检索结果-内蒙古大学图书馆

中国科学：生命科学 2014年第7期44卷 663-675页

作者： MOUSSA Mahmoud 舒娟张雪洪曾凡一上海交通大学附属儿童医院、上海市儿童医院、上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海交通大学生命科学技术学院、生物工程系上海200240 上海市胚胎与生殖工程重点实验室、卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海200040 上海滔滔转基因工程股份有限公司上海201604 Department of Theriogenology Faculty of Veterinary Medicine Suez Canal University Ismallia 41522 Egypt 上海交通大学医学院、医学科学研究院发育生物学研究室上海200025

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据... 详细信息

在过去的几十年中,哺乳动物卵母细胞和胚胎冷冻保存技术因在辅助生殖技术及实际生产中应用广泛,其研究发展尤为迅速.多个物种(包括人)的卵母细胞和胚胎冷冻保存研究获得了受孕和活产的成功佐证,为冷冻保存技术的临床应用提供了理论依据,并成为体外受精不可缺少的环节.尽管哺乳动物卵母细胞和胚胎的冷冻保存技术的研发和应用取得了巨大进展,例如为可能不育的患者贮藏生殖潜能、卵子冻存库的建立以及卵母细胞和胚胎的跨国运输,但成功率仍达不到使用新鲜卵母细胞和胚胎的水平,还存在许多难题有待解决.本文针对低温保存技术中制约冷冻效率和成功率的主要问题进行了综述,旨在解决技术研发中遇到的瓶颈,为改进技术提供借鉴和参考,鼓励低温生物学研究者继续开展深入研究,加快推进冷冻保存技术在人类和动物辅助生殖技术中的实际应用.

关键词：冷冻保存哺乳动物卵母细胞胚胎问题

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位点特异整合型微环DNA的构建及应用

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中国医药生物技术 2014年第1期9卷 13-19页

作者：刘浏周在威马晴雯上海交通大学附属儿童医院上海市儿童医院上海交通大学医学遗传研究所 200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后... 详细信息

目的联合应用LR克隆酶和链霉菌噬菌体ΦC31整合酶系统,建立一种获得位点特异整合型微环DNA的方法,为该载体在转基因研究中的应用提供科学资料。方法应用分子克隆技术,在目的基因表达盒及链霉菌attB位点两端接入λattR和λattL片段,随后插入ΦC31整合酶基因表达盒,构建可获得微环DNA的亲本质粒。该亲本质粒上的λattL和λattR序列可在LR克隆酶的催化下重组生成表达ΦC31整合酶的微质粒和含有目的基因表达盒及attB位点的微环DNA。以限制性内切酶酶切、定性以及定量PCR分析其重组效率。并将未经纯化的LR重组体系转染HeLa细胞,以流式细胞技术、克隆计数、ELISA等方法检测其转染率、整合率及目的蛋白表达水平,并与传统质粒进行比较。结果 LR克隆酶可有效催化亲本质粒的重组,重组率达80%以上。重组体系中的微环DNA和微质粒无需纯化即可成功转染HeLa细胞,且其转染率、整合率以及目的蛋白表达水平均高于传统质粒。结论建立了一种高效、快速获得位点特异整合型微环DNA的方法。

关键词：微环DNA LR克隆酶 Ф31整合酶位点特异性整合

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利用自裂解多肽T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因共同表达

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生物技术通讯 2014年第3期25卷 361-364页

作者：张俨马晴雯上海交通大学医学院上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细... 详细信息

目的:探讨利用自裂解多肽2A构建的多顺反子载体能否在牛耳皮肤成纤维细胞中实现多基因的有效表达。方法:利用来自一点褐翅蛾病毒(TaV)的2A元件(T2A)将GFP和Neo基因连接到同一载体中,构建pCMV-GFP-T2A-Neo质粒,将其转染牛耳皮肤成纤维细胞,以FACS检测GFP基因的表达,RT-qPCR检测GFP、T2A和Neo的表达。结果:由T2A连接的GFP和Neo基因在mRNA水平上都有显著表达,且表达水平相当。结论:以T2A连接的基因在转入细胞后能正常翻译和表达,显示T2A在牛耳皮肤成纤维细胞中具有自裂解功能,可作为一种构建多顺反子载体的有效工具用于牛耳皮肤成纤维细胞的基因转移,为其将来在转基因牛研制中的应用奠定了基础。

关键词：多顺反子载体自裂解多肽T2A 牛耳皮肤成纤维细胞

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临床基因治疗及其载体的研究进展

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国际遗传学杂志 2014年第1期37卷 29-36页

作者：高越张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室

自1989实施年第一例临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定... 详细信息

自1989实施年第一例临床基因治疗实验以来,全球有超过1900例基因治疗方案正在进行或已经完成。人类基因治疗在治疗癌症、遗传病、心血管病等各类疾病中取得了长足的进步,同时也遇到了一些困难。需要既有效且无毒副作用的基因导入和稳定表达系统。目前基因治疗常使用病毒和非病毒载体,其中,病毒载体在临床基因治疗过程中得到更广泛地使用。文中总结了一些重要的临床基因治疗的病例,并对其相应的基因导入系统作一综述。

关键词：临床实验基因治疗病毒载体非病毒载体

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慢病毒载体转录通读率检测方法的建立

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生物工程学报 2013年第7期29卷 1006-1015页

作者：何佳平方彧聃张帆孙凤强王娟张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方... 详细信息

慢病毒载体作为一种有效的生物研究和基因治疗载体,近年来正受到广泛关注,而转录通读现象则是限制其被使用的主要生物安全性瓶颈之一。为了评估慢病毒载体在整合入染色体后的转录通读的实际情况,需要建立一种有效的检测转录通读率的方法。文中运用分子生物学等手段,将相关质粒瞬时转染入293T细胞,模拟野生型和自灭活型慢病毒载体整合入染色体后的情况,利用实时荧光定量PCR分别定量转录通读和总转录本在慢病毒载体上的特征序列,并计算出转录通读率;同时使用流式细胞计数等技术,检测转录通读后的GFP蛋白产物。两种检测结果均与理论相符,即自灭活型载体具有更高的转录通读率。说明文中所建立的方法有效可靠,为进一步评估和降低慢病毒载体的转录通读率,提高慢病毒载体的生物安全性的研究提供技术支持。

关键词：慢病毒载体自灭活慢病毒载体转录通读率安全性

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比较牛催乳素与生长激素对外源基因表达的影响

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中国生物工程杂志 2013年第8期33卷 87-92页

作者：闫亚彬蔡勤蔡琳琳龚秀丽朱怡文管翌华黄英上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市生殖与胚胎工程重点实验室上海200040

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供... 详细信息

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供有价值的理论和技术基础。方法:将构建β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL乳腺特异表达载体分别转染体外培养的转基因小鼠乳腺上皮细胞;并将转染pcDNA3.1质粒和未转染细胞作为对照,收集不同代数的细胞及上清液,用RT-PCR及Elisa法分析mRNA及蛋白,分析比较二者对hTF表达水平的影响。结果:RT-PCR显示人转铁蛋白转录电泳条带明显;Elisa表明二者均能提高hTF蛋白水平的表达。结论:首次应用牛生长激素和催乳素对外源基因表达影响作用进行比较研究;β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL均能促进在乳腺上皮细胞水平上外源蛋白表达。因此,在研制转基因动物———乳腺生物反应器中,采用bGH和bPRL促进乳汁中外源蛋白特异、高效表达的载体都将是可选择的新技术途径。

关键词：牛生长激素牛催乳素人转铁蛋白乳腺生物反应器

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全自动高效液相色谱分析系统在地中海贫血诊断中的应用

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临床儿科杂志 2013年第12期31卷 1138-1142页

作者：夏超然王娟杨为群熊灿王伟上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040 上海交通大学附属儿童医院血液科上海200040

目的探讨全自动高效液相色谱(HPLC)分析检测系统在地中海贫血(地贫)诊断和筛查中的临床应用价值。方法入选100例基因诊断确诊地贫患儿及35例正常儿童,应用HPLC检测系统以及传统碱变性法、醋纤电泳法定量分析HbF和HbA2;并比较不同检测方... 详细信息

目的探讨全自动高效液相色谱(HPLC)分析检测系统在地中海贫血(地贫)诊断和筛查中的临床应用价值。方法入选100例基因诊断确诊地贫患儿及35例正常儿童,应用HPLC检测系统以及传统碱变性法、醋纤电泳法定量分析HbF和HbA2;并比较不同检测方法与相应β地贫基因诊断结果的符合率、敏感性与特异性。结果β地贫74例,64例单杂合子,10例复合杂合子;α地贫26例,1例单杂合子,25例复合杂合子。在地贫患儿和正常儿童中,HPLC法测定的HbF百分含量均高于碱变性法,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC法测得的HbF在α地贫患儿和正常儿童间的差异亦有统计学意义(P=0.011),对α地贫的分辨力高于碱变性法。α地贫患儿,HPLC法测得的HbA2百分含量高于醋纤电泳法,差异有统计学意义(P=0.010);β地贫患儿,HPLC法和醋纤电泳法测得的单杂合子的HbA2含量均高于复合杂合子,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC方法测定HbF-HbA2(≥4.0%)联合MCV(<80 fl)、MCH(<27 pg),与α或β基因诊断的符合率达99.3%,灵敏度和特异度分别为99.0%和100.0%。结论采用HPLC法检测HbA2和HbF,并结合MCV、MCH,与基因诊断结果的符合率、灵敏度和特异度均高,可成为大规模筛查β地贫的一种理想方法。

关键词：地中海贫血血红蛋白电泳高效液相色谱分析

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哺乳动物乳腺上皮细胞的研究和应用

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实验动物与比较医学 2013年第3期33卷 237-242页

作者：闫亚彬黄英上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海200040

转基因动物一乳腺生物反应器的研制是近十多年发展起来的一项生物制药方法，具有巨大的应用前景。外源目的基因载体的构建是制备转基因动物一乳腺生物反应器成功的关键技术环节，因此建立简单、快捷检测外源基因载体构建的合理性和表达... 详细信息

转基因动物一乳腺生物反应器的研制是近十多年发展起来的一项生物制药方法，具有巨大的应用前景。外源目的基因载体的构建是制备转基因动物一乳腺生物反应器成功的关键技术环节，因此建立简单、快捷检测外源基因载体构建的合理性和表达情况的方法至关重要。由于乳腺上皮细胞能较真实反映哺乳动物乳腺生长发育及泌乳的各项生理功能，开展体外培养哺乳动物乳腺上皮细胞，可作为转基因动物制备过程中载体有效性检验的一种体外模型途径。本文将对哺乳动物乳腺组织的结构和乳腺上皮细胞体外培养的增殖能力、诱导、维持分化的特点，以及乳腺上皮细胞的培养和它在生物、医学领域中的应用研究进行简要概述。

关键词：乳腺生物反应器基因载体乳腺上皮细胞体外检测模型

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稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

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生命科学研究 2013年第2期17卷 100-105页

作者：方彧聃何佳平张斯敏王娟任晓叶张金脉张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所中国上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室中国上海200040

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基... 详细信息

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.

关键词： HC11细胞系催乳素慢病毒载体乳腺特异性基因乳腺生物反应器

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长链脂酰辅酶A脱氢酶的调控机制

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医学分子生物学杂志 2013年第3期10卷 172-176页

作者：路兆宁王伟颜景斌上海交通大学医学遗传研究所上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海市200040

长链脂肪酸β-氧化是动物获得能量的主要途径，长链脂酰-CoA脱氢酶（LCAD）是长链脂肪酸β-氧化起始步骤的催化酶。其调控机制主要包括表达调控和活性调节。LCAD由acadl基因编码，该基因的启动子区内存在多个起重要调控作用的顺式作用... 详细信息

长链脂肪酸β-氧化是动物获得能量的主要途径，长链脂酰-CoA脱氢酶（LCAD）是长链脂肪酸β-氧化起始步骤的催化酶。其调控机制主要包括表达调控和活性调节。LCAD由acadl基因编码，该基因的启动子区内存在多个起重要调控作用的顺式作用元件。由配体激活的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）与维甲酸X受体（RXR）形成异源二聚体，在辅助激活物的参与下形成转录调控复合物，结合在应答元件上调控LCAD的组织特异性和发育阶段特异性表达。此外，LCAD的酶活性可受去乙酰化酶SIRT3的调节，即通过使LCAD的K42脱乙酰化来提高其活性。机体对LCAD的精确调控使长链脂肪酸的代谢能够有序地进行，从而满足机体的正常生理功能需求。

关键词：长链脂酰-CoA脱氢酶表达调控活性调节

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