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2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：郭晓芳朱小飞钟根深曹海英苗庆芳新乡医学院基础医学院微生物学教研室新乡医学院医学检验学院临床免疫学教研室新乡医学院第一附属医院中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室

目的表皮生长因子受体（EGFR）和胰岛素样生长因子受体I（IGF-IR）在人非小细胞肺癌中呈过表达状态,且二者之间可发生多种形式的相互作用,是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治疗的理想靶点;力达霉素（LDM）是一种强... 详细信息

目的表皮生长因子受体（EGFR）和胰岛素样生长因子受体I（IGF-IR）在人非小细胞肺癌中呈过表达状态,且二者之间可发生多种形式的相互作用,是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治疗的理想靶点;力达霉素（LDM）是一种强效的抗肿瘤抗生素,它与抗体或配体的偶联物显示了良好的抗肿瘤疗效。本研究的目的是构建一种以EGFR和IGF-1R为靶点的双特异性融合蛋白,并探讨其对NSCLC的体内外抗肿瘤活性。方法将EGFR和IGF-1R的配体EGF和IGF-1基因与LDM辅基蛋白基因LDP通过拼接PCR进行连接,并克隆至pET30a得到重组表达载体pET-egf-ldp-igf,将其转化到大肠杆菌中进行诱导表达,获得融合蛋白EGF-LDP-IGF。采用ELISA检测融合蛋白与EGFR和IGF-1R的亲和活性。融合蛋白与LDM发色团分子（AE）体外组装,得到强化融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE。采用MTT法检测强化融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE对NSCLC细胞的体外杀伤活性,并与两种单靶向性强化融合蛋白EGF-LDP-AE和LDP-IGF-AE的体外细胞毒活性进行比较。PI染色法检测EGF-LDP-IGF-AE对细胞周期的影响以及Annexin V-FITC/PI双染法检测EGF-LDP-IGF-AE蛋白对细胞凋亡的诱导活性。结果重组载体pET-egf-ldp-igf转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示EGF-LDP-IGF以包涵体形式存在于大肠杆菌胞质中。提取包涵体组分采用Ni亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,经复性后获得有活性的EGF-LDP-IGF蛋白。经ELISA检测EGF-LDP-IGF蛋白与EGFR和IGF-1R均有很高的亲和活性。将AE分子与EGF-LDP-IGF体外组装后,HPLC检测在350nm处出现了特定的吸收峰,表明分子组装成功获得了强化融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE。MTT试验显示EGF-LDP-IGF-AE对A549、H520、H460和H1299细胞的IC值分别为:3.15×10mol/L、7.51×10mol/L、3.38×10mol/L和2.51×10mol/L,其杀伤活性显著高于LDM和两种单靶向性的强化融合蛋白EGF-LDP-AE和LDP-IGF-AE。细胞周期检测显示,EGF-LDP-IGF-AE导致细胞显著的G2/M期阻滞。细胞凋亡结果显示,EGF-LDP-IGF-AE在O.1nM、0.5nM、1nM和2nM的浓度下,A549细胞的凋亡比率分别为13.35%±1.39%、15.39%±0.81%、22.39%±3.35%、55.95%±9.26%,与对照组相比均具有显著性差异。结论本研究以EGFR和IGF-IR的天然配体EGF和IGF作为导向载体,以LDM作为弹头药物,制备了一种兼具双靶向、小型化和高效化的新型融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE。该融合蛋白可高亲和性地与EGFR和IGF-1R结合,对体外培养的NSCLC细胞具有强烈杀伤作用,并可显著诱导NSCLC细胞发生周期阻滞与细胞凋亡。

关键词： EGFR IGF-1R 双特异性融合蛋白 NSCLC

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气管内注射博来霉素致小鼠肺纤维化造模方式改良

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新乡医学院学报 2015年第9期32卷 807-809页

作者：杨宇袁晓梅吴敏娜许芝山霍书华钟根深郭悦鹏新乡医学院第一附属医院呼吸科河南卫辉453100 新乡医学院基础医学院微生物学教研室河南新乡453003 河南省神经病学研究所生物治疗实验室河南卫辉453100 新乡医学院第一附属医院胸外科河南卫辉453100

目的探讨手术显微镜下气管内注射博来霉素制作肺纤维化模型的效果。方法选择健康成年清洁级雌性8周龄C57BL/6小鼠30只,采用随机数字表法将其分为对照组和观察组,每组15只。对照组小鼠在直视下行气管内注射博来霉素,观察组小鼠在手术显... 详细信息

目的探讨手术显微镜下气管内注射博来霉素制作肺纤维化模型的效果。方法选择健康成年清洁级雌性8周龄C57BL/6小鼠30只,采用随机数字表法将其分为对照组和观察组,每组15只。对照组小鼠在直视下行气管内注射博来霉素,观察组小鼠在手术显微镜下行气管内注射博来霉素造模,观察术后12 h内各组小鼠死亡情况及术后1周体质量变化;术后28 d每组随机选取8只小鼠,取小鼠肺组织制备石蜡切片并进行苏木精-伊红染色、Masson染色,评价各组小鼠肺泡炎及肺纤维化程度。结果术后12 h内观察组小鼠死亡率显著低于对照组(P<0.05)。术后1周内观察组小鼠体质量下降显著低于对照组(P<0.05)。观察组小鼠肺泡炎及肺纤维化评分均显著高于对照组(P<0.05)。结论手术显微镜下行气管内注射博来霉素制备肺纤维化模型对小鼠损伤小,造模效果好,是一种有效的肺纤维化模型制备手段。

关键词：手术显微镜肺纤维化博来霉素小鼠

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神经元表达发育下调基因siRNA表达载体的构建及鉴定

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中国免疫学杂志 2014年第4期30卷 499-504页

作者：楚荷莹常静侠赵国强张国俊郑州大学第一附属医院呼吸与危重症一科郑州450052 郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室郑州450052

目的:构建针对神经元表达发育下调基因9(Neural precursor cell expressed,developmentally downregulated 9,NEDD9)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,研究载体介导的RNAi技术对A549肺腺癌细胞株中NEDD9表达的抑制作用。方法:根据GenBank提供的NEDD9基因(NM_182966)核苷酸序列及siRNA的设计原则,筛选得到159-177 nt、193-211 nt和648-666 nt 3个19 bp片段靶序列,同时随机组合出一条无关序列;分别合成4对带有BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入载体pRNAT-CMV3.2中构建重组表达载体,转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆。用脂质体介导转染入A549肺腺癌细胞株,采用QRT-PCR和Western blot方法检测细胞NEDD9基因mRNA和蛋白表达。结果:PCR筛选得到4个目的片段的阳性克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RTPCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低A549细胞中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表达。结论:成功构建载体介导的NEDD9靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制A549细胞中NEDD9基因的表达。

关键词：肺腺癌神经元表达发育下调基因9 RNA干扰 A549 NEDD9

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新疆维吾尔族妇女宫颈癌NKX6-1基因甲基化检测

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石河子大学学报（自然科学版） 2015年第3期33卷 310-314页

作者：范佩文杨昕王红英李玉华李洪涛潘欢武丹刘畅潘泽民石河子大学医学院生物化学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室石河子832002 新疆医科大学自治区中医医院病理科乌鲁木齐830000 新疆医科大学基础医学院微生物学教研室乌鲁木齐830011 喀什地区第一人民医院病理科喀什844000

为探讨NKX6-1基因启动子甲基化与HPV16感染在新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生中的作用。收集43例新疆维吾尔族妇女正常宫颈组织、30例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和48例宫颈癌组织。采用PCR方法检测HPV16感染;甲基化特异性PCR方法检测NKX6-1基... 详细信息

为探讨NKX6-1基因启动子甲基化与HPV16感染在新疆维吾尔族妇女宫颈癌发生中的作用。收集43例新疆维吾尔族妇女正常宫颈组织、30例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和48例宫颈癌组织。采用PCR方法检测HPV16感染;甲基化特异性PCR方法检测NKX6-1基因启动子区甲基化状况,并分析启动子甲基化与HPV16感染与宫颈癌的相关性。结果显示,正常宫颈组,CIN和宫颈癌组中的NKX6-1基因甲基化率分别为11.63%、46.67%和77.08%,差异有统计学意义(P<0.01);HPV16的感染率分别为13.95%,36.67%和66.66%,三组差异均有统计学意义(P<0.01)。NKX6-1甲基化与HPV16感染无显著相关性(P>0.05)。由此可知,NKX6-1基因启动子甲基化与HPV16感染无相关性,但与维吾尔族宫颈癌发生相关。

关键词：宫颈癌 NKX6-1基因甲基化 HPV16

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维吾尔族子宫颈鳞癌患者血浆中RASSF1A基因启动子甲基化检测及其临床意义

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中国妇幼保健 2015年第21期30卷 3693-3695页

作者：张金莉刘振华杨萍杨丽王红英杨昕潘泽民石河子大学医学院生物化学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832002 石河子大学生命科学学院石河子大学医学院第一附属医院新疆医科大学基础医学院微生物学教研室新疆医科大学自治区中医医院病理科

目的探讨新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞癌血浆中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化水平检测的意义,为早期诊断宫颈癌寻找分子标志物。方法采用DNA提取试剂盒提取血浆DNA,甲基化修饰试剂盒使DNA进行亚硫酸氢盐修饰,采用甲基化特异... 详细信息

目的探讨新疆维吾尔族妇女子宫颈鳞癌血浆中Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子甲基化水平检测的意义,为早期诊断宫颈癌寻找分子标志物。方法采用DNA提取试剂盒提取血浆DNA,甲基化修饰试剂盒使DNA进行亚硫酸氢盐修饰,采用甲基化特异性PCR检测血浆中RASSF1A基因启动子甲基化水平。结果 50例维吾尔族子宫颈鳞癌患者中,8例患者出现RASSF1A基因甲基化,42例未出现RASSF1A基因甲基化,甲基化阳性率为16.00%;45例健康体检妇女检测出1例RASSF1A基因甲基化,44例未出现RASSF1A基因甲基化,甲基化阳性率为2.22%。结论血浆中RASSF1A基因启动子甲基化对寻找维吾尔族妇女子宫颈鳞癌早期诊断分子标志物有重要的指导意义。

关键词：血浆 RASSF1A 启动子甲基化子宫颈鳞癌维吾尔族

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酶联免疫吸附法和免疫印迹法检测抗核小体抗体的对比分析

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中国现代医学杂志 2014年第33期24卷 39-42页

作者：朱伟涛刘萍萍杜英邵明明亮郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室河南郑州450001 郑州大学第一附属医院河南郑州450052

目的比较酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(WB)检测抗核小体抗体(Anu A)的差异,为临床工作寻找合适的检测方法。方法收集818例临床血标本,其中系统性红斑狼疮(SLE)360例,其他自身免疫性疾病458例,同时采用ELISA和WB两种方法检测样本... 详细信息

目的比较酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(WB)检测抗核小体抗体(Anu A)的差异,为临床工作寻找合适的检测方法。方法收集818例临床血标本,其中系统性红斑狼疮(SLE)360例,其他自身免疫性疾病458例,同时采用ELISA和WB两种方法检测样本血清中Anu A,计算每种方法的敏感度、特异度、ROC曲线,并运用SPSS 17.0进行统计学分析。结果 ELISA与WB检测Anu A的阳性率分别为35.1%和31.1%,两者差异有统计学意义(P<0.05)。准确度、敏感度和特异度无差异。结论 ELISA与WB检测Anu A的总一致率高,对SLE诊断的准确度较高,敏感度和特异度均较好。提示临床监测时,可应用WB进行Anu A检测的初筛,需要时应用ELISA进行复检,可以提高6.4%的Anu A检测阳性率,为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

关键词：酶联免疫吸附法免疫印迹法抗核小体抗体

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病案教学法在细菌学各论中的应用

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中国病原生物学杂志 2014年第1期9卷 I0004-I0004,F0003,83页

作者：王红英马海梅马秀敏张蓓陈锋新疆医科大学基础医学院微生物学教研室新疆乌鲁木齐830011 新疆医科大学第一附属医院医学检验中心

本文探讨了病案教学法在细菌学各论中的教学效果。对医学本硕2009班、中医、中西医结合临床和厚博临床医学专业2010级共185名学生作为实验组,采用病案教学法,这些班级的210名学生作为对照组,采取传统讲授法为主,辅以多媒体教学,通过考... 详细信息

本文探讨了病案教学法在细菌学各论中的教学效果。对医学本硕2009班、中医、中西医结合临床和厚博临床医学专业2010级共185名学生作为实验组,采用病案教学法,这些班级的210名学生作为对照组,采取传统讲授法为主,辅以多媒体教学,通过考试成绩分析、教学效果问卷调查,比较两个班的教学效果。实验组平均分为70分,最高分为100分,明显高于对照组(61分和94分),问卷调查反映较好。病案教学在培养学生的科学素养和临床实践能力,全面提高学生的综合素质方面发挥了很大的作用,病案教学适合微生物学各论的学习。

关键词：病案教学法细菌学应用

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马尔尼菲青霉菌内源启动子驱动的苯菌灵抗性基因盒构建及其应用

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基因组学与应用生物学 2014年第2期33卷 253-259页

作者：卢姗毛从政陶玉婷黄勇奇贺菽嘉梁莹梁晓乐吴谦何志义蓝秀万广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室南宁530021 广西医科大学第一附属医院呼吸科南宁530021 广西医科大学基础医学院微生物学教研室南宁530021 广西医科大学基础医学中心实验室南宁530021 广西艾滋病防治研究重点实验室南宁530021

马尔尼菲青霉菌是一种区域性流行于东南亚及中国南部地区的条件致病性温度依赖性双相型病原真菌,它能对免疫功能低下者造成致命的全身性感染,25℃时呈现菌丝状生长,而在37℃或在宿主体内为酵母相生长。为深入研究马尔尼菲青霉菌致病性... 详细信息

马尔尼菲青霉菌是一种区域性流行于东南亚及中国南部地区的条件致病性温度依赖性双相型病原真菌,它能对免疫功能低下者造成致命的全身性感染,25℃时呈现菌丝状生长,而在37℃或在宿主体内为酵母相生长。为深入研究马尔尼菲青霉菌致病性和双相转化的分子机制,原有的遗传转化筛选标记基因已不能满足研究需要。为此,我们通过用马尔尼菲青霉菌微管蛋白β亚基基因启动子替换粗脉孢菌苯菌灵抗性基因的启动子,构建了一个苯菌灵抗性基因盒,并成功地将其运用于马尔尼菲青霉菌的遗传转化研究中。

关键词：马尔尼菲青霉菌苯菌灵抗性基因盒遗传转化

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结核分枝杆菌持续感染小鼠模型的建立及其免疫特征

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微生物与感染 2014年第2期9卷 71-76页

作者：许承明康健王丽梅韩文东孙志平丁悦娜瞿涤柏银兰徐志凯第四军医大学微生物学与病原生物学教研室西安710032 上海复旦大学三级生物安全防护实验室上海200032 复旦大学基础医学院教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室上海200032

为建立小鼠结核分枝杆菌持续感染模型并研究其免疫应答特征,选取雌性C57BL/6小鼠,经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv株,并以异烟肼和利福平联合治疗。分别于感染后4、8、12周处死小鼠,用平板法计数肺和脾荷菌数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检... 详细信息

为建立小鼠结核分枝杆菌持续感染模型并研究其免疫应答特征,选取雌性C57BL/6小鼠,经尾静脉感染结核分枝杆菌H37Rv株,并以异烟肼和利福平联合治疗。分别于感染后4、8、12周处死小鼠,用平板法计数肺和脾荷菌数,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中特异性抗体水平及亚类,流式细胞术检测CD4+脾淋巴细胞经结核分枝杆菌抗原——纯化蛋白衍生物(PPD)刺激后分泌细胞因子的细胞比例。结果显示,感染4周后小鼠肺和脾荷菌数lg CFU分别达3.67±0.25和3.54±0.24,至少持续8周;药物治疗可有效降低脏器荷菌数。感染12周后,感染组血清中抗结核分枝杆菌特异性抗体水平显著升高(P<0.01),且以IgG1为主;治疗组总IgG抗体水平显著低于感染组(P<0.01),且IgG2a相对较高(P<0.05)。感染组CD4+脾淋巴细胞中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)分泌细胞比例显著增加(P<0.01和P<0.001),而IL-4分泌细胞比例显著降低(P<0.01);治疗组IL-2和IL-4分泌细胞比例显著低于正常组(P<0.05和P<0.01)。本研究建立的小鼠结核分枝杆菌持续感染模型有望用于结核病治疗性疫苗和药物的研发及筛选。

关键词：结核分枝杆菌持续感染小鼠模型

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食管鳞癌EC-9706细胞中mTOR信号通路在TGF-β1介导的EMT中的作用

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肿瘤 2013年第2期33卷 119-125页

作者：王峰轩小燕彭方慧王留兴樊青霞郑州大学第一附属医院肿瘤科河南郑州450052 郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室河南郑州450001

目的:探讨食管鳞癌EC-9706细胞中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路活化在转化生长因子β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)介导的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用。方法:TGF-β1(终质量浓度为7.5ng/mL)或TGF-β1(终质量浓度为7.5ng/mL)+雷帕霉素(终浓度为200nmol/L)作用食管鳞癌EC-9706细胞后,在倒置显微镜下观察细胞形态的变化,RT-PCR及蛋白质印迹法检测EC-9706细胞中mTOR和E-cadherinmRNA及其蛋白的表达,通过Boyden小室实验检测EC-9706细胞侵袭能力的变化。构建裸鼠食管鳞癌EC-9706细胞移植瘤模型,RT-PCR及蛋白质免疫印迹法检测雷帕霉素作用后,移植瘤组织中mTOR和E-cadherinmRNA及其蛋白的表达。结果:TGF-β1作用后,EC-9706细胞梭形化明显,mTORmRNA及p-mTOR蛋白的表达水平高于未进行任何处理的EC-9706细胞对照组(P<0.05),E-cadherin mRNA及其蛋白的表达水平低于对照组(P<0.05),细胞侵袭能力明显高于对照组(P<0.05);TGF-β1+雷帕霉素组EC-9706细胞mTORmRNA及p-mTOR蛋白的表达水平低于TGF-β1单药作用组(P<0.05),E-cadherin mRNA及其蛋白的表达水平高于TGF-β1单药作用组(P<0.05),细胞侵袭能力较TGF-β1单药作用组明显下降(P<0.05)。雷帕霉素作用后,裸鼠食管鳞癌EC-9706细胞移植瘤组织中mTORmRNA及p-mTOR蛋白的表达水平低于对照组(P<0.05),E-cadherin mRNA及其蛋白的表达水平高于对照组(P<0.05)。结论:食管鳞癌EC-9706细胞中mTOR可能参与TGF-β1介导的EMT的发生,mTOR可能作为食管鳞癌基因治疗中的有效靶点发挥作用。

关键词：食管肿瘤转化生长因子β 信号转导雷帕霉素靶蛋白上皮间质转化

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