检索结果-内蒙古大学图书馆

水产学报 2011年第9期35卷 1343-1353页

作者：余贞毕燕会周志刚上海海洋大学农业部水产种质资源与利用重点开放实验室上海高校水产养殖E-研究院

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressedsequence tag,eST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该eST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapidamplification of cDNA ends,RACe),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5’-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3’-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitativereal-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO2浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO2。

关键词：海带配子体碳酸酐酶基因克隆荧光定量RCR

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中华绒螯蟹和罗氏沼虾cyclin B蛋白的原核表达、抗体制备及其鉴定

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中国水产科学 2011年第4期18卷 713-719页

作者：冯海洋邱高峰上海海洋大学农业部水产种质资源与利用重点开放实验室上海高校水产养殖学E-研究院上海201306

从中华绒螯蟹(eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGeX-2T和peT-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(De3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-esCB和Trx-MrCB。通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1 mmol/L IPTG、37℃、4 h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6 h。重组蛋白主要以包涵体形式存在。亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-esCB和Trx-MrCB多克隆抗体。eLISA检测抗体效价均高达1∶80 000,Western blot鉴定该抗体能特异性识别重组蛋白,而且均能够从卵巢总蛋白中检测到cyclin B蛋白。在中华绒螯蟹未成熟卵巢中cyclin B蛋白出现2种亚型,在罗氏沼虾未成熟卵巢中只有1种亚型,推测虾和蟹cyclin B蛋白调控卵母细胞成熟的分子机制不同。本研究制备了cyclin B抗体,旨为在蛋白水平研究cyclin B在卵母细胞成熟过程中的作用机制提供基础条件。

关键词：中华绒螯蟹罗氏沼虾 cyclinB多克隆抗体原核表达卵母细胞成熟

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氮饥饿与磷饥饿促使缺刻缘绿藻花生四烯酸含量增加的比较

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水产学报 2011年第5期35卷 763-773页

作者：童牧于水燕欧阳珑玲周志刚上海海洋大学水产与生命学院农业部水产种质资源与利用重点开放实验室上海高校水产养殖E-研究院

以富含花生四烯酸(AA)的缺刻缘绿藻H4301为研究对象,探讨了不同光照强度条件下氮饥饿与磷饥饿对藻生物量、AA及脂肪酸含量变化的影响。发现氮饥饿与磷饥饿均降低了藻类的生长速率与生物量,当在60μmol photons/(m2.s)的低光照强度下,磷... 详细信息

以富含花生四烯酸(AA)的缺刻缘绿藻H4301为研究对象,探讨了不同光照强度条件下氮饥饿与磷饥饿对藻生物量、AA及脂肪酸含量变化的影响。发现氮饥饿与磷饥饿均降低了藻类的生长速率与生物量,当在60μmol photons/(m2.s)的低光照强度下,磷饥饿时的藻类平均生长速率最低[0.025 g/(d.L)],不足BG-11完全培养基中该藻生长速率的一半;氮饥饿与磷饥饿均能提高藻细胞总脂肪酸及AA的含量,但在低光照强度下磷饥饿的促进效果比较差;无论是完全培养基中还是饥饿处理时,200μmol photons/(m2.s)的高光照强度都不利于藻细胞AA及多不饱和脂肪酸的合成与积累;随着饥饿时间的不断持续,AA占总脂肪酸的百分含量逐渐增加,而亚油酸的百分含量逐渐降低,但在磷饥饿时,油酸的百分含量也增加,特别在高光照强度下,以油酸为主的单不饱和脂肪酸含量在第27天时占细胞干重的5.28%,以致AA含量的增加没有氮饥饿时的显著。从脂肪酸成分的变化来分析,该藻在氮或磷饥饿过程中主要是从亚油酸到γ-亚麻酸再到20∶3ω6这个途径来合成并积累AA,其中Δ6去饱和酶是限速酶,而ω3去饱和酶催化步骤受饥饿处理的负调控对确保AA的合成与积累有较大的积极作用。氮饥饿使藻细胞蛋白质合成受阻以及磷饥饿使核酸合成、糖类与能量代谢产生障碍,从而阻止藻类的生长并迫使细胞代谢流转向不含氮和磷的脂肪酸合成代谢,以提高藻细胞总脂肪酸及AA含量。

关键词：缺刻缘绿藻生物量花生四烯酸(AA) 氮饥饿磷饥饿

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海带lhcf4基因克隆和配子体差异表达研究

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华北农学报 2011年第6期26卷 41-49页

作者：毕燕会周志刚上海海洋大学农业部水产种质资源与利用重点开放实验室上海高校水产养殖学E-研究院上海201306

根据糖海带(Laminaria saccharina)光捕获蛋白基因lhcf4的cDNA全长序列(GenBank登录号:AF226860)设计引物,通过RT-PCR方法获得海带(Saccharina japonica)配子体lhcf4基因的cDNA全长序列,共1 042 bp,编码一个含218个氨基酸的前体蛋白LHCF4,推测分子量为23.11 kDa,等电点为5.36。与其同源基因相似度分析表明,lhcf基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)在家族内及物种间高度保守,变异主要发生在非翻译区(Untranslated re-gion,UTR)。预测LHCF4成熟蛋白三级结构存在4个α螺旋区,其中第一、三螺旋较长,形成跨膜螺旋,第二个螺旋相对较短,完全镶嵌在膜中,另外一个为短螺旋,位于类囊体膜-类囊体腔界面上。杂色藻类、绿藻及豌豆光捕获蛋白氨基酸多序列比对显示叶绿素a结合位点及盐桥形成氨基酸残基在植物进化中高度保守;将预测的海带LHCF4蛋白3D结构与豌豆X-衍射晶体结构进行空间重叠,获得了结合在LHCF4蛋白上的5个叶绿素a的空间分布。Neighbor-joining分子进化树显示原绿球藻、绿藻和杂色藻类的光捕获蛋白基因是三个独立进化的系统,共同起源于蓝细菌的只结合叶绿素a的光捕获蛋白;海带lhcf4基因与糖海带lhcf4及巨藻的fcpb基因为直系同源;糖海带lhcf4、lhcf7及lhcF1基因为旁系同源。实时荧光定量PCR结果证实lhcf4基因具有雌、雄配子体差异表达特征。

关键词：海带配子体 lhcf4 基因克隆序列分析差异表达

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缢蛏β-ACTIN1基因的分子特性及其表达分析

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水产学报 2011年第5期35卷 650-659页

作者：冯冰冰钟玉民牛东红陈慧林国文李家乐上海海洋大学水产与生命学院农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室福建省闽东水产研究所上海海洋大学水产与生命学院上海市高校水产养殖学E-研究院

为研究缢蛏功能基因的表达调控,利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了缢蛏肝脏组织的标准化cDNA文库。对随机选取的5 679个克隆进行随机测序,比对、筛选出2条β-actin同源序列,对其中一条eST序列两端进行扩增、测序,然后进行5′RACe(... 详细信息

为研究缢蛏功能基因的表达调控,利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了缢蛏肝脏组织的标准化cDNA文库。对随机选取的5 679个克隆进行随机测序,比对、筛选出2条β-actin同源序列,对其中一条eST序列两端进行扩增、测序,然后进行5′RACe(rapidamplification of cDNA ends,RACe)扩增、测序,拼接得到全长cDNA序列,命名为β-ACTIN 1。该序列全长为1 552 bp,包括73 bp的5′非翻译区和348 bp的3′非翻译区,以及1 131 bp的开放阅读框。阅读框共编码376个氨基酸,推算分子量约为41.95 ku,理论等电点为5.23。与其他7种软体动物的氨基酸序列进行比对发现,β-ACTIN1基因的氨基酸序列中Ile179、G lu229、Ser232、Pro236、Ile248、Asn272、Cys273、Val283、Ser320、Ser325、Val330、Pro339等12个氨基酸残基具有特异性;同时发现缢蛏β-ACTIN 1氨基酸序列与其他软体动物的相似性高达97%以上。系统进化分析显示,缢蛏首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。荧光定量PCR检测结果显示,β-ACTIN1基因在缢蛏各组织中的表达及鳗弧菌诱导后的表达均不稳定,不适合作为内参基因。

关键词：缢蛏 cDNA文库 β-ACTIN1基因序列分析基因表达

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应用激光共聚焦显微技术研究Ca2+在三角帆蚌组织内的积累与分布

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水产学报 2011年第2期35卷 214-220页

作者：李文娟施志仪郝莹莹叶显峰上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室上海市高校水产养殖学E-研究院上海海洋大学水产与生命学院安徽省芜湖市繁昌县农委

为了探讨淡水贝类Ca2+吸收和转运信号传递机理,采用激光共聚焦技术研究了三角帆蚌不同组织细胞在静息状态下细胞内游离Ca2+浓度,以及水体Ca2+浓度对外套膜组织细胞内钙沉积的影响。试验选取10只健康的三角帆蚌,分别获得外套膜外膜、内... 详细信息

为了探讨淡水贝类Ca2+吸收和转运信号传递机理,采用激光共聚焦技术研究了三角帆蚌不同组织细胞在静息状态下细胞内游离Ca2+浓度,以及水体Ca2+浓度对外套膜组织细胞内钙沉积的影响。试验选取10只健康的三角帆蚌,分别获得外套膜外膜、内膜、斧足、腮及内脏团上表皮组织细胞,短期培养后用Fluo-3/AM荧光探针孵育细胞1 h,观察细胞内Ca2+荧光强度。研究结果表明,蚌不同组织细胞内Ca2+荧光强度存在显著差异,外套膜外膜细胞内Ca2+荧光强度最高,内脏团上表皮细胞的最低(P<0.05);育珠三角帆蚌在相同Ca2+浓度的孵育水平下,外套膜细胞内Ca2+荧光强度比非育珠蚌都有增加的趋势,其中在1.25 mmol/L添加组中,两组外套膜内膜细胞内Ca2+荧光强度差异达到显著水平(P<0.05);不同Ca2+孵育水平对细胞内Ca2+荧光强度有显著影响(P<0.05),随着Ca2+在孵育液中浓度的升高,外套膜细胞内Ca2+荧光强度显著增强(P<0.05),表明外套膜是从外界吸收Ca2+的主要组织,蚌体珍珠的培育增强了其对Ca2+的沉积,并且水体Ca2+浓度在1.25～3.00 mmol/L有助于蚌体内Ca2+的贮藏,这对进一步开展淡水蚌类育珠学研究提供了基础理论,为珍珠培育的生产实践工作提供了依据。

关键词：三角帆蚌细胞培养激光共聚焦技术 Ca2+沉积

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缺刻缘绿藻脂肪酸延长酶基因在拟南芥中的表达分析

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生物技术通报 2011年第11期27卷 88-94,100页

作者：于水燕陈颢周志刚上海海洋大学农业部水产种质资源与利用重点开放实验室上海高校水产养殖E-研究院上海201306 国家海洋局第一海洋研究所青岛266061

缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)系单细胞淡水绿藻,能够大量合成并积累花生四烯酸(arachidonic acid,ArA,20:4ω6),尤其在氮饥饿条件下。基于该绿藻中的延长酶基因序列构建双元表达载体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导侵... 详细信息

缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa)系单细胞淡水绿藻,能够大量合成并积累花生四烯酸(arachidonic acid,ArA,20:4ω6),尤其在氮饥饿条件下。基于该绿藻中的延长酶基因序列构建双元表达载体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导侵染拟南芥(Arabidopisis thaliana),筛选得到携带MiFAe基因的拟南芥转化株。在转基因第3代(T3)植株中应用PCR扩增目的基因片段和GUS染色,分别在DNA、mRNA和表达水平上均成功地检测到MiFAe基因的存在。GC-MS对不同组织甲酯化的脂肪酸进行检测,结果表明,在转基因的拟南芥营养生长期的叶片中,十六碳三烯酸(hexadecaterienoic acid,C16:3^7,10,13)和α-亚麻酸(α-linolenic acid,C18:3^9,12,15,ALA)在总脂肪酸中的百分含量与对照组相比明显下降,分别由10.5%和41.5%降到1.8%和19.6%。结合GUS染色结果,推测这些减少的产物可能通过外源MiFAe基因的作用,直接参与了蜡质或角质的合成代谢途径。

关键词：缺刻缘绿藻花生四烯酸脂肪酸延长酶农杆菌拟南芥

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运用微电极技术测定三角帆蚌外套膜Ca^(2＋)流量的研究

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水生生物学报 2011年第3期35卷 545-549页

作者：李文娟施志仪郝莹莹韩健靳雨丽叶显峰上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室上海201306 上海市高校水产养殖学E研究院上海海洋大学上海201306 安徽省芜湖市繁昌县农委安徽241200

Ca既是珍珠和贝壳中的主要组成成分（CaCO3占95%以上）,又是普遍存在的细胞内第二信使,在生物体内承担着非常重要生理功能。生物矿化的研究表明外套膜细胞在珍珠和贝壳生长中起着非常重要的作用[1,2],并且Ca^2＋在外套膜中也保持一个较... 详细信息

Ca既是珍珠和贝壳中的主要组成成分（CaCO3占95%以上）,又是普遍存在的细胞内第二信使,在生物体内承担着非常重要生理功能。生物矿化的研究表明外套膜细胞在珍珠和贝壳生长中起着非常重要的作用[1,2],并且Ca^2＋在外套膜中也保持一个较高的水平^[3]。研究贝类Ca代谢，特别是外套膜组织的Ca^2＋跨膜转运，对进一步阐明贝壳以及珍珠形成机理，提高优质珠的产量都有着重要意义。

关键词：三角帆蚌外套膜细胞培养选择性微电极 Ca2+流量

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三角帆蚌外套膜细胞培养的改进与大型有核珍珠的培育研究

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上海海洋大学学报 2011年第5期20卷 705-711页

作者：靳雨丽施志仪李文娟郝莹莹强刚上海海洋大学农业部水产种质资源与利用重点开放实验室上海201306 上海市高校水产养殖学E-研究院上海201306 安徽省芜湖市繁昌县农委安徽芜湖241200

为得到大颗粒优质的淡水有核珍珠,进行了游离细胞植入法在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)内脏团插核育珠的研究。实验采用两种培养基(培养基1、2)进行外套膜外膜细胞的培养,对不同培养时间(2、4、6、12 h)的细胞活力进行检测,同时将处理... 详细信息

为得到大颗粒优质的淡水有核珍珠,进行了游离细胞植入法在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)内脏团插核育珠的研究。实验采用两种培养基(培养基1、2)进行外套膜外膜细胞的培养,对不同培养时间(2、4、6、12 h)的细胞活力进行检测,同时将处理过的珠核分别置于两组细胞悬液中共培养,6 h后采用内脏团插核手术,对500只三角帆蚌进行插核,并进行为期5个月的淡水有核珍珠生产实验。实验结果表明:细胞活力随培养时间逐渐增大,培养到6、12 h时,两种培养基中的细胞活力较2、4 h时均有显著提高(P<0.05),6 h与12 h相比差异不显著(P>0.05);细胞在两种培养基中分别培养,在培养2 h时两组间细胞活力没有显著差异(P>0.05),而在培养4、6、12 h时培养基2组的细胞活力显著高于培养基1组(P<0.05);培养基2组培养的细胞孵育珠核6 h后,贴附的细胞数量明显增多且分布均匀,插核5个月后,形成了包裹完整、具有光泽、沉积0.8 mm珍珠质的大型珍珠,而采用培养基1组培养的外套膜细胞进行珠核孵育而后插核,得到的素珠较多,且没有形成完整珍珠质包被的珍珠。实验表明改进后的培养基有利于三角帆蚌外套膜细胞培养,从而有利于内脏团有核珍珠的培育,这为进一步开展淡水贝类细胞培养的研究提供了实践基础,为大型有核珍珠的培育提供了依据。研究亮点:本文对体外培养三角帆蚌外套膜细胞的培养基进行改进,添加牛磺酸、Ca2+等适宜细胞生长以及珍珠质沉积的成分,促进了细胞的生长。利用改进后的游离细胞悬液与珠核共培养,并进行内脏团插核手术,5个月后得到了包被完整、具有光泽、沉积0.8 mm珍珠质的大型有核珍珠。

关键词：三角帆蚌细胞培养内脏团插核有核珍珠

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牙鲆回交、全同胞近交及其亲本家系的微卫星研究

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渔业科学进展 2011年第3期32卷 38-43页

作者：王磊陈松林田永胜邓寒农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院 201306 上海高校水产养殖学E-研究院 201306

应用10对微卫星引物对2007年建立的抗病家系之一（将其定义为亲本家系）及其回交家系和全同胞近交家系进行分析,结果发现10个位点的等位基因数为1.7~3.0,平均等位基因数为2.3,有效等位基因数为1.553 2~2.887 8,平均有效等位基因数为2.05... 详细信息

应用10对微卫星引物对2007年建立的抗病家系之一（将其定义为亲本家系）及其回交家系和全同胞近交家系进行分析,结果发现10个位点的等位基因数为1.7~3.0,平均等位基因数为2.3,有效等位基因数为1.553 2~2.887 8,平均有效等位基因数为2.054 1,杂合度观测值为0.307 0~0.664 8,平均杂合度观测值为0.487 0,无偏期望杂合度值为0.200 0~0.606 8,平均无偏期望杂合度值为0.606 8,多态信息含量为0.233 4~0.579 4,平均多态信息含量为0.399 5,3个家系均为中度多态,多态信息含量从大到小依次为：亲本家系、回交家系、全同胞近交家系,其中Poli194TUF位点在全同胞近交家系中发生纯合。家系间的遗传分化系数为0.067 1,表明遗传变异有6.71%来自于家系间,家系间分化较低。根据家系间的遗传距离,利用UPGMA法进行聚类,亲本家系和全同胞近交家系聚为一类。全同胞近交家系纯化基因速率较快,适合牙鲆品系的快速建立。

关键词：牙鲆家系回交近交微卫星

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