检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2015年第9期31卷 1279-1288页

作者：张丽萍杨冠恒张敬之上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

自从2006年山中伸弥成功地将小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,i PSCs),i PSCs已成为科学家们研究的热点之一。而i PSCs在为基础研究和再生医学提供了无限可能的同时,相关争论焦点也随之产生... 详细信息

自从2006年山中伸弥成功地将小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,i PSCs),i PSCs已成为科学家们研究的热点之一。而i PSCs在为基础研究和再生医学提供了无限可能的同时,相关争论焦点也随之产生,如i PSCs有可能导致肿瘤已成为其在临床应用前需要进一步证实、面对和解决的问题。目前已经有相关研究人员对i PSCs是否具有潜在致瘤性进行了探索。研究结果表明,i PSCs基因表达谱与癌细胞基因表达谱具有交集,重编程过程中积累了基因损伤,以及在培养过程中的基因突变都是其致瘤性产生的原因之一。研究人员目前已经找到很多减少i PSCs致瘤性的方法,比如优化促重编程因子、筛选表达载体、筛选细胞株等。文中对i PSCs致瘤可能性的原因和如何消除其致瘤性进行了综述。

关键词： iPSCs 致瘤性安全性

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原位染色检测慢病毒载体转录通读方法的建立

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中国生物工程杂志 2015年第5期35卷 55-60页

作者：高越檀硕任兆瑞张敬之上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040 生物治疗协同创新中心四川大学华西医院成都610041

慢病毒载体作为基因导入系统已被多次应用于基因治疗试验当中,近年来受到了广泛关注。转录通读是慢病毒载体应用过程中存在的潜在不安全因素之一。为了进一步完善慢病毒载体转录通读的检测方法,使检测结果更加直观准确,在已建立的在转... 详细信息

慢病毒载体作为基因导入系统已被多次应用于基因治疗试验当中,近年来受到了广泛关注。转录通读是慢病毒载体应用过程中存在的潜在不安全因素之一。为了进一步完善慢病毒载体转录通读的检测方法,使检测结果更加直观准确,在已建立的在转录水平检测其转录通读的基础上,进一步模拟病毒载体整合入基因组的状态,于原病毒载体3'-LTR后插入经密码子优化的Lac Z报告基因。经转染细胞后进行原位染色,发生通读现象的细胞会被染成蓝色,从而在蛋白质水平直观地体现慢病毒载体的通读情况,说明所建立的方法是准确可行的。所得结论与q RTPCR方法在转录水平检测的结果是平行相一致。原位染色检测法的建立为慢病毒载体转录通读的检测、提高慢病毒载体生物安全性的研究提供了技术支持。

关键词：慢病毒载体转录通读原位染色原病毒载体

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3种 DNA 甲基化定量分析方法的比较

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医学分子生物学杂志 2015年第2期12卷 84-89页

作者：路兆宁周在威马晴雯颜景斌上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

目的：比较特定基因区域 DNA 甲基化检测方法的优缺点。方法采用焦磷酸测序、克隆测序和DNA 甲基化芯片等3种 DNA 甲基化检测方法，对7例唐氏综合征和5例正常对照样本的 PRDM8内含子7 CpG 岛中的部分序列进行甲基化检测。从准确度、重... 详细信息

目的：比较特定基因区域 DNA 甲基化检测方法的优缺点。方法采用焦磷酸测序、克隆测序和DNA 甲基化芯片等3种 DNA 甲基化检测方法，对7例唐氏综合征和5例正常对照样本的 PRDM8内含子7 CpG 岛中的部分序列进行甲基化检测。从准确度、重复性和精确度（分辨率）等方面来比较3种方法，探讨哪种方法更适合特定基因的 DNA 甲基化水平定量检测。结果①焦磷酸测序可在单碱基水平定量检测样本的甲基化水平，结果重复性好，准确度高，而且能发现样本中 CpG 位点甲基化水平变化的规律；②克隆测序也可在单碱基水平定量检测样本的甲基化水平，但结果重复性较差，无法发现 CpG 位点甲基化水平变化的规律；③甲基化芯片可通过所测区域的两个探针来判断样本间甲基化水平的差异，但无法在单碱基水平定量检测样本的甲基化水平；④上述3种方法检测结果之间存在一定的差异，但是样本间甲基化水平总体趋势基本一致。此外，唐氏综合征样本的甲基化水平高于正常对照样本。结论焦磷酸测序准确度高、重复性好、费用较低、操作较为简单快捷，更为适合在单碱基水平检测特定基因区域的 DNA 甲基化水平。

关键词：焦磷酸测序克隆测序 DNA 甲基化芯片甲基化修饰

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在宿主细胞内仅有部分慢病毒载体发生了功能性整合

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医学分子生物学杂志 2015年第4期12卷 187-191页

作者：张丽萍高越檀硕张敬之上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室、上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

目的研究慢病毒在感染细胞后，是否全部整合入染色体。方法用慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后．抽提培养2d和10d的细胞基因组DNA。通过定量PCR检测细胞基因组中LTR拷贝数，计算出整合率。分别取病毒感染3d和11d的细胞，离心重悬后取... 详细信息

目的研究慢病毒在感染细胞后，是否全部整合入染色体。方法用慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后．抽提培养2d和10d的细胞基因组DNA。通过定量PCR检测细胞基因组中LTR拷贝数，计算出整合率。分别取病毒感染3d和11d的细胞，离心重悬后取部分细胞放在荧光显微镜下拍照，在蛋白水平上验证此结论。结果①慢病毒载体在宿主细胞基因组内的平均整合率（47±16）％（n=10）；②细胞感染慢病毒后3d和11d的GFP照片也证实了慢病毒在宿主细胞基因组内部分整合。结论慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后，仅有部分的载体骨架是整合人基因组中的，整合入293T细胞基因组中的外源基因能够较长时间稳定表达。

关键词：慢病毒载体基因治疗转染整合

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唐氏综合征中DNA羟甲基化/甲基化修饰对PRDM8的表达调控

唐氏综合征中DNA羟甲基化/甲基化修饰对PRDM8的表达调控

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：路兆宁邱家俊刘艳娜马晴雯颜景斌黄淑帧上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海市胚胎与生殖工程重点实验室卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室

目的:以与唐氏综合征(Down Syndrome,DS)患者神经系统发育相关的PRDM8(PR domain containing 8,正性调节区锌指蛋白8)为研究目标,阐释DS患者外周血中羟甲基化/甲基化修饰对该基因表达的调控作用。方法:首先建立了基于KRuO4氧化、亚硫酸... 详细信息

目的:以与唐氏综合征(Down Syndrome,DS)患者神经系统发育相关的PRDM8(PR domain containing 8,正性调节区锌指蛋白8)为研究目标,阐释DS患者外周血中羟甲基化/甲基化修饰对该基因表达的调控作用。方法:首先建立了基于KRuO4氧化、亚硫酸盐转化和焦磷酸测序技术的5羟甲基胞嘧啶(5hmC)和5甲基胞嘧啶(5mC)的定量检测方法一oxBS-pyrosequencing,可进行单碱基分辨率水平的检测。并对氧化剂的浓度、氧化温度和亚硫酸氢盐转化的处理时间进行了优化,在上述技术基础上,对1 6个DS和1 9个正常儿童外周血样本中PRDM8不同区域CpG岛的5hmC/5mC进行了定量检测,并分析了其与PRDM8两个转录本表达水平的相关性。随后,采用qRT-PCR对上述样本中的羟甲基化/甲基化修饰酶TET和DNMT(DNAmethyltransferase)的表达进行了定量分析,并探讨了修饰酶的表达与5hmC/5mC水平及PRDM8表达的相关性。结果:通过优化实验条件,本研究中所建立的oxBS-pyrosequencing方法的转换效率(5hmC→U)达到了91.33%。与正常对照相比,DS样本中PRDM8的羟甲基化/甲基化修饰水平明显升高,5hmC/5mC差异修饰区域主要位于PRDM8内部启动子区。内部启动子区5hmC的升高与对应的转录本2表达上调有明显的相关性,基因内部5mC升高则与转录本1的PRDM8表达正相关。DS外周血中5mC修饰差异水平与DNMT3A的表达水平呈正相关,而在正常对照样本中两者之间无相关性。结论:本研究建立了可在单碱基分辨率同时精确检测5hmC和5mC水平的oxBS-pyrosequencing技术平台。DS患儿外周血样本PRDM8内部启动子区存在与基因表达相关的特征性5hmC/5mC差异修饰。

关键词：甲基化修饰唐氏综合征羟甲基化 PRDM8 DNA

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应用ROC曲线比较地中海贫血筛查的定量分析方法

应用ROC曲线比较地中海贫血筛查的定量分析方法

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：夏超然任兆瑞上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:用受试工作者曲线(ROC)评价血液生化指标HbF、HbA2在儿童地中海贫血筛查和诊断中的临床应用价值。方法:分别应用传统检测方法和HPLC检测系统对疑似地贫样本和正常对照样本进行血红蛋白分子HbF和HbA2的定量分析,同时采用PCR法和反... 详细信息

目的:用受试工作者曲线(ROC)评价血液生化指标HbF、HbA2在儿童地中海贫血筛查和诊断中的临床应用价值。方法:分别应用传统检测方法和HPLC检测系统对疑似地贫样本和正常对照样本进行血红蛋白分子HbF和HbA2的定量分析,同时采用PCR法和反向点杂交技术对所有样本检测常见的a珠蛋白基因缺失和b珠蛋白基因突变位点,以基因检测为金标准对筛查结果进行验证。其中,正常对照样本62例,经基因诊断确诊的α地贫个体66例,β地贫个体146例。应用ROC曲线分析方法,分析HbF、HbA2两个指标曲线下面积,选择不同切值对应的敏感度和特异度,比较两种方法优缺点,确定可行筛查方案。结果:α地贫组HbF和HbA2两个指标对应的ROC曲线下面积低于0.7,对α地贫的筛查意义不大。HbF指标仅在判断β地贫时有差异,筛查β地贫时,HPLC法测定HbF的最佳临界值为1.05,其对应的敏感度为0.932、特异度为0.597,均高于碱变性测定HbF的最佳临界值为0.805处对应的敏感度和特异度。HPLC法定量测定HbA2的最佳临界值为3.75,其对应的敏感度为0.993、特异度为0.952,均高于血红蛋白电泳法测定HbA2的最佳临界值为2.85处对应的敏感度和特异度。HPLC定量测定HbF和HbA2两个指标在筛查地中海贫血时的曲线下面积均大于经典方法定量测定HbF、HbA2。结论:HPLC法定量测定HbF、HbA2的敏感度和特异度高于经典定量方法,HPLC定量检测HbA2对β地贫的诊断效果最好。为减少漏诊及误诊,采用相应指标的切值HbF(≥1.1)、HbA2(≥3.75)进行地贫筛查时与血液学指标联合检测,可以有效提高β地贫的筛查效率。

关键词：地中海贫血筛查敏感度曲线下面积 HbF 特异度定量测定最佳临界值 ROC 定量分析方法

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一例巨轴索神经病患者中发现巨轴突蛋白基因两种新型致病突变

一例巨轴索神经病患者中发现巨轴突蛋白基因两种新型致病突变

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：王娟马晴雯蔡勤刘艳娜王伟任兆瑞上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的：寻找1例疑似巨轴索神经病患者的致病突变位点,为疾病诊断提供科学资料.方法：应用目标序列捕获测序技术对患者进行遗传筛查,找到巨轴突蛋白基因(Gigaxonin,GAN)的可疑致病突变位点.同时,提取患者父母的外周血DNA,进行Sanger测序验...

目的：寻找1例疑似巨轴索神经病患者的致病突变位点,为疾病诊断提供科学资料.方法：应用目标序列捕获测序技术对患者进行遗传筛查,找到巨轴突蛋白基因(Gigaxonin,GAN)的可疑致病突变位点.同时,提取患者父母的外周血DNA,进行Sanger测序验证.此外,应用生物信息学软件Polyphen对突变巨轴突蛋白进行了功能预测.结果：在患者GAN基因中鉴定出2种新型突变：c.778 G＞T(***260Ter)和c.277G＞A(***93Arg),为复合杂合突变;Sanger测序证实c.778 G＞T(***260Ter)突变源于父方,c.277G＞A(***93Arg)突变则与母亲相同.生物信息学分析预测这两种新型GAN突变均可引发巨轴突蛋白功能异常.结论：研究鉴定出了患者巨轴突蛋白基因的两种新型突变,它们均可能引起巨轴突蛋白结构和功能的异常,从而导致疾病的发生,为日后类似疾病的诊断提供了依据.

关键词：

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—例巨轴索神经病患者中发现巨轴突蛋白基因两种新型致病突变

—例巨轴索神经病患者中发现巨轴突蛋白基因两种新型致病突变

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第十四次全国医学遗传学学术会议

目的:寻找1例疑似巨轴索神经病患者的致病突变位点,为疾病诊断提供科学资料。方法:应用目标序列捕获测序技术对患者进行遗传筛查,找到巨轴突蛋白基因(Gigaxonin,GAN)的可疑致病突变位点。同时,提取患者父母的外周血DNA,进行Sanger测序... 详细信息

目的:寻找1例疑似巨轴索神经病患者的致病突变位点,为疾病诊断提供科学资料。方法:应用目标序列捕获测序技术对患者进行遗传筛查,找到巨轴突蛋白基因(Gigaxonin,GAN)的可疑致病突变位点。同时,提取患者父母的外周血DNA,进行Sanger测序验证。此外,应用生物信息学软件Polyphen对突变巨轴突蛋白进行了功能预测。结果:在患者GAN基因中鉴定出2种新型突变:c.778 G>T(***260Ter)和c.277G>A(***93Arg),为复合杂合突变;Sanger测序证实c.778 G>T(***260Ter)突变源于父方,c.277G>A(***93Arg)突变则与母亲相同。生物信息学分析预测这两种新型GAN突变均可引发巨轴突蛋白功能异常。结论:研究鉴定出了患者巨轴突蛋白基因的两种新型突变,它们均可能引起巨轴突蛋白结构和功能的异常,从而导致疾病的发生,为日后类似疾病的诊断提供了依据。

关键词：巨轴突突变位点

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仅有部分慢病毒载体在宿主细胞内发生了功能性整合

仅有部分慢病毒载体在宿主细胞内发生了功能性整合

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：张丽萍高越蔡勤张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:慢病毒载体是以慢病毒为基本骨架,经功能性删减和拆分制备而成只具备一次性感染和整合能力的病毒载体。因此,理论上慢病毒载体的基本生理特性应遗传了其来源病毒的特征。一般认为,慢病毒在感染细胞后,仅有部分骨架是以整合入染色... 详细信息

目的:慢病毒载体是以慢病毒为基本骨架,经功能性删减和拆分制备而成只具备一次性感染和整合能力的病毒载体。因此,理论上慢病毒载体的基本生理特性应遗传了其来源病毒的特征。一般认为,慢病毒在感染细胞后,仅有部分骨架是以整合入染色体的形式存在的。然而,慢病毒载体是否遗传了这一特点未见文献报导。本文旨在研究慢病毒载体在感染细胞后,是否全部整合入染色体。方法:用慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后,通过细胞传代来稀释未整合的慢病毒载体原病毒。在此基础上,分别抽提培养2天和10天(分裂了103次)的细胞基因组DNA。通过定量PCR检测细胞基因组中的LTR拷贝数,计算出整合率。分别取病毒感染3天和11天的细胞,离心重悬后,取部分细胞放在荧光显微镜下拍照,在蛋白水平上验证此结论。结果:慢病毒载体在宿主细胞基因组内的平均整合率为47±16%(n=10)。细胞感染慢病毒载体假病毒3天和11天以后的GFP照片也证实了慢病毒载体在293T宿主细胞基因组内部分整合。结论:慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后,仅有部分的载体骨架是整合入基因组中的,整合入293T细胞基因组中的外源基因能够较长时间地稳定表达。

关键词：慢病毒载体病毒感染功能性

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Tet2与K562细胞中γ-globin激活表达之间的关系研究

Tet2与K562细胞中γ-globin激活表达之间的关系研究

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：路兆宁马晴雯曾凡一上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学医学院基础医学院卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:探讨羟甲基化酶Tet2(member of ten-eleven translocation family)在药物诱导K562细胞中γ-globin激活表达这一过程中发挥的作用以及可能的作用机制。方法:在K562细胞中转染shRNA表达质粒以下调Tet2的表达,同时在培养液中加氯化高... 详细信息

目的:探讨羟甲基化酶Tet2(member of ten-eleven translocation family)在药物诱导K562细胞中γ-globin激活表达这一过程中发挥的作用以及可能的作用机制。方法:在K562细胞中转染shRNA表达质粒以下调Tet2的表达,同时在培养液中加氯化高铁血红素(Hemin)或5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导K562细胞大量表达γ-globin。用氧化亚硫酸氢盐(oxidative bisulfite)将K562细胞基因组DNA处理后,PCR扩增γ-globin gene body上CpG位点相对密集区域,连接到T-vector克隆,测序后统计该区域甲基化和羟甲基化DNA所占的比例。以realtime PCR的方法检测这一过程中相关红系特异性转录因子与Tet2的表达量。结果:在γ-globin激活表达的过程中Tet2本身的表达量无显著性差异,但Tet2下调会抑制抑制药物诱导γ-globin激活的效率。γ-globin gene body上CpG位点的甲基化/羟甲基化修饰率几乎为0。关键红系转录因子GATA1和NFE4都随着Tet2的下调而下调,KLF1随着Tet2的下调反而有所上调。结论:Tet2在K562细胞γ-globin激活表达的过程中发挥作用,且相比其直接催化γ-globin DNA羟甲基化的功能而言,其作用的途径更有可能是调节转录因子的表达或与DNA的结合。

关键词：羟甲基化 globin

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