检索结果-内蒙古大学图书馆

生物技术通讯 2014年第3期25卷 361-364页

作者：张俨马晴雯上海交通大学医学院上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细... 详细信息

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细胞,以FACS检测GFP基因的表达,RT-qPCR检测GFP、T2A和Neo的表达。结果:由T2A连接的GFP和Neo基因在mRNA水平上都有显著表达,且表达水平相当。结论:以T2A连接的基因在转入细胞后能正常翻译和表达,显示T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能,可作为一种构建多顺反子载体的有效工具用于牛耳皮肤成纤维细胞的基因转移,为其将来在转基因牛研制中的应用奠定了基础。

关键词：多顺反子载体自裂解多肽T2A 牛耳皮肤成纤维细胞

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慢病毒载体转录通读率检测方法的建立

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生物工程学报 2013年第7期29卷 1006-1015页

作者：何佳平方彧聃张帆孙凤强王娟张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方... 详细信息

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法。文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物。两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率。说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持。

关键词：慢病毒载体自灭活慢病毒载体转录通读率安全性

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比较牛催乳素与生长激素对外源基因表达的影响

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中国生物工程杂志 2013年第8期33卷 87-92页

作者：闫亚彬蔡勤蔡琳琳龚秀丽朱怡文管翌华黄英上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市生殖与胚胎工程重点实验室上海200040

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供... 详细信息

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供有价值的理论和技术基础。方法:将构建β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL乳腺特异表达载体分别转染体外培养的转基因小鼠乳腺上皮细胞;并将转染pcDNA3.1质粒和未转染细胞作为对照,收集不同代数的细胞及上清液,用RT-PCR及Elisa法分析mRNA及蛋白,分析比较二者对hTF表达水平的影响。结果:RT-PCR显示人转铁蛋白转录电泳条带明显;Elisa表明二者均能提高hTF蛋白水平的表达。结论:首次应用牛生长激素和催乳素对外源基因表达影响作用进行比较研究;β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL均能促进在乳腺上皮细胞水平上外源蛋白表达。因此,在研制转基因动物———乳腺生物反应器中,采用bGH和bPRL促进乳汁中外源蛋白特异、高效表达的载体都将是可选择的新技术途径。

关键词：牛生长激素牛催乳素人转铁蛋白乳腺生物反应器

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全自动高效液相色谱分析系统在地中海贫血诊断中的应用

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临床儿科杂志 2013年第12期31卷 1138-1142页

作者：夏超然王娟杨为群熊灿王伟上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040 上海交通大学附属儿童医院血液科上海200040

目的探讨全自动高效液相色谱(HPLC)分析检测系统在地中海贫血(地贫)诊断和筛查中的临床应用价值。方法入选100例基因诊断确诊地贫患儿及35例正常儿童,应用HPLC检测系统以及传统碱变性法、醋纤电泳法定量分析HbF和HbA2;并比较不同检测方... 详细信息

目的探讨全自动高效液相色谱(HPLC)分析检测系统在地中海贫血(地贫)诊断和筛查中的临床应用价值。方法入选100例基因诊断确诊地贫患儿及35例正常儿童,应用HPLC检测系统以及传统碱变性法、醋纤电泳法定量分析HbF和HbA2;并比较不同检测方法与相应β地贫基因诊断结果的符合率、敏感性与特异性。结果β地贫74例,64例单杂合子,10例复合杂合子;α地贫26例,1例单杂合子,25例复合杂合子。在地贫患儿和正常儿童中,HPLC法测定的HbF百分含量均高于碱变性法,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC法测得的HbF在α地贫患儿和正常儿童间的差异亦有统计学意义(P=0.011),对α地贫的分辨力高于碱变性法。α地贫患儿,HPLC法测得的HbA2百分含量高于醋纤电泳法,差异有统计学意义(P=0.010);β地贫患儿,HPLC法和醋纤电泳法测得的单杂合子的HbA2含量均高于复合杂合子,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC方法测定HbF-HbA2(≥4.0%)联合MCV(<80 fl)、MCH(<27 pg),与α或β基因诊断的符合率达99.3%,灵敏度和特异度分别为99.0%和100.0%。结论采用HPLC法检测HbA2和HbF,并结合MCV、MCH,与基因诊断结果的符合率、灵敏度和特异度均高,可成为大规模筛查β地贫的一种理想方法。

关键词：地中海贫血血红蛋白电泳高效液相色谱分析

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稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

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生命科学研究 2013年第2期17卷 100-105页

作者：方彧聃何佳平张斯敏王娟任晓叶张金脉张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所中国上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室中国上海200040

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基... 详细信息

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.

关键词： HC11细胞系催乳素慢病毒载体乳腺特异性基因乳腺生物反应器

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attB位点核心区定点突变对φC31整合酶效率的影响

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医学分子生物学杂志 2013年第2期10卷 63-68页

作者：李振海谢飞马晴雯上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基，设计含有相应位点突变的引物，采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB... 详细信息

目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基，设计含有相应位点突变的引物，采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB片段，将其连人含报告基因的载体pEGFP。NI中得到pEGFP—NI—attB。以含野生型attB位点的报告基因载体pEGFP-N1-attB作为对照．将上述载体分别与中φC31整合酶表达质粒共转染HeLa细胞，经过药物筛选、染色、细胞克隆计数后，计算并比较整合效率。结果成功完成9个含有突变碱基attB位点及报告基因载体的构建。酶切及测序鉴定结果显示每个质粒含1或2个突变碱基。其中6个质粒为目标碱基突变，3个为PCR过程中随机产生的非预期突变。细胞实验结果表明，3个含有突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比无显著性差异，其余6个突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比显著降低（P〈0．05），尤其是其中两个attB位点中含有2个碱基突变的报告质粒，整合率降低极为显著（P〈0．001）。结论attB位点核心区碱基保守性较强，其中一些关键位点的突变使得整合酶效率降低。

关键词： attB位点点突变大引物整合率

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用诱导性多能干细胞进行临床治疗的安全考量

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生命科学 2013年第5期25卷 460-466页

作者：张斯敏杨冠恒张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室及上海市胚胎与生殖工程重点实验室

诱导性多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)具有高度相似性。在理论上,iPSCs避免了ESCs无法回避的免疫排斥和伦理问题,为再生医学提供重要的细胞资源,具有广阔的临床治疗前景。然而,为实现其在临床上的应用,还须克服诸多问题,如已发现i... 详细信息

诱导性多能干细胞(iPSCs)和胚胎干细胞(ESCs)具有高度相似性。在理论上,iPSCs避免了ESCs无法回避的免疫排斥和伦理问题,为再生医学提供重要的细胞资源,具有广阔的临床治疗前景。然而,为实现其在临床上的应用,还须克服诸多问题,如已发现iPSCs具有潜在的致瘤性和免疫原性,以及iPSCs在重编程和传代培养过程中发生基因组变异和表观遗传改变的可能性等。就iPSCs临床应用所面临的主要问题进行总结并探讨可能的解决方法。

关键词：诱导性多能干细胞免疫原性基因组变异表观遗传变异致瘤性

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病毒滴度和插入子长度对慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响

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实验动物与比较医学 2013年第3期33卷 185-189页

作者：郭歆冰龚秀丽陈雁雯方彧聃张敬之上海市儿童医院、上海交通大学附属儿童医院、上海医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

目的研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响。方法制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体，通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠，然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率，并对所生成的数据进... 详细信息

目的研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响。方法制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体，通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠，然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率，并对所生成的数据进行统计学分析。结果插入子长度在较短（〈2kb）的情况下，病毒滴度达到2×10^8就可获得较高的整合率，在插入子长度稍长（4-5kb）的情况下，需要1×10^9滴度才能获得较高的整合率，而在插入子长度大于6kb的情况下，未能用该方法获得转基因小鼠。结论滴度的增加能有效提高慢病毒载体制备转基因小鼠的整合率，而当滴度适中（-2×10^8）时，整合率随插入子长度的增加而下降。

关键词：慢病毒载体转基因小鼠整合率滴度插入子长度

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一步法快速构建多片段连接的同源臂载体

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生物技术通讯 2013年第3期24卷 385-389页

作者：张金脉杨冠恒程艳黄英上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海交通大学基础医学院上海200025 上海市胚胎与生殖工程重点实验室暨卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上200040

目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左... 详细信息

目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段，纯化后一起加入一个反应管中，并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液，进行酶切、酶连接共10～50个循环反应，一步构建含同源臂载体的质粒；产物经高温处理后，直接转化感受态细胞，并进行重组子PCR鉴定；对pMD19－T载体进行优化，突变载体上的BsaⅠ酶切位点，把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体，再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明，应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体；用优化后的pMD19－T－O载体体系，在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠，不仅可快速构建某类载体系统，还可对基因进行精确的点突变，该系统可用于快速构建基因打靶载体。

关键词：同源臂多片段酶连接载体构建一步连接法

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可用于基因表达研究的转基因小鼠乳腺上皮细胞模型的构建

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上海交通大学学报（医学版） 2012年第7期32卷 955-960页

作者：蒋世忠闫亚彬谢飞王娟黄英任兆瑞上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海200040 上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海市胚胎与生殖工程重点实验室暨卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海200040

目的建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台。方法通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原... 详细信息

目的建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台。方法通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原代培养。经胰蛋白酶纯化后,绘制乳腺上皮细胞生长曲线;免疫组织化学方法检测角蛋白18的表达;透射电子显微镜(透射电镜)观察乳腺上皮细胞超微结构;流式细胞仪检测细胞周期分布;显微镜下分析乳腺上皮细胞核型。将牛催乳素真核表达载体(pCMV-bPRL)转染至转基因乳腺上皮细胞中,检测外源bPRL的表达。结果乳腺上皮细胞生长曲线呈"S"形;免疫荧光组织化学分析结果显示hTF转基因小鼠乳腺上皮细胞角蛋白18呈阳性表达;透射电镜观察发现乳腺上皮细胞胞核较大、偏位,有双核或多核,胞质丰富,空泡、粗面内质网、高尔基体丰富;流式细胞仪检测结果显示:乳腺上皮细胞增殖活跃,G2/M期+S期细胞占15%;细胞核型分析结果显示处于分裂期的细胞具有正常的二倍体,染色体完整。pCMV-bPRL转染乳腺上皮细胞24 h后,上清液中检测到bPRL的表达。结论体外培养的转基因乳腺上皮细胞具有类似体内细胞的生物学特征,并可表达真核表达载体,为研究环境因素对乳腺功能的影响及制备乳腺生物反应器提供了一种细胞模型。

关键词：转基因小鼠乳腺上皮细胞真核表达载体牛催乳素

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