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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：王娟马晴雯蔡勤刘艳娜王伟任兆瑞上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:寻找1例疑似巨轴索神经病患者的致病突变位点,为疾病诊断提供科学资料。方法:应用目标序列捕获测序技术对患者进行遗传筛查,找到巨轴突蛋白基因(Gigaxonin,GAN)的可疑致病突变位点。同时,提取患者父母的外周血DNA,进行Sanger测序... 详细信息

目的:寻找1例疑似巨轴索神经病患者的致病突变位点,为疾病诊断提供科学资料。方法:应用目标序列捕获测序技术对患者进行遗传筛查,找到巨轴突蛋白基因(Gigaxonin,GAN)的可疑致病突变位点。同时,提取患者父母的外周血DNA,进行Sanger测序验证。此外,应用生物信息学软件Polyphen对突变巨轴突蛋白进行了功能预测。结果:在患者GAN基因中鉴定出2种新型突变:c.778 G>T(***260Ter)和c.277G>A(***93Arg),为复合杂合突变;Sanger测序证实c.778 G>T(***260Ter)突变源于父方,c.277G>A(***93Arg)突变则与母亲相同。生物信息学分析预测这两种新型GAN突变均可引发巨轴突蛋白功能异常。结论:研究鉴定出了患者巨轴突蛋白基因的两种新型突变,它们均可能引起巨轴突蛋白结构和功能的异常,从而导致疾病的发生,为日后类似疾病的诊断提供了依据。

关键词：巨轴突突变位点

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仅有部分慢病毒载体在宿主细胞内发生了功能性整合

仅有部分慢病毒载体在宿主细胞内发生了功能性整合

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：张丽萍高越蔡勤张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:慢病毒载体是以慢病毒为基本骨架,经功能性删减和拆分制备而成只具备一次性感染和整合能力的病毒载体。因此,理论上慢病毒载体的基本生理特性应遗传了其来源病毒的特征。一般认为,慢病毒在感染细胞后,仅有部分骨架是以整合入染色... 详细信息

目的:慢病毒载体是以慢病毒为基本骨架,经功能性删减和拆分制备而成只具备一次性感染和整合能力的病毒载体。因此,理论上慢病毒载体的基本生理特性应遗传了其来源病毒的特征。一般认为,慢病毒在感染细胞后,仅有部分骨架是以整合入染色体的形式存在的。然而,慢病毒载体是否遗传了这一特点未见文献报导。本文旨在研究慢病毒载体在感染细胞后,是否全部整合入染色体。方法:用慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后,通过细胞传代来稀释未整合的慢病毒载体原病毒。在此基础上,分别抽提培养2天和10天(分裂了103次)的细胞基因组DNA。通过定量PCR检测细胞基因组中的LTR拷贝数,计算出整合率。分别取病毒感染3天和11天的细胞,离心重悬后,取部分细胞放在荧光显微镜下拍照,在蛋白水平上验证此结论。结果:慢病毒载体在宿主细胞基因组内的平均整合率为47±16%(n=10)。细胞感染慢病毒载体假病毒3天和11天以后的GFP照片也证实了慢病毒载体在293T宿主细胞基因组内部分整合。结论:慢病毒载体的假病毒感染293T细胞后,仅有部分的载体骨架是整合入基因组中的,整合入293T细胞基因组中的外源基因能够较长时间地稳定表达。

关键词：慢病毒载体病毒感染功能性

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Tet2与K562细胞中γ-globin激活表达之间的关系研究

Tet2与K562细胞中γ-globin激活表达之间的关系研究

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：路兆宁马晴雯曾凡一上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学医学院基础医学院卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:探讨羟甲基化酶Tet2(member of ten-eleven translocation family)在药物诱导K562细胞中γ-globin激活表达这一过程中发挥的作用以及可能的作用机制。方法:在K562细胞中转染shRNA表达质粒以下调Tet2的表达,同时在培养液中加氯化高... 详细信息

目的:探讨羟甲基化酶Tet2(member of ten-eleven translocation family)在药物诱导K562细胞中γ-globin激活表达这一过程中发挥的作用以及可能的作用机制。方法:在K562细胞中转染shRNA表达质粒以下调Tet2的表达,同时在培养液中加氯化高铁血红素(Hemin)或5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导K562细胞大量表达γ-globin。用氧化亚硫酸氢盐(oxidative bisulfite)将K562细胞基因组DNA处理后,PCR扩增γ-globin gene body上CpG位点相对密集区域,连接到T-vector克隆,测序后统计该区域甲基化和羟甲基化DNA所占的比例。以realtime PCR的方法检测这一过程中相关红系特异性转录因子与Tet2的表达量。结果:在γ-globin激活表达的过程中Tet2本身的表达量无显著性差异,但Tet2下调会抑制抑制药物诱导γ-globin激活的效率。γ-globin gene body上CpG位点的甲基化/羟甲基化修饰率几乎为0。关键红系转录因子GATA1和NFE4都随着Tet2的下调而下调,KLF1随着Tet2的下调反而有所上调。结论:Tet2在K562细胞γ-globin激活表达的过程中发挥作用,且相比其直接催化γ-globin DNA羟甲基化的功能而言,其作用的途径更有可能是调节转录因子的表达或与DNA的结合。

关键词：羟甲基化 globin

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表观遗传修饰改变与线粒体疾病

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医学分子生物学杂志 2015年第1期12卷 30-34页

作者：危新俊颜景斌上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学附属儿童医院上海市200040 温州医科大学检验医学院、生命科学学院浙江省温州市325035 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

线粒体功能失调是导致线粒体疾病的主要原因，因此了解线粒体功能的调节机制非常重要。近期的研究表明，表观遗传修饰的对象不仅包括细胞核DNA还包括线粒体DNA，表观遗传修饰的变化对线粒体功能的调节机制有重要影响。文章主要概括了线... 详细信息

线粒体功能失调是导致线粒体疾病的主要原因，因此了解线粒体功能的调节机制非常重要。近期的研究表明，表观遗传修饰的对象不仅包括细胞核DNA还包括线粒体DNA，表观遗传修饰的变化对线粒体功能的调节机制有重要影响。文章主要概括了线粒体DNA甲基化、细胞核基因组的DNA甲基化和微RNA（microRNA，miRNA）调控等表观遗传修饰与线粒体疾病发生的关联研究进展。

关键词：线粒体疾病表观遗传学 DNA甲基化线粒体DNA甲基化 miRNA

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综合应用高分辨率熔解曲线分析和焦磷酸测序技术快速筛查分析线粒体糖尿病的MT3243A>G突变

综合应用高分辨率熔解曲线分析和焦磷酸测序技术快速筛查分析线粒...

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第十四次全国医学遗传学学术会议

作者：危新俊杜秀娟王从容颜景斌上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学附属第六人民医院上海市第六人民医院上海市糖尿病研究所上海市胚胎与生殖工程重点实验室卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室

目的:建立快速、准确、无创、低成本的线粒体糖尿病MT3243A>G位点突变的筛查方法。方法:为了比较哪种来源的样本更适合进行人群中MT3243A>G突变位点的快速筛查,本研究采集已确诊的6例线粒体糖尿病患者及50例正常对照的血液、唾液... 详细信息

目的:建立快速、准确、无创、低成本的线粒体糖尿病MT3243A>G位点突变的筛查方法。方法:为了比较哪种来源的样本更适合进行人群中MT3243A>G突变位点的快速筛查,本研究采集已确诊的6例线粒体糖尿病患者及50例正常对照的血液、唾液及尿沉渣样本,采用焦磷酸测序方法检测并比较不同来源样本中MT3243A>G突变位点的杂合度水平,每个样本重复3次实验。收集来自于上海市4个社区的糖尿病患者尿沉渣样本,共计1 070例,应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve method,HRM)对MT3243A>G突变位点进行快速筛查,阳性样本进一步采用焦磷酸测序技术进行验证,并定量检测MT3243A>G突变位点的杂合度水平。结果:焦磷酸测序结果显示,6例线粒体糖尿病患者尿沉渣中MT3243A>G突变位点的杂合度均高于唾液和血液2倍以上,唾液中突变杂合度略高于血液;50例正常对照的血液、唾液及尿沉渣样本中均未检出MT3243A>G位点突变。由于尿沉渣样本可通过常规检查获取,且突变杂合度最高,因此我们决定采用尿沉渣样本作为后续人群筛查实验的取材对象。通过HRM分析,在1070例糖尿病尿沉渣样本中筛查出2例疑似MT3243A>G位点突变的样本,其熔解曲线与已知MT3243A>G位点突变的样本一致。进一步经焦磷酸测序验证,确定他们为MT3243A>G位点突变。焦磷酸测序定量分析的结果显示,两个患者尿沉渣样本中MT3243A>G位点杂合度分别为33.32%和1 4.67%。结论:尿沉渣样本取材方便、无创、突变杂合度高,可以作为人群中线粒体糖尿病MT3243A>G位点突变筛查的首选样本。HRM技术使用成本低,可以实现点突变的快速筛查。焦磷酸测序技术检测灵敏度高、定量精确。本研究中将两者的优势相结合,建立了两步法快速筛查检测线粒体糖尿病MT3243A>G位点突变的方法,并在大样本人群中得到了有效的应用,为线粒体糖尿病的早期诊断提供了可靠的方法。

关键词：线粒体糖尿病点突变焦磷酸测序技术 MT3243A>G 高分辨率熔解曲线分析快速筛查

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基因印记与lncRNA

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中国生物工程杂志 2014年第7期34卷 63-68页

作者：邱家俊颜景斌上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学附属儿童医院卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

基因印记是一种表观遗传调控机制,在二倍体哺乳动物的发育过程中,基因印记可以调控来自亲代的等位基因差异表达。非编码RNA是不编码蛋白质的RNA,它在RNA水平调控基因表达。研究表明大多数印记基因中存在长非编码RNA(长度>200nt的非编... 详细信息

基因印记是一种表观遗传调控机制,在二倍体哺乳动物的发育过程中,基因印记可以调控来自亲代的等位基因差异表达。非编码RNA是不编码蛋白质的RNA,它在RNA水平调控基因表达。研究表明大多数印记基因中存在长非编码RNA(长度>200nt的非编码RNA)的转录,长非编码RNA主要通过顺式的转录干扰作用来实现基因印记。同时基因印记及其相关的长非编码RNA异常表达与许多先天疾病相关,迄今已发现数十种人类遗传疾病与基因印记有关,而lncRNA引起的基因印记在疾病的发生和治疗中起着重要作用。

关键词：基因印记长非编码RNA 疾病

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乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

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中国生物工程杂志 2014年第7期34卷 49-55页

作者：张斯敏高越方彧聃张金脉张敬之上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室及上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现... 详细信息

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。

关键词：乳腺生物反应器 Cre loxP系统特异表达报告基因lacZ

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临床基因治疗及其载体的研究进展

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国际遗传学杂志 2014年第1期37卷 29-36页

作者：高越张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室

自1989实施年第一例临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定... 详细信息

自1989实施年第一例临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定表达系统。目前基因治疗常使用病毒和非病毒载体,其中,病毒载体在临床基因治疗过程中得到更广泛地使用。文中总结了一些重要的临床基因治疗的病例,并对其相应的基因导入系统作一综述。

关键词：临床实验基因治疗病毒载体非病毒载体

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哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存研究进展：现存问题与未来展望

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中国科学：生命科学 2014年第7期44卷 663-675页

作者： MOUSSA Mahmoud 舒娟张雪洪曾凡一上海交通大学附属儿童医院、上海市儿童医院、上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海交通大学生命科学技术学院、生物工程系上海200240 上海市胚胎与生殖工程重点实验室、卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海200040 上海滔滔转基因工程股份有限公司上海201604 Department of Theriogenology Faculty of Veterinary Medicine Suez Canal University Ismallia 41522 Egypt 上海交通大学医学院、医学科学研究院发育生物学研究室上海200025

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据... 详细信息

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据,并成为体外受精不可缺少的环节.尽管哺乳动物卵母细胞和胚胎的冷冻保存技术的研发和应用取得了巨大进展,例如为可能不育的患者贮藏生殖潜能、卵子冻存库的建立以及卵母细胞和胚胎的跨国运输,但成功率仍达不到使用新鲜卵母细胞和胚胎的水平,还存在许多难题有待解决.本文针对低温保存技术中制约冷冻效率和成功率的主要问题进行了综述,旨在解决技术研发中遇到的瓶颈,为改进技术提供借鉴和参考,鼓励低温生物学研究者继续开展深入研究,加快推进冷冻保存技术在人类和动物辅助生殖技术中的实际应用.

关键词：冷冻保存哺乳动物卵母细胞胚胎问题

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位点特异整合型微环DNA的构建及应用

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中国医药生物技术 2014年第1期9卷 13-19页

作者：刘浏周在威马晴雯上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所 200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后... 详细信息

目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后插入ΦC31整合酶基因表达盒,构建可获得微环DNA的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL和λattR序列可在LR克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及attB位点的微环DNA。以限制性内切酶酶切、定性以及定量PCR分析其重组效率。并将未经纯化的LR重组体系转染HeLa细胞,以流式细胞技术、克隆计数、ELISA等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平,并与传统质粒进行比较。结果 LR克隆酶可有效催化亲本质粒的重组,重组率达80%以上。重组体系中的微环DNA和微质粒无需纯化即可成功转染HeLa细胞,且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒。结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA的方法。

关键词：微环DNA LR克隆酶 Ф31整合酶位点特异性整合

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