘德莉周广东崔磊曹谊林上海交通大学医学院第九人民医院整复外科上海市组织工程重点实验室上海200011 上海交通大学基础医学院人体解剖学教研室

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,... 详细信息

目的构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础。方法应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞。结果重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段。与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功。以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6介导转染293包装细胞出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断。结论携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础。

关键词：基因重组腺病毒转化生长因子β1

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聚羟基乙酸作为支架材料体外构建复层膀胱壁结构的探讨

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临床泌尿外科杂志 2009年第12期24卷 935-938页

作者：卢慕峻王忠董国勤姜华周广东刘伟曹谊林上海交通大学医学院附属第九人民医院泌尿外科上海200011 上海市组织工程研究重点实验室

目的:探讨聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)作为支架材料并复合成年猪膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,体外构建复层膀胱壁结构的可行性。方法:采用PGA作为支架材料,并以聚乳酸(polylact acid,PLA)塑形。以酶消化法分别获得猪膀胱尿路... 详细信息

目的:探讨聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)作为支架材料并复合成年猪膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,体外构建复层膀胱壁结构的可行性。方法:采用PGA作为支架材料,并以聚乳酸(polylact acid,PLA)塑形。以酶消化法分别获得猪膀胱尿路上皮细胞和平滑肌细胞,并体外扩增。以MTT法分别检测P3代膀胱平滑肌细胞(SMC)和尿路上皮细胞(UC)的体外增殖能力。将P3代膀胱平滑肌细胞先接种在支架上,再接种尿路上皮细胞。将细胞-材料复合物体外培养1～2周并行组织学鉴定。结果:酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞经过体外培养仍具有较强的体外增殖能力。细胞材料复合物体外培养1周后形成分层排列结构,包括黏膜上皮层和膀胱平滑肌层。免疫组织化学显示平滑肌层α-Smooth MuscleActin表达阳性,黏膜上皮层广谱角蛋白表达阳性。而细胞材料复合物继续体外培养至2周,细胞从支架上大量脱落。结论:PGA适合作为复层膀胱壁结构体外构建的支架材料。采用PGA作为支架材料并复合膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞,可以体外构建出类似复层膀胱壁结构。细胞材料复合物体外培养1周左右较适合进行体内回植修复。

关键词：膀胱组织工程学聚羟基乙酸支架

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氟化脱细胞兔主动脉制备人工小血管的可行性研究

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上海交通大学学报（医学版） 2023年第7期43卷 814-820页

作者：张如杰周广东王建博翁光东雷东龚文辉安徽医科大学第一附属医院心脏大血管外科合肥230088 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200125

目的·探讨氟化脱细胞兔主动脉作为组织工程人工小血管的可行性。方法·联合聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、DNA酶、RNA酶等对获取的兔... 详细信息

目的·探讨氟化脱细胞兔主动脉作为组织工程人工小血管的可行性。方法·联合聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、DNA酶、RNA酶等对获取的兔主动脉进行脱细胞处理,分别对脱细胞组和未脱细胞组进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)、Masson染色、Verhoff-von Gieson染色,用场发射扫描电镜鉴定脱细胞效果,观察脱细胞血管形态学变化。使用脱细胞后的兔主动脉作为动脉化人工小血管支架,利用液体全氟化碳涂层修饰脱细胞小血管内膜(氟化组)制备一种新型人工小血管,并对其特征基团进行定性且定量测定。观察血管内表面液体消散时间和液体在45°倾斜血管表面的流动情况来分析血管的疏水性。将脱细胞组和氟化组的血管置入富含血小板的血浆后孵育,在电镜下观察,评估体外抗血小板聚集性能。取未脱细胞组、脱细胞组以及氟化组的兔主动脉连接上球囊扩张压力泵进行爆破压力测试。结果·对血管进行组织学观察发现,联合脱细胞法可以有效去除细胞并保留胶原蛋白和弹性纤维,且在电镜下内膜并未出现破损。对3组进行压力爆破测试,3组间比较差异无统计学意义。在疏水性测试中,水滴在氟化组内膜上停留的时间超过5 min,且在45°斜板上未留下明显水迹。在血小板黏附性试验中,脱细胞组内膜聚集活化了血小板,而氟化组则得到抑制。结论·联合脱细胞法可使脱细胞血管具有良好力学性能和物理稳定性,氟化涂层可使血管具有抗凝血性及较好的生物相容性。

关键词：脱细胞组织工程兔小血管内膜涂层

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快速获得和纯化骨髓基质干细胞的方法

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上海交通大学学报（医学版） 2008年第2期28卷 228-231页

作者：周佳沈尊理金羽青刘伟沈华上海交通大学第一人民医院整形外科上海200080 上海交通大学医学院第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

目的研究在体外快速获得骨髓基质干细胞及纯化的方法。方法采用流式细胞仪筛选法获得CD45-、CD90+原代细胞,复合胶原酶差速消化逐级传代、纯化;对第3代(P3代)细胞进行脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞三向诱导;2～4周后,分别行oilred’O、Saf... 详细信息

目的研究在体外快速获得骨髓基质干细胞及纯化的方法。方法采用流式细胞仪筛选法获得CD45-、CD90+原代细胞,复合胶原酶差速消化逐级传代、纯化;对第3代(P3代)细胞进行脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞三向诱导;2～4周后,分别行oilred’O、Safranin’O和茜素红染色,倒置显微镜下观察诱导结果。结果经流式细胞仪初筛和复合胶原酶差速消化,传代至P3代,细胞形态已呈现均一性。向脂肪细胞诱导后第4周,oilred’O染色见细胞内大量红染的脂滴;向软骨细胞诱导后第4周,Safranin’O染色见多数切片呈阳性,细胞团块中存在大量软骨特异性的陷窝样结构;向骨细胞诱导后第4周,茜素红染色发现肉眼可见广泛散在的红色阳性钙结节。结论本研究所采用的流式细胞仪初筛和复合胶原酶差速消化法,可快速获得高纯度的骨髓基质干细胞。

关键词：骨髓基质干细胞纯化流式筛选复合胶原酶

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经皮氧分压在瘢痕评估中的应用

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中国修复重建外科杂志 2018年第12期32卷 1615-1618页

作者：周易汤宋佳曹谊林张菊芳南京医科大学南京211166 浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院医疗美容科杭州310006 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程重点实验室上海200011

目的总结经皮氧分压(transcutaneous oxygen pressure,TcPO_2)测量在瘢痕评估中的应用以及研究进展。方法查阅国内外与瘢痕以及TcPO_2相关的文献,并进行总结分析。结果组织中缺氧环境在瘢痕发生发展过程起重要作用,TcPO_2能准确反映瘢... 详细信息

目的总结经皮氧分压(transcutaneous oxygen pressure,TcPO_2)测量在瘢痕评估中的应用以及研究进展。方法查阅国内外与瘢痕以及TcPO_2相关的文献,并进行总结分析。结果组织中缺氧环境在瘢痕发生发展过程起重要作用,TcPO_2能准确反映瘢痕组织内的氧分压情况,已用于瘢痕成熟度评估、指导瘢痕治疗以及研究缺氧对瘢痕发生发展的影响方面。结论 TcPO_2测量在瘢痕评估、治疗以及缺氧与瘢痕发生机制研究中有重要意义。

关键词：瘢痕经皮氧分压微血管瘢痕评估

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偏光显微镜在组织工程血管构建中的应用

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上海交通大学学报（医学版） 2007年第2期27卷 189-192页

作者：张燕忠刘阳曹谊林张柏根山西省人民医院普外科太原030012 上海交通大学医学院第九人民医院整复外科上海市组织工程重点实验室上海200011 上海交通大学医学院仁济医院血管外科上海200127

目的利用偏光显微镜对组织工程构建血管壁中的胶原成分进行定性分析。方法体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞,将其与可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合(实验组),体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。于植入后2、4、5、11... 详细信息

目的利用偏光显微镜对组织工程构建血管壁中的胶原成分进行定性分析。方法体外培养、扩增的人脐带动脉平滑肌细胞,将其与可降解生物材料聚乙醇酸(PGA)制成的管状结构结合(实验组),体外培养1周后植入裸鼠背部皮下。于植入后2、4、5、11周时分别取材,普通光镜(HE和Masson染色)及偏光显微镜下观察组织学形态,并比较结果。以无细胞单纯管状PGA-DMEM植入裸鼠背部皮下作为对照。结果偏光显微镜下,随着植入时间的延长,实验组的PGA-平滑肌细胞复合结构从以PGA为主向以胶原和平滑肌细胞为主要成分过渡;对照组则随着PGA的降解无胶原成分形成。偏光显微镜检测结果与光镜下的组织形态学检查结果相同。结论偏光显微镜可用于组织工程血管壁中胶原成分的检测,方法简便且结果可靠。

关键词：组织工程裸鼠聚乙醇酸偏光显微镜

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改良法分离大鼠IOUs构建小肠的初步研究

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上海交通大学学报（医学版） 2006年第4期26卷 393-396页

作者：周莹施诚仁姚晓虹刘伟周广东殷德民宗莉娟上海交通大学医学院新华医院小儿外科上海200092 上海交通大学医学院新华医院病理科上海200092 第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室

目的采用改良方法分离大鼠小肠上皮类器官单位(IOUs),鉴定IOUs裸鼠体内发育能力。方法取出生5～8d大鼠的小肠组织,采用改良分离法获得IOUs,与细胞外基质胶混合后植入裸鼠皮下,定期取材,组织学鉴定。结果采用改良方法分离时间明显缩短,... 详细信息

目的采用改良方法分离大鼠小肠上皮类器官单位(IOUs),鉴定IOUs裸鼠体内发育能力。方法取出生5～8d大鼠的小肠组织,采用改良分离法获得IOUs,与细胞外基质胶混合后植入裸鼠皮下,定期取材,组织学鉴定。结果采用改良方法分离时间明显缩短,体内植入所有实验组均有多个囊泡样组织形成,植入2周后部分囊腔凹陷可见隐窝样结构,2周后部分囊泡内壁可见分化较成熟的上皮细胞突出,类似绒毛结构;上皮下可见少量平滑肌样细胞围绕囊状管腔周围。结论初步证实改良方法分离出IOUs用于组织工程肠管构建的可行性,并为出生后组织修复重构的研究奠定了基础。

关键词：小肠上皮类器官单位分离方法组织工程大鼠

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瘢痕疙瘩患者瘢痕疙瘩与其周围正常皮肤水屏障功能的差异及其相关机制

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中华烧伤与创面修复杂志 2022年第1期38卷 63-68页

作者：于磊杨雅婷刘伟潍坊医学院整形外科研究所潍坊261042 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科上海市组织工程研究重点实验室上海200011

目的比较瘢痕疙瘩患者的瘢痕疙瘩与其周围正常皮肤的皮肤水屏障功能的差异并初步探索相关机制。方法采用横断面观察性研究方法。2020年10月—2021年3月,上海交通大学医学院附属第九人民医院接诊30例符合入选标准的瘢痕疙瘩患者,其中男1... 详细信息

目的比较瘢痕疙瘩患者的瘢痕疙瘩与其周围正常皮肤的皮肤水屏障功能的差异并初步探索相关机制。方法采用横断面观察性研究方法。2020年10月—2021年3月,上海交通大学医学院附属第九人民医院接诊30例符合入选标准的瘢痕疙瘩患者,其中男12例、女18例,年龄20~48岁。接诊当日采用多功能皮肤测试仪测定30例患者瘢痕疙瘩皮肤及其周围正常皮肤的经皮水分丢失(TEWL)。对5例患者瘢痕疙瘩修复术后的瘢痕疙瘩皮肤及其周围正常皮肤行苏木精-伊红染色观测表皮厚度,取其中3例患者标本采用免疫组织化学法检测瘢痕疙瘩皮肤及正常皮肤细胞角蛋白10、内披蛋白和聚丝蛋白的表达。对数据行配对样本t检验或独立样本t检验。结果接诊当日,30例患者瘢痕疙瘩皮肤TEWL为9.0(6.9,13.4)g·m^(-2)·h^(-1),正常皮肤的TEWL为8.1(6.4,18.1)g·m^(-2)·h^(-1),二者比较差异无统计学意义(t=0.44,P>0.05)。瘢痕疙瘩修复术后,5例患者瘢痕疙瘩皮肤表皮厚度为(194±44)μm,明显厚于正常皮肤的(44±11)μm(t=6.88,P<0.01);且瘢痕疙瘩区域均存在角质形成细胞(KC)数量增多、正常皮肤的表皮脊结构缺乏、表皮明显增厚等现象。瘢痕疙瘩修复术后,3例患者瘢痕疙瘩皮肤细胞角蛋白10表达明显低于正常皮肤(t=8.50,P<0.01),而瘢痕疙瘩皮肤表皮的内披蛋白和聚丝蛋白表达均与正常皮肤相近(t值分别为0.07、0.96,P>0.05)。结论瘢痕疙瘩患者瘢痕疙瘩皮肤组织中存在KC增多、表皮增厚的现象,但瘢痕疙瘩区域的水屏障功能与周围正常皮肤组织相近,TEWL可能并不是影响瘢痕疙瘩持续发展的主要机制。

关键词：瘢痕疙瘩表皮皮肤水屏障功能角质形成细胞经皮水分丢失

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