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合成生物学 2024年第5期5卷 941-959页

作者：郑梦梦刘犇犇林芝瞿旭东上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240 上海交通大学张江高等研究院上海201203

甾体化合物因其多功能生物活性和理化特性备受生物医药行业的高度重视,被誉为自然界的“生命之钥”。随着植物甾醇代谢途径的不断解析,国内逐渐形成了“植物甾醇原料-甾体药物中间体-甾体药物”的工业合成路线。日益发展的甾药行业需要... 详细信息

甾体化合物因其多功能生物活性和理化特性备受生物医药行业的高度重视,被誉为自然界的“生命之钥”。随着植物甾醇代谢途径的不断解析,国内逐渐形成了“植物甾醇原料-甾体药物中间体-甾体药物”的工业合成路线。日益发展的甾药行业需要不断开发新的合成技术推进甾体药物自上而下高效合成。基于生物信息学、合成生物学、代谢工程以及酶工程的快速发展,甾体化合物的合成技术也取得了重大突破。本文对重要甾体化合物的最新合成进展,包括甾体药物中间体的多样化合成、复杂甾体的化学酶法合成和酵母从头合成植物甾醇原料等方面进行了综述,特别强调了近年来P450羟化酶、3-甾酮-Δ^(1)-脱氢酶、还原酶以及酶级联参与的化学酶法在高效简易合成复杂甾体药物中的代表性工作;在此基础上,也从新一代甾药中间体的开发、新型甾体生物催化剂的挖掘、以分枝杆菌为底盘的甾体合成途径的构建等方面对甾体化合物未来的研究机会和挑战进行了展望。

关键词：甾体化合物底盘菌株化学酶法区域-立体选择性酶级联

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CRISPR/Cas13a系统在大肠杆菌RNA编辑过程中的逃逸现象

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微生物学报 2024年第8期64卷 2998-3013页

作者：张悦许杰王珩瑜盛勇欧一新王斌张蓓康前进张丽青岛大学青岛医学院基础医学院山东青岛266071 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240 上海交通大学代谢与发育国际联合合作实验室上海200240

【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655-ΔrecA和Escherichia coli DH10B中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统,通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA,分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象。【方法】选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a,构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒,选取MG1655-ΔrecA和DH10B为研究对象。通过Crisporo算法,设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA(crRNA)序列,考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象。再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象,结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件。选取通过插入序列(insertion sequence,IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落,通过监测OD_(600)进一步考察菌株的生长情况。【结果】利用LshCas13a系统靶向MG1655-ΔrecA和DH10B中的lacZ和polA,发现靶向lacZ时,MG1655-ΔrecA通过LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸;靶向polA时,MG1655-ΔrecA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat,DR)序列等方式逃逸。LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复。【结论】本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了***宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象,包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况。本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础。

关键词：大肠杆菌 CRISPR/LshCas13a 质粒干扰系统逃逸现象插入序列

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组学技术在食源性致病菌抗逆机制研究中的应用进展

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食品科学 2022年第19期43卷 308-317页

作者：何守魁黎丹红施春雷史贤明上海交通大学农业与生物学院中美食品安全联合研究中心微生物代谢国家重点实验室上海200240

食源性致病菌是危害食品安全的罪魁祸首,可对食品工业常用的物理杀菌因子(如热)和化学杀菌因子(如消毒剂)形成抗性,从而更易引发食物中毒。这种抗性的形成,通常是多个基因、sRNA、蛋白质和多个代谢物协调作用的综合表现,涉及多个代谢网... 详细信息

食源性致病菌是危害食品安全的罪魁祸首,可对食品工业常用的物理杀菌因子(如热)和化学杀菌因子(如消毒剂)形成抗性,从而更易引发食物中毒。这种抗性的形成,通常是多个基因、sRNA、蛋白质和多个代谢物协调作用的综合表现,涉及多个代谢网络的调控。日益成熟的组学技术为食源性致病菌抗逆相关元件的全面发掘及互作关系研究提供了坚实的技术保障,并有助于建立食源性致病菌抗逆组数据库。因此,本文综述了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学技术在食源性致病菌抗逆机制研究中的应用进展,并对未来的发展方向进行展望,以期为遏制抗逆菌株引发的食物中毒提供理论依据。

关键词：组学技术食源性致病菌抗逆性分子机制

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基于基因组数据分析的细菌耐药基因识别与表型预测

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微生物学报 2024年第2期64卷 432-442页

作者：周秀娟何逸尘张利达崔妍史贤明上海交通大学农业与生物学院、中美食品安全联合研究中心微生物代谢国家重点实验室上海200240 上海健康医学院健康与公共卫生学院上海201318

利用基因组数据和生物信息学分析方法,快速鉴定耐药基因并预测耐药表型,为细菌耐药状况监测提供了有力辅助手段。目前,已有的数十个耐药数据库及其相关分析工具这些资源为细菌耐药基因的识别以及耐药表型的预测提供了数据信息和技术手... 详细信息

利用基因组数据和生物信息学分析方法,快速鉴定耐药基因并预测耐药表型,为细菌耐药状况监测提供了有力辅助手段。目前,已有的数十个耐药数据库及其相关分析工具这些资源为细菌耐药基因的识别以及耐药表型的预测提供了数据信息和技术手段。随着细菌基因组数据的持续增加以及耐药表型数据的不断积累,大数据和机器学习能够更好地建立耐药表型与基因组信息之间的相关性,因此,构建高效的耐药表型预测模型成为研究热点。本文围绕细菌耐药基因的识别和耐药表型的预测,针对耐药相关数据库、耐药特征识别理论与方法、耐药数据的机器学习与表型预测等方面展开讨论,以期为细菌耐药的相关研究提供手段和思路。

关键词：细菌耐药耐药数据库生物信息学耐药基因识别耐药表型预测

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基于双重芯片式数字PCR快速鉴定KPC型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的方法

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微生物学通报 2023年第7期50卷 3058-3072页

作者：台萃张薇许杰欧一新罗倩上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题... 详细信息

【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因blaKPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因blaKPC保守序列设计特异性引物和探针,确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和blaKPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系,并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,在两基因同时检出的情况下,最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (blaKPC基因);优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致;利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株,其中肺炎克雷伯菌43株,属肺炎克雷伯菌且含有blaKPC基因的菌株13株,这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好,可用于检测具有碳青霉烯酶基因blaKPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。

关键词：肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因blaKPC 双重芯片式数字PCR 绝对定量病原菌检测

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微生物群系降解污染物的多组学策略与应用

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中国科学：生命科学 2023年第5期53卷 686-697页

作者：黄逸群文凌宇唐鸿志上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

微生物在自然界的广泛分布与代谢灵活性赋予它们对于大量外源性物质的降解能力.人类的生产活动将多种外源性污染物大量释放到土壤、水体和大气中造成严重的环境污染问题,污染位点的原位微生物群系往往通过成员间代谢协作和外界环境因素... 详细信息

微生物在自然界的广泛分布与代谢灵活性赋予它们对于大量外源性物质的降解能力.人类的生产活动将多种外源性污染物大量释放到土壤、水体和大气中造成严重的环境污染问题,污染位点的原位微生物群系往往通过成员间代谢协作和外界环境因素的共同作用下实现外源性污染物的部分或完全矿化.传统污染物降解研究以微生物的分离培养和单菌研究为主,而高通量检测技术的发展使宏基因组、宏转录组、宏蛋白质组、代谢组及多组学组合策略为微生物群系水平研究污染物降解和生态修复提供可行性.本文主要针对各组学在探索微生物群系结构、挖掘功能基因、解析代谢途径、阐明成员间相互作用、分析污染物代谢胁迫等方面的应用与局限性,并展望其在未来生态修复与环境污染物降解研究的发展方向和前景.

关键词：微生物群系组学生态修复污染物降解

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灭癌素链霉菌中磷硫酰化修饰DNA结合结构域的功能分析

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微生物学报 2022年第2期62卷 543-555页

作者：陈英孔令新邓子新由德林上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200030

【目的】DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰。PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示。PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长... 详细信息

【目的】DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰。PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示。PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成为新PT检测方法开发的优选。灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)中具有天蓝色链霉菌中PT修饰依赖的IV型限制酶(ScoMcrA)的同源酶,暗示其同样含有特异性结合PT修饰DNA的硫结合结构域(sulfur binding domain,SBD)。本文对灭癌素链霉菌中的SBD(简称为Sg-SBD)与PT修饰DNA的亲和力进行定性检测与定量表征,评估其用于PT修饰ELISA方法开发的潜力。【方法】对ScoMcrA-SBD和Sg-SBD的氨基酸序列进行比对分析,利用ScoMcrA-SBD为模板进行同源建模。在大肠杆菌中异源表达Sg-SBD,利用纯化的Sg-SBD进行凝胶迁移(electrophoresis mobility shift assays,EMSA)检测。利用生物膜层干涉(biolayer interferometry,BLI)技术进行Sg-SBD结合PT修饰DNA的定量表征。【结果】生物信息学分析揭示了Sg-SBD含有结合硫原子的保守的氨基酸残基,同时表明Sg-SBD具有与ScoMcrA-SBD相似的结构。EMSA实验发现Sg-SBD可以结合PT修饰DNA形成明显的迁移带,初步证实Sg-SBD结合PT修饰DNA的活性。BLI数据显示,Sg-SBD具有比ScoMcrA-SBD更强的PT修饰DNA结合能力,其与PT修饰DNA的亲和力常数在nmol/L级别,并且Sg-SBD不结合非PT修饰DNA。【结论】Sg-SBD结合PT修饰DNA活性接近抗原-抗体的反应水平,可用于PT修饰DNAELISA快速检测方法的开发。

关键词： DNA磷硫酰化修饰硫结合结构域凝胶迁移生物膜层干涉酶联免疫检测

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胃组织微生物群系高通量测序研究中去除宿主DNA的方法比较

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中国科学：生命科学 2023年第5期53卷 725-735页

作者：罗珮张晨虹上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

在组织共生微生物群系的研究中,组织样本中微生物细胞比例远低于宿主细胞,导致高通量测序数据中属于微生物的序列比例很低,不足以准确反映菌群多样性和结构组成.本文比较了HostZEROTM Microbial DNA Kit(ZYM)和NEBNext mircobiome DNA e... 详细信息

在组织共生微生物群系的研究中,组织样本中微生物细胞比例远低于宿主细胞,导致高通量测序数据中属于微生物的序列比例很低,不足以准确反映菌群多样性和结构组成.本文比较了HostZEROTM Microbial DNA Kit(ZYM)和NEBNext mircobiome DNA enrichment kit(NEB)两款商用DNA提取试剂盒、16S r RNA基因V3-V4高变区测序文库构建过程中的巢式PCR(NES)和扩增产物切胶回收(GEL)四种方法.与未经去除宿主DNA的方法相比,四种方法都使胃组织样本测序结果中细菌序列占比显著增加.NES和ZYM明显改变了纯菌菌株混合样本和胃组织样本菌群的组成;NEB未对菌株混合样本菌群组成造成明显影响,但对胃组织样本菌群结构影响大;只有GEL方法对样本菌群结构影响较小.综上所述,GEL方法能够去除大部分宿主DNA又对菌群组成影响最小,这为研究组织微生物群系时减少测序数据中宿主DNA的方法选择提供了参考.

关键词：胃组织微生物群系 DNA提取及建库去除宿主DNA 16S rRNA V3-V4区测序

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麦角硫因在游动放线菌底盘中的高效合成

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微生物学报 2024年第8期64卷 2752-2767页

作者：刘震常莹莹邓子新刘天罡武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室湖北武汉430071 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】麦角硫因是一种稀有的天然氨基酸类强抗氧化剂,在机体内发挥着重要的生理功能,并在食品、医药、化妆品领域得到广泛应用。然而,传统的从蕈菇中提取和化学合成的方法存在收率低、成本高等问题,本研究期望利用代谢工程改造,提高... 详细信息

【目的】麦角硫因是一种稀有的天然氨基酸类强抗氧化剂,在机体内发挥着重要的生理功能,并在食品、医药、化妆品领域得到广泛应用。然而,传统的从蕈菇中提取和化学合成的方法存在收率低、成本高等问题,本研究期望利用代谢工程改造,提高游动放线菌(Actinoplanes sp.)HS中麦角硫因的产量。【方法】首先通过生物信息学分析,锁定了Actinoplanes ***中可能参与麦角硫因合成的基因;接着在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行异源表达,进一步鉴定了这些基因的功能;最后将鉴定功能的基因组合后在Actinoplanes ***中进行高表达,对突变株产量进行测定,并通过在发酵培养基中添加不同浓度的前体,探究其对发酵产量的影响。【结果】Actinoplanes ***中基因BC03-04016、BC03-04015、BC03-04014、BC03-04013所编码的酶可以合成麦角硫因前体组氨酸甜菜碱半胱氨酸亚砜(hercynine-cysteine-sulphoxide,HER-Cys-Sul),基因BC03-04046和BC03-04917所编码的酶都具有裂解碳硫键的功能,可以催化前体HER-Cys-Sul形成终产物麦角硫因。将编码麦角硫因合成的基因高表达后得到的突变株YC313和YC314,其麦角硫因产量分别达到125 mg/L和108 mg/L,较出发菌株Actinoplanes ***分别提高至2.9倍和2.5倍。在发酵培养基中额外添加0.35 g/L的甲硫氨酸后,YC313菌株的麦角硫因产量相较于原始培养基提高了24%;额外添加10 g/L的黄豆饼粉后,相较于原始培养基麦角硫因产量提高了19%。【结论】本研究对Actinoplanes ***中麦角硫因合成的相关基因及其功能进行了鉴定,通过代谢工程改造得到了两株麦角硫因高产菌株,并进一步研究了前体供应对麦角硫因产量的影响,为以游动放线菌为底盘生产麦角硫因提供了策略支持。

关键词：麦角硫因游动放线菌高产菌株

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超嗜热古菌Thermococcus eurythermalis A501编码B家族DNA聚合酶的生化特性及PCR应用

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生物工程学报 2022年第2期38卷 807-819页

作者：翁妍刘喜朋上海交通大学微生物代谢国家重点实验室生命科学技术学院上海200240

DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶。文中克隆表达了超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)A501来源的B家族DNA聚合酶基因(... 详细信息

DNA聚合酶广泛应用于PCR技术,在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。但目前商业化DNA聚合酶仍不能完全满足科研需要,有必要寻求高性能DNA聚合酶。文中克隆表达了超嗜热古菌(Thermococcus eurythermalis)A501来源的B家族DNA聚合酶基因(NCBI数据库基因登录号为TEU_RS04875)、表征该重组蛋白的生化特性、评价了其PCR应用。将删除intein蛋白序列的DNA聚合酶(Teu-PolB)进行体外重组表达,经亲和层析和离子交换层析纯化获得Teu-PolB蛋白;利用5′端带荧光标记的寡核苷酸作为底物,用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定Teu-PolB的生化特性;以噬菌体λDNA基因组为模板,探究Teu-PolB的PCR应用。结果显示,Teu-PolB具有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性,该酶在98℃下的半衰期约为2 h,热稳定性高。使用Teu-PolB进行PCR扩增,最适PCR缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2.5 mmol/L MgCl_(2),60 mmol/L KCl,10 mmol/L(NH_(4))_(2)SO_(4),0.015%Triton X-100和0.01%BSA,最适延伸温度为68℃。此外,Teu-PolB能在2 kb/min条件下成功扩增4 kb目的片段,扩增产量弱于商品化Taq DNA聚合酶,优于Pfu DNA聚合酶,但扩增速率和保真度优于Taq和Pfu DNA聚合酶,且对盐的耐受性较高。综上所述,本研究鉴定了一种高保真DNA聚合酶Teu-PolB的生化特性,结果表明该酶可应用于PCR扩增,具有热稳定性高、耐盐性能好、扩增速率高、保真度高等特征。

关键词：超嗜热古菌 DNA聚合酶 PolB PCR

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