检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学报 2023年第9期63卷 3520-3533页

作者：吕丹阳高耀杰赵宇春周洁邓子新蒋明上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一... 详细信息

【目的】通过一锅酶法在体外无细胞条件下重构醌那霉素的生物合成途径,实现从原料辅酶A、乙酰-辅酶A和丙二酸到醌那霉素重要中间体的高效转化。【方法】纯化得到AlpAB、RavC等8个醌那霉素合成相关蛋白和MCAT、MatB等2个辅助蛋白;利用一锅酶法进行体外反应,并用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测反应产物;利用该体系探究Ⅱ型硫酯酶AlpS在合成通路中的功能及作用底物;利用单一变量法对体系温度、pH、最小聚酮合酶(minimal polyketide synthase,minimal PKS)浓度和Ⅱ型硫酯酶AlpS浓度等条件进行优化。【结果】体系所需的聚酮合酶和辅助蛋白均获得可溶性表达;利用一锅酶法成功合成了醌那霉素的早期重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin;加入AlpS蛋白后以上5种产物产量均有不同程度的提高,其中prejadomycin和dehydrorabelomycin提高较为显著;优化后的反应最适条件为:温度30℃、pH 7.0、最小聚酮合酶(AlpA、AlpB和RavC)浓度各2.8μmol/L、AlpS 7.2μmol/L;prejadomycin的产量提高到302 mg/L。【结论】本研究成功利用一锅酶法在无细胞条件下重构了醌那霉素的早期生物合成途径,合成了醌那霉素的重要中间体SEK15、UWM6、rabelomycin、prejadomycin和dehydrorabelomycin。研究进一步验证了硫酯酶AlpS的链释放功能并推测其作用底物。

关键词：醌那霉素一锅酶法体外重构 Ⅱ型聚酮化合物

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嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V的重组表达与酶学特征

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微生物学报 2021年第12期61卷 4070-4085页

作者：宋吴涛刘喜朋缪晓玲上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的核酸内切酶V(Saci_0544),对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。【方法】将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V(SacEndoV)在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯... 详细信息

【目的】表达纯化嗜酸嗜热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的核酸内切酶V(Saci_0544),对其核酸内切酶活性及酶学特征进行探究。【方法】将Sulfolobus acidocaldarius核酸内切酶V(SacEndoV)在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到目标蛋白;利用带有不同类型损伤的寡核苷酸作为底物,结合变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,鉴定SacEndoV对相应损伤寡核苷酸底物的剪切活性。【结果】SacEndoV特异性剪切含脱氧肌苷(Deoxyinosine)的损伤DNA底物,明显偏好单链DNA底物。SacEndoV在70–95℃温度范围内酶活性高,酶活性依赖于二价金属离子,Mg^(2+)为最佳辅助离子,其最佳反应pH为7.5–8.0,高于200 mmol/L的NaCl会明显抑制其剪切活性。损伤DNA中脱氧肌苷3′端相邻的脱氧核糖核苷酸的结构完整性对于SacEndoV识别并剪切相应底物具有重要影响,脱氧肌苷3′端无碱基位点的存在使得SacEndoV不能够切断损伤DNA。此外,经测定SacEndoV对于含肌苷的损伤RNA底物具有剪切活性。【结论】本研究证实SacEndoV是一种典型的核酸内切酶V,对含脱氧肌苷的损伤DNA具有特异性的内切酶活性,推测其在Sulfolobus acidocaldarius体内参与脱氧肌苷的切除修复。

关键词：嗜热古菌嗜酸嗜热硫化叶菌核酸内切酶V 脱氧肌苷

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嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus RecJ核酸酶的表达纯化及酶学特征

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微生物学报 2021年第1期61卷 219-230页

作者：王天乐刘喜朋上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus (***)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将*** RecJ (AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌... 详细信息

【目的】克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus (***)来源的RecJ核酸酶基因(ORF编号AF_0699,NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550),对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析。【方法】将*** RecJ (AfuRecJ)核酸酶在大肠杆菌中进行重组表达,经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白;利用人工合成的带有末端荧光标记的寡核苷酸作为底物,体外反应后,利用8 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定AfuRecJ核酸酶的水解产物。【结果】AfuRecJ核酸酶具有单链DNA特异性的3’–5’外切核酸酶活性,酶活性依赖于二价金属离子Mn2+或Mg2+,且Mn2+存在条件下的催化效率明显优于Mg2+;其最适反应温度范围为55–65℃;高于200 mmol/L的NaCl会显著抑制AfuRecJ的核酸酶活性。AfuRecJ还具有单链RNA 3’–5’外切酶活性,且活性高于单链DNA底物。单链核酸3’末端的磷酸基团对水解活性有一定抑制作用。AfuRecJ对单链核酸的长度有一定的选择性,可以有效水解长度≥4个核苷酸长度的单链RNA、≥12个核苷酸长度的单链DNA,而且对双链DNA中的3’单链DNA结构(3’突出单链尾巴与末端分叉结构)具有类似单链DNA的水解活性。【结论】本研究证实AfuRecJ是一种单链核酸特异性的3’–5’外切核酸酶,且相比单链DNA,单链RNA为优势底物,推测其在胞内可能参与RNA降解与DNA修复。

关键词：嗜热古菌 DNA修复 RecJ核酸酶核酸酶

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酵母亚细胞结构分离效率评估菌株的构建

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中国生物工程杂志 2020年第10期40卷 10-23页

作者：胡妍李辉何承文朱婧谢志平上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

背景:真核细胞依赖其亚细胞结构高效地完成复杂的生化反应。尽管目前有一些亚细胞结构分离技术,但却缺乏评估这些分离技术的简单、有效方法。目的:构建可以用来检测亚细胞结构分离效率的酿酒酵母菌株。方法:通过传统的分子生物学与细胞... 详细信息

背景:真核细胞依赖其亚细胞结构高效地完成复杂的生化反应。尽管目前有一些亚细胞结构分离技术,但却缺乏评估这些分离技术的简单、有效方法。目的:构建可以用来检测亚细胞结构分离效率的酿酒酵母菌株。方法:通过传统的分子生物学与细胞生物学方法以酿酒酵母为背景构建了亚细胞结构分离效率评估菌株,并进行可行性检测。首先,将酵母各细胞器、自噬体及质膜的标记蛋白进行分组,用不同的蛋白标签分别标记每组蛋白。然后,以标记蛋白-GFP/RFP作为对照组通过免疫荧光法检测蛋白标签对标记蛋白的亚细胞定位是否有影响。最后,通过非连续性密度梯度离心验证该检测菌株能否用来检测亚细胞结构的分离效率。结果:成功构建了酵母亚细胞结构分离效率评估菌株,该菌株标记了大多数酵母细胞亚细胞结构。挂标签的标记蛋白仍然定位在各自标记蛋白对应的亚细胞结构。非连续性密度梯度离心后,酵母各个亚细胞结构的标记蛋白均可以被检测到。结论:该酵母亚细胞结构分离效率评估菌株是检测各亚细胞结构分离结果的方便工具,对今后酿酒酵母细胞生物学的研究有潜在的应用价值。

关键词：酿酒酵母细胞器自噬体质膜亚细胞结构分离

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杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇中甲基转移酶PieB2的功能

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微生物学报 2016年第7期56卷 1186-1193页

作者：赵震宇刘倩由德林上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

【目的】研究杀粉蝶菌素A1产生菌中甲基转移酶基因pieB2的功能。【方法】利用接合转移和同源重组双交换的方法,构建pieB2基因缺失突变株,以及利用接合转移的方法,构建回补菌株。通过高保真PCR克隆pieB2基因到表达载体pET28a上,构建质粒p... 详细信息

【目的】研究杀粉蝶菌素A1产生菌中甲基转移酶基因pieB2的功能。【方法】利用接合转移和同源重组双交换的方法,构建pieB2基因缺失突变株,以及利用接合转移的方法,构建回补菌株。通过高保真PCR克隆pieB2基因到表达载体pET28a上,构建质粒pJTU5997,转化入大肠杆菌***21(DE3)/pLysE中诱导表达。利用高效液相色谱检测PieB2的体外酶活。【结果】获得了pieB2基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株不再产生杀粉蝶菌素A1,而是积累了一种脱甲基产物。N-末端融合组氨酸标签的PieB2在大肠杆菌中获得可溶性表达,通过体外催化证明了PieB2甲基转移酶的功能。【结论】体内遗传实验和体外生化实验证明了PieB2作为甲基转移酶在杀粉蝶菌素A1合成中的作用。

关键词：杀粉蝶菌素A1 甲基转移酶基因敲除生物合成

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药物类新污染物的微生物降解机制研究进展

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微生物学报 2023年第5期63卷 1787-1795页

作者：李涛许芷菁周宁一上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

环境微生物作为自然界中主要的分解者蕴含着丰富的遗传和代谢多样性,在有机污染物降解中发挥着重要作用。药物被持续不断地释放到环境中,其环境暴露、环境风险和对人体健康的潜在影响已得到广泛关注。研究药物在环境中的微生物降解过程... 详细信息

环境微生物作为自然界中主要的分解者蕴含着丰富的遗传和代谢多样性,在有机污染物降解中发挥着重要作用。药物被持续不断地释放到环境中,其环境暴露、环境风险和对人体健康的潜在影响已得到广泛关注。研究药物在环境中的微生物降解过程对于药物的环境命运、药物的环境风险评估和药物污染去除技术的开发等具有重要价值。本文重点综述了目前环境中常检出药物的微生物降解途径及其分子机理,总结了目前药物微生物降解研究领域的进展,最后探讨了药物的微生物降解领域未来的研究趋势。

关键词：环境微生物生物降解新污染物药物

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酿酒酵母GPCR蛋白Ste2亚细胞定位信号探索

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中国生物工程杂志 2019年第11期39卷 39-53页

作者：金雪宋敬臻谢志平上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族蛋白在细胞感受各种胞外信号过程中发挥重要作用。Ste2是酵母细胞中GPCR蛋白之一。大量文献报道了Ste2蛋白突变体对其功能和表达的影响,但关于Ste2亚细胞定位的研究相对较少。这项... 详细信息

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)家族蛋白在细胞感受各种胞外信号过程中发挥重要作用。Ste2是酵母细胞中GPCR蛋白之一。大量文献报道了Ste2蛋白突变体对其功能和表达的影响,但关于Ste2亚细胞定位的研究相对较少。这项工作的目的在于确定Ste2亚细胞定位,探究Ste2不同跨膜域、胞内外环状结构域和N端、C端对其亚细胞定位的影响。构建了一系列结构域删除或替换突变体,通过荧光显微镜观察判断不同结构区域对Ste2亚细胞定位的影响,并通过与已知的细胞器标记蛋白共定位观察验证亚细胞定位判读结果。结果显示:野生型Ste2荧光信号出现在质膜和液泡内腔;C端缺失突变体荧光信号出现在质膜和内质网。在N端、C端、各环状结构域序列采用动物GPCR蛋白ORI7、OR17-40相应结构域替换的突变体中,C端替换导致液泡内腔信号消失,质膜信号强于野生型;N端和部分环状结构域替换不同程度减弱或消除了质膜定位,液泡腔内信号类似于野生型;部分突变体在胞内出现点状分布的荧光信号。由此推断:Ste2 N端,第一、第二胞外环状结构域和第三胞内环状结构域可能具有影响Ste2运输定位到质膜的功能;而C端则可能在Ste2离开细胞膜进入液泡的过程中发挥作用。初步确定了Ste2的不同结构区域对其定位的影响,为深入研究GPCR蛋白的亚细胞定位机制奠定基础。

关键词：酵母 GPCR Ste2 亚细胞定位分选信号

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恶臭假单胞菌SJTE-1中氧化17β-雌二醇的17β-羟甾类脱氢酶2及其转录调控因子AraC的鉴定

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微生物学报 2020年第2期60卷 306-319页

作者：孙欣郑达宁彭万里梁如冰微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学技术学院上海200240

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2(17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水... 详细信息

[目的]假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但其代谢机制尚不清楚。本文鉴定和表征了该菌株中参与雌二醇降解与调控过程的17β-羟甾类脱氢酶2(17β-HSD2)和转录调控因子AraC。[方法]我们通过荧光定量PCR分析了17β-hsd2和araC的转录水平;我们在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中异源表达了17β-HSD2和AraC基因,并利用金属离子亲和层析法纯化获得了重组蛋白;我们体外表征了17β-HSD2的酶学性质,利用高效液相色谱鉴定了其产物;通过电泳迁移转移法和DNase酶I足迹试验,我们鉴定了重组蛋白AraC的结合能力与结合位点。[结果]17β-HSD2和AraC可被17β-雌二醇诱导表达;蛋白序列比对结果表明17β-HSD2含有短链脱氢酶/还原酶(SDR)和β-羟甾类脱氢酶的保守结构与残基。该酶以NAD+为辅助因子,在C17位点氧化17β-雌二醇,其Km值为0.082 mmol/L,Vmax值为56.26±0.02μmol/(min·mg);5 min内可转化97.4%以上的雌二醇。转录调控因子AraC可直接结合17β-hsd2基因启动子区的特异位点;雌二醇与雌酮可解除这一结合,启动17β-hsd2基因转录;过表达AraC蛋白可抑制17β-hsd2的转录。[结论]假单胞菌SJTE-1的17β-羟甾类脱氢酶2可高效催化17β-雌二醇转化,并受到转录因子AraC的直接调控。本工作可推进细菌的雌激素降解酶学机制与调控网络研究。

关键词： 17β-羟甾类脱氢酶2 17β-雌二醇转录因子AraC 雌酮生物降解

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解脂耶氏酵母表面展示β-淀粉酶与α-葡萄糖转苷酶及一步法由淀粉合成低聚异麦芽糖

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生物工程学报 2019年第1期35卷 121-132页

作者：刘大文程海荣邓子新上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

低聚异麦芽糖(IMO)所具有的良好理化性质和生理功能,使得其在食品、医药、饲料、化妆品等领域得到广泛应用。但目前工业上采用多酶协同法由淀粉合成低聚异麦芽糖,步骤繁琐、成本较高。因此开发出更加经济简便的方法生产低聚异麦芽糖具... 详细信息

低聚异麦芽糖(IMO)所具有的良好理化性质和生理功能,使得其在食品、医药、饲料、化妆品等领域得到广泛应用。但目前工业上采用多酶协同法由淀粉合成低聚异麦芽糖,步骤繁琐、成本较高。因此开发出更加经济简便的方法生产低聚异麦芽糖具有重要的应用价值。通过将β-淀粉酶(βa)和耐热α-葡萄糖转苷酶(GT)以不同的方式进行融合,并利用表面展示系统固定在食品安全微生物解脂耶氏酵母细胞表面,实现自我表达与固定。筛选得到高产菌株Yβa-GT29。大量培养获得细胞,转化液化的淀粉可实现一步法合成IMO,50℃转化20h即可得到纯度为75.3%的低聚异麦芽糖,方便了低聚异麦芽糖的生产。

关键词：解脂耶氏酵母酵母表面展示低聚异麦芽糖 β-淀粉酶耐热α-葡萄糖转苷酶

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固定化Pseudomonas citronellae SJTE-3菌剂对水中炔雌醇的去除作用

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农业环境科学学报 2020年第8期39卷 1803-1810页

作者：王雁秋彭万里梁如冰上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

炔雌醇(17α-乙炔基雌二醇,EE2)是常用的雌激素药物与养殖业激素添加剂,可导致严重的环境雌激素污染。制备和应用高效稳定的固定化菌剂,有助于实现环境炔雌醇污染的有效去除。本研究利用海藻酸钙法对前期分离的雌激素降解香茅醇假单胞菌... 详细信息

炔雌醇(17α-乙炔基雌二醇,EE2)是常用的雌激素药物与养殖业激素添加剂,可导致严重的环境雌激素污染。制备和应用高效稳定的固定化菌剂,有助于实现环境炔雌醇污染的有效去除。本研究利用海藻酸钙法对前期分离的雌激素降解香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)SJTE-3进行固定,制备降解性能更稳定的固定化菌剂。正交试验确定了菌剂的最佳固定化条件是3%海藻酸钠溶液、4%CaCl2溶液和2 mL的OD600为10.0的菌液量。优化的固定化菌剂对Tris-HCl液体培养基中10μg·mL-1的炔雌醇的去除率可达78.8%,较游离态菌剂的去除率提高了23.0%。同时,该固定化菌剂对模拟污水中不同浓度炔雌醇(5~50μg·mL-1)的去除率均可达到78%,显著高于游离态菌剂。此外,此固定化菌剂可多次重复使用,稳定降解时间长,重复使用10次后,其炔雌醇去除率仍可达53%。固定化香茅醇假单胞菌SJTE-3菌剂降解效能稳定高效,环境适应性高,具有实际修复应用的潜能。

关键词：香茅醇假单胞菌SJTE-3 炔雌醇固定化菌剂海藻酸钙微生物降解

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