检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物工程杂志 2013年第8期33卷 87-92页

作者：闫亚彬蔡勤蔡琳琳龚秀丽朱怡文管翌华黄英上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市生殖与胚胎工程重点实验室上海200040

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供... 详细信息

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供有价值的理论和技术基础。方法:将构建β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL乳腺特异表达载体分别转染体外培养的转基因小鼠乳腺上皮细胞;并将转染pcDNA3.1质粒和未转染细胞作为对照,收集不同代数的细胞及上清液,用RT-PCR及Elisa法分析mRNA及蛋白,分析比较二者对hTF表达水平的影响。结果:RT-PCR显示人转铁蛋白转录电泳条带明显;Elisa表明二者均能提高hTF蛋白水平的表达。结论:首次应用牛生长激素和催乳素对外源基因表达影响作用进行比较研究;β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL均能促进在乳腺上皮细胞水平上外源蛋白表达。因此,在研制转基因动物———乳腺生物反应器中,采用bGH和bPRL促进乳汁中外源蛋白特异、高效表达的载体都将是可选择的新技术途径。

关键词：牛生长激素牛催乳素人转铁蛋白乳腺生物反应器

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全自动高效液相色谱分析系统在地中海贫血诊断中的应用

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临床儿科杂志 2013年第12期31卷 1138-1142页

作者：夏超然王娟杨为群熊灿王伟上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040 上海交通大学附属儿童医院血液科上海200040

目的探讨全自动高效液相色谱(HPLC)分析检测系统在地中海贫血(地贫)诊断和筛查中的临床应用价值。方法入选100例基因诊断确诊地贫患儿及35例正常儿童,应用HPLC检测系统以及传统碱变性法、醋纤电泳法定量分析HbF和HbA2;并比较不同检测方... 详细信息

目的探讨全自动高效液相色谱(HPLC)分析检测系统在地中海贫血(地贫)诊断和筛查中的临床应用价值。方法入选100例基因诊断确诊地贫患儿及35例正常儿童,应用HPLC检测系统以及传统碱变性法、醋纤电泳法定量分析HbF和HbA2;并比较不同检测方法与相应β地贫基因诊断结果的符合率、敏感性与特异性。结果β地贫74例,64例单杂合子,10例复合杂合子;α地贫26例,1例单杂合子,25例复合杂合子。在地贫患儿和正常儿童中,HPLC法测定的HbF百分含量均高于碱变性法,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC法测得的HbF在α地贫患儿和正常儿童间的差异亦有统计学意义(P=0.011),对α地贫的分辨力高于碱变性法。α地贫患儿,HPLC法测得的HbA2百分含量高于醋纤电泳法,差异有统计学意义(P=0.010);β地贫患儿,HPLC法和醋纤电泳法测得的单杂合子的HbA2含量均高于复合杂合子,差异有统计学意义(P<0.01)。HPLC方法测定HbF-HbA2(≥4.0%)联合MCV(<80 fl)、MCH(<27 pg),与α或β基因诊断的符合率达99.3%,灵敏度和特异度分别为99.0%和100.0%。结论采用HPLC法检测HbA2和HbF,并结合MCV、MCH,与基因诊断结果的符合率、灵敏度和特异度均高,可成为大规模筛查β地贫的一种理想方法。

关键词：地中海贫血血红蛋白电泳高效液相色谱分析

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稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

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生命科学研究 2013年第2期17卷 100-105页

作者：方彧聃何佳平张斯敏王娟任晓叶张金脉张敬之上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所中国上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室中国上海200040

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基... 详细信息

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.

关键词： HC11细胞系催乳素慢病毒载体乳腺特异性基因乳腺生物反应器

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attB位点核心区定点突变对φC31整合酶效率的影响

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医学分子生物学杂志 2013年第2期10卷 63-68页

作者：李振海谢飞马晴雯上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎与分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基，设计含有相应位点突变的引物，采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB... 详细信息

目的考察attB位点核心区碱基突变对φC31整合酶存真核细胞中催化目的基网整合效率的影响。方法选取attB位点核心区中可能对中c31整合酶效率产生影响的碱基，设计含有相应位点突变的引物，采用大引物法两轮PCR扩增得到含突变碱基的attB片段，将其连人含报告基因的载体pEGFP。NI中得到pEGFP—NI—attB。以含野生型attB位点的报告基因载体pEGFP-N1-attB作为对照．将上述载体分别与中φC31整合酶表达质粒共转染HeLa细胞，经过药物筛选、染色、细胞克隆计数后，计算并比较整合效率。结果成功完成9个含有突变碱基attB位点及报告基因载体的构建。酶切及测序鉴定结果显示每个质粒含1或2个突变碱基。其中6个质粒为目标碱基突变，3个为PCR过程中随机产生的非预期突变。细胞实验结果表明，3个含有突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比无显著性差异，其余6个突变attB报告质粒的整合率与野生型attB相比显著降低（P〈0．05），尤其是其中两个attB位点中含有2个碱基突变的报告质粒，整合率降低极为显著（P〈0．001）。结论attB位点核心区碱基保守性较强，其中一些关键位点的突变使得整合酶效率降低。

关键词： attB位点点突变大引物整合率

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病毒滴度和插入子长度对慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响

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实验动物与比较医学 2013年第3期33卷 185-189页

作者：郭歆冰龚秀丽陈雁雯方彧聃张敬之上海市儿童医院、上海交通大学附属儿童医院、上海医学遗传研究所上海200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海200040

目的研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响。方法制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体，通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠，然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率，并对所生成的数据进... 详细信息

目的研究病毒滴度和插入子长度对于慢病毒载体介导的转基因小鼠整合率的影响。方法制备了18种不同长度插入子的慢病毒载体，通过受精卵卵周隙注射的方法获得转基因小鼠，然后通过PCR技术检测其转基因小鼠的整合率，并对所生成的数据进行统计学分析。结果插入子长度在较短（〈2kb）的情况下，病毒滴度达到2×10^8就可获得较高的整合率，在插入子长度稍长（4-5kb）的情况下，需要1×10^9滴度才能获得较高的整合率，而在插入子长度大于6kb的情况下，未能用该方法获得转基因小鼠。结论滴度的增加能有效提高慢病毒载体制备转基因小鼠的整合率，而当滴度适中（-2×10^8）时，整合率随插入子长度的增加而下降。

关键词：慢病毒载体转基因小鼠整合率滴度插入子长度

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一步法快速构建多片段连接的同源臂载体

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生物技术通讯 2013年第3期24卷 385-389页

作者：张金脉杨冠恒程艳黄英上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海交通大学基础医学院上海200025 上海市胚胎与生殖工程重点实验室暨卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上200040

目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左... 详细信息

目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段，纯化后一起加入一个反应管中，并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液，进行酶切、酶连接共10～50个循环反应，一步构建含同源臂载体的质粒；产物经高温处理后，直接转化感受态细胞，并进行重组子PCR鉴定；对pMD19－T载体进行优化，突变载体上的BsaⅠ酶切位点，把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体，再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明，应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体；用优化后的pMD19－T－O载体体系，在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠，不仅可快速构建某类载体系统，还可对基因进行精确的点突变，该系统可用于快速构建基因打靶载体。

关键词：同源臂多片段酶连接载体构建一步连接法

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可用于基因表达研究的转基因小鼠乳腺上皮细胞模型的构建

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上海交通大学学报（医学版） 2012年第7期32卷 955-960页

作者：蒋世忠闫亚彬谢飞王娟黄英任兆瑞上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海200040 上海交通大学医学遗传研究所上海200040 上海市胚胎与生殖工程重点实验室暨卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海200040

目的建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台。方法通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原... 详细信息

目的建立转基因小鼠乳腺上皮细胞模型,为研究乳腺内环境因素调控外源基因的表达和制备高效表达外源基因的乳腺生物反应器提供研究平台。方法通过机械破碎和胶原酶消化的方法获取人转铁蛋白(hTF)转基因小鼠的乳腺上皮细胞,并进行体外原代培养。经胰蛋白酶纯化后,绘制乳腺上皮细胞生长曲线;免疫组织化学方法检测角蛋白18的表达;透射电子显微镜(透射电镜)观察乳腺上皮细胞超微结构;流式细胞仪检测细胞周期分布;显微镜下分析乳腺上皮细胞核型。将牛催乳素真核表达载体(pCMV-bPRL)转染至转基因乳腺上皮细胞中,检测外源bPRL的表达。结果乳腺上皮细胞生长曲线呈"S"形;免疫荧光组织化学分析结果显示hTF转基因小鼠乳腺上皮细胞角蛋白18呈阳性表达;透射电镜观察发现乳腺上皮细胞胞核较大、偏位,有双核或多核,胞质丰富,空泡、粗面内质网、高尔基体丰富;流式细胞仪检测结果显示:乳腺上皮细胞增殖活跃,G2/M期+S期细胞占15%;细胞核型分析结果显示处于分裂期的细胞具有正常的二倍体,染色体完整。pCMV-bPRL转染乳腺上皮细胞24 h后,上清液中检测到bPRL的表达。结论体外培养的转基因乳腺上皮细胞具有类似体内细胞的生物学特征,并可表达真核表达载体,为研究环境因素对乳腺功能的影响及制备乳腺生物反应器提供了一种细胞模型。

关键词：转基因小鼠乳腺上皮细胞真核表达载体牛催乳素

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不同启动子引导的人凝血因子Ⅷ基因载体在HC11细胞和小鼠乳腺中表达的研究

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医学分子生物学杂志 2012年第5期9卷 313-319页

作者：王晴任晓叶蔡勤龚秀丽黄英曾溢滔上海市儿童医院上海交通大学附属儿童医院上海医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040

目的应用山羊β-酪蛋白基因启动子（P1A3），构建真核细胞表达人凝血因子Ⅷ（humancoagu—lationfactorⅧ，hFⅧ）全长cDNA载体（pcDNA3．1．P1A3-hFⅧ）和hFⅧB区缺失（humancoagulationfactorⅧB—***，hFVⅧBD）的cDNA载体（pcDNA3．1-P1A3-hFⅧBD），研究它们在乳腺细胞中的表达情况，同时与巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子引导的相应的hFⅧ载体进行比较。方法采用常规DNA分子克隆技术构建人凝血因子Ⅷ（hFⅧ）基因载体，转染小鼠乳腺上皮细胞（HC-11），应用RT—PCR以及real—timePCR技术检测hFⅧ基因转录本；对NSL期母鼠乳腺注射DNA载体后，采集试验母鼠乳汁，应用ELISA检测乳腺细胞分泌hFⅧ蛋白的瞬时表达水平。结果应用构建的CMV启动子和P1A3启动子指导的hFⅧ基因载体转染HC-11细胞后，在mRNA水平均有表达；瞬时转染哺乳期母鼠的乳汁检测表明，转染CMV和P1A3启动子的hFⅧ载体的母鼠，乳汁中的hFⅧ蛋白表达量分别为2．81μg／ml（CMV—hFⅧBD），2．01μg/ml（CMV—hFⅧ），1．82μg／ml（P1A3-hFⅧBD），1．20μg／ml（***Ⅷ）。结论构建的乳腺特异性表达hFⅧ基因的载体，转染HC-11细胞和乳腺组织后的mRNA及蛋白表达水平均证实了该载体的有效性：CMV启动子引导的hFⅧ载体表达虽稍高于P1A3启动子载体，但由于后者具有乳腺特异表达的特点，更适用于乳腺生物反应器。我们构建hFⅧ基因的载体的经验，为乳腺生物反应器的研制提供了有价值的科学依据。

关键词：人凝血因子Ⅷ 哺乳动物乳腺启动子特异表达

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一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法——高分辨率熔解曲线分析法

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医学分子生物学杂志 2012年第3期9卷 161-165页

作者：许淼王娟龚秀丽蔡勤颜景斌 Nanbert Zhong 曾凡一黄淑帧上海市儿童医院上海医学遗传研究所上海交通大学医学遗传研究所上海市200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市200040 上海交通大学医学院医学科研研究院发育生物学研究室上海市200025

目的建立利用高分辨率熔解曲线（HRM）分析快速鉴定CLN6（神经元蜡样脂褐质沉积症，ceroid—lipofuscinosis，neurona16）小鼠（c2硒基因移码突变）基因型的方法。方法根据NCBI公布的小鼠cln6序列（NC00075）设计HRM引物和测序引物，然... 详细信息

目的建立利用高分辨率熔解曲线（HRM）分析快速鉴定CLN6（神经元蜡样脂褐质沉积症，ceroid—lipofuscinosis，neurona16）小鼠（c2硒基因移码突变）基因型的方法。方法根据NCBI公布的小鼠cln6序列（NC00075）设计HRM引物和测序引物，然后采用HRM技术获得高分辨熔解曲线鉴定实验小鼠基因型，同时通过直接测序法进行验证，评价其灵敏性和准确性。结果181只实验小鼠经HRM检测，共有野生型11只、Cln6基因突变杂合子73只和纯合子97只，HRM结果和直接测序结果完全一致，准确性为100％。结论HRM方法检测DNA微小突变时具有操作简便、快速、灵敏，单管避免污染以及准确度高等优点，值得推广。

关键词：高分辨熔解曲线神经元蜡样脂褐质沉积症 Cln6模型小鼠

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一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法-高分辨率熔解曲线分析法

一种快速检测CLN6模型小鼠基因型的方法-高分辨率熔解曲线分析法

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第八届全国遗传病诊断与产前诊断学术交流会

作者：许淼王娟龚秀丽蔡勤颜景斌 Nanbert Zhong 曾凡一黄淑帧上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海交通大学医学遗传研究所上海，200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海交通大学医学遗传研究所上海，200040 上海市儿童医院上海医学遗传研究所，上海交通大学医学遗传研究所上海，200040 卫生部医学胚胎分子生物学重点实验室暨上海市胚胎与生殖工程重点实验室上海交通大学医学院医学科研研究院发育生物学研究室上

本文利用高分辨率熔解曲线分析法(HRM)对CLN6模型小鼠不同基因型进行检测。结果显示，通过比较HRM结果和直接测序结果完全一致，准确性和灵敏性均达到100%，且相比其他方法大大节省了时间和成本。

关键词：基因诊断高分辨率熔解曲线分析法动物模型

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