检索结果-内蒙古大学图书馆

第二军医大学学报 2003年第3期24卷 298-302页

作者：沈毅珺潘卫易进华徐容陈秋莉潘欣冯春芝邓松华戚中田刘彦君第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 上海复旦张江生物医药股份有限公司安徽医科大学病理生理学教研室

目的 :将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体 pCANTAB5X中 ,构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量 (>30 0个氨基酸 )功能蛋白的新型噬菌粒展示载体。方法 :应用 5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ... 详细信息

目的 :将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体 pCANTAB5X中 ,构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量 (>30 0个氨基酸 )功能蛋白的新型噬菌粒展示载体。方法 :应用 5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识别序列的引物 ,PCR扩增获得XbaⅠ StuⅠ SalⅠ KpnⅠ [G4S]3 NotⅠ衔接片段 ,将该PCR产物克隆到pMD 18T中 ,再将该片段插入 pCANTAB 5X中构建成新型噬菌粒展示载体 pCANTAB5L。结果 :限制性内切酶酶谱及DNA序列分析证明[G4S]3多肽接头和限制性内酶切位点XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ序列被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB 5L中。结论 :成功构建了新型噬菌粒展示载体 pCANTAB5L ,并能有效展示功能靶蛋白。

关键词：噬菌体展示噬菌粒载体多克隆位点多肽接头

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HGV RNA基因组感染HepG2细胞的研究

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微生物学通报 2002年第1期29卷 60-64页

作者：任浩朱分禄戚中田第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433

　为了观察HGV　RNA基因组在HepG2细胞中的复制和表达并建立HGV感染的细胞模型,体外转录制备HGV RNA基因组,Lipofectamin介导转染HepG2细胞。取HGV RNA阳性培养上清液传代感染HepG2细胞,采用RT-PCR、免疫组化和Western blot等技术检测HG... 详细信息

　为了观察HGV　RNA基因组在HepG2细胞中的复制和表达并建立HGV感染的细胞模型,体外转录制备HGV RNA基因组,Lipofectamin介导转染HepG2细胞。取HGV RNA阳性培养上清液传代感染HepG2细胞,采用RT-PCR、免疫组化和Western blot等技术检测HGV在HepG2细胞中的复制和表达。HepG2细胞在转染后24h便可在培养上清液中检测到HGV负链RNA,传代感染的细胞及培养上清液中可检测到HGV正、负链RNA。在90d内传代20余次,均能检测到HGV的复制。免疫组化和Western　blot可检测到HGV E2蛋白在感染细胞中的表达。HGV感染细胞经冻存后复苏,仍能检测到 HGV RNA。故 HGV RNA基因组能够在HepG2细胞中复制和表达,此细胞模型有可能用于HGV的复制与感染防治的研究。

关键词：庚型肝炎病毒 HGV RNA基因组 HepG2细胞复制表达

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噬菌体表面展示人干扰素-α 2b

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第二军医大学学报 2002年第4期23卷 403-406页

作者：吴晓兰潘卫马仲才陈秋莉武文斌曹明媚戚中田第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433

目的：建立一种研究人干扰素-α结构与功能的新平台。方法：利用噬菌体表面展示（phage display）技术表达人于扰素-α2b（hIFN-αa2b）基因。结果：生物活性测定表明，3×108TU重组噬菌体干扰素的抗病毒活性与SIU基因工程IFN-α2a... 详细信息

目的：建立一种研究人干扰素-α结构与功能的新平台。方法：利用噬菌体表面展示（phage display）技术表达人于扰素-α2b（hIFN-αa2b）基因。结果：生物活性测定表明，3×108TU重组噬菌体干扰素的抗病毒活性与SIU基因工程IFN-α2a的活性相当，并能被 IFN-α单抗中和。结论：hlFN-α 2b在噬菌体表面能正确折叠和功能性表达，即成功地建立了噬菌体展示外源肽（hIFN-α）的技术平台。

关键词：人干扰素-α 抗病毒活性噬菌体表面展示

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庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

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第二军医大学学报 2002年第11期23卷 1175-1178页

作者：胡卫江王宏卫戚中田李建秀胡以平第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 基础医学部细胞生物学教研室

目的:利用显微注射方法产生整合庚型肝炎病毒(HGV)全基因的转基因小鼠,并研究HGV基因的遗传特性。方法:将含有HGV全长基因的载体线性化后,将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液,依常规方法进行显微注射,得到仔鼠后用PCR及基因组DNA South... 详细信息

目的:利用显微注射方法产生整合庚型肝炎病毒(HGV)全基因的转基因小鼠,并研究HGV基因的遗传特性。方法:将含有HGV全长基因的载体线性化后,将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液,依常规方法进行显微注射,得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者(founder)小鼠,将founder小鼠与正常小鼠交配得到F代小鼠,随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果:共得到5只founder小鼠,其中4只与正常小鼠交配,得到F1代小鼠共41只,其中29只为阳性,阳性率为71％。F2代小鼠共21只,其中16只为阳性,阳性率为76％。结论:得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠,并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。

关键词：制备庚型肝炎病毒转基因小鼠遗传学动物模型

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重组人肿瘤坏死因子a衍生物3a研究的综合报告

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 121-124页

作者：焦炳华娄永华王梁华朱玉平周丙荣第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 基础医学部微生物学教研室

目的 :将采用点突变技术获取的重组人肿瘤坏死因子α衍生物 3a(rh- TNFα- D3a)研究开发为临床新药。方法 :与野生型 TNFα比较 ,采用动物体内抑瘤试验测定其 ED50 ;急性毒性试验测定 L D50 ;长期毒性试验测定安全剂量并观察毒性反应发... 详细信息

目的 :将采用点突变技术获取的重组人肿瘤坏死因子α衍生物 3a(rh- TNFα- D3a)研究开发为临床新药。方法 :与野生型 TNFα比较 ,采用动物体内抑瘤试验测定其 ED50 ;急性毒性试验测定 L D50 ;长期毒性试验测定安全剂量并观察毒性反应发生的程度 ; 期临床试验观察人体可耐受的安全剂量 ; - 期临床试验观察其对肿瘤患者的临床疗效。结果 :rh- TNFα-D3a体内抑瘤的 ED50 为其野生型的 2 / 3;L D50 为野生型的 11倍 ;恒河猴长期毒性的安全剂量为日本同类产品 PT0 5 0的 6 4倍 ; 期临床试验表明 ,≤ 2× 10 6 IU/ (m2· d)× 7d为人体可耐受的安全剂量 ,本品与野生型药物比较 ,其毒性反应的发生率及反应程度远远降低 ; - 期临床试验表明 ,胸腔内注射对恶性胸水 ,静脉途径对多种实体瘤包括恶性淋巴瘤、乳腺癌、恶性黑素瘤和肾癌等均有较好的疗效。结论 :研制新一代高效。

关键词：抗肿瘤药临床试验重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a rh-TNFα-D3a

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重组人肿瘤坏死因子a衍生物3a的克隆与表达

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第二军医大学学报 2002年第2期23卷 125-128页

作者：娄永华焦炳华周丙荣王梁华余伟民朱玉平第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室上海200433 基础医学部微生物学教研室

目的 :寻找具有更强抗肿瘤活性和 (或 )较低毒副作用的 TNFα突变蛋白。方法 :应用巨引物二轮 PCR技术对rh- TNFα的第 80、90和 92位氨基酸编码的密码子进行定点突变 ,经过 DNA序列测定证实 DNA突变准确后 ,将突变基因的c DNA插入 p B... 详细信息

目的 :寻找具有更强抗肿瘤活性和 (或 )较低毒副作用的 TNFα突变蛋白。方法 :应用巨引物二轮 PCR技术对rh- TNFα的第 80、90和 92位氨基酸编码的密码子进行定点突变 ,经过 DNA序列测定证实 DNA突变准确后 ,将突变基因的c DNA插入 p BL载体 ,转化大肠杆菌 DH5α,获得表达 rh- TNFα- D3a的工程菌。结果 :经巨引物二轮 PCR获得表达 TNFα突变蛋白的基因突变 ,经序列测定结果与设计一致 ,重组蛋白表达量占细菌总蛋白 18.0 % ,大部分为可溶性 ,占 rh- TNFα- D3a总量的 6 0 %以上。重组蛋白经纯化 ,纯度 >98%。 rh- TNFα- D3a对 L 92 9细胞表现出较高的细胞毒性 ,比活性大于 5× 10 8IU / mg。与野生型的 rh- TNFα相比 ,rh- TNFα- D3a的毒性降低为野生型的 1/ 10 ,同时其保留了 TNFα的抗肿瘤活性。结论 :rh- TNF-αD3a是一个毒性较低。

关键词：点突变聚合酶链反应重组人肿瘤坏死因子α衍生物3a 克隆 rh-TNF α-D3a

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重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外活性作用的研究

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第二军医大学学报 2002年第3期23卷 261-263页

作者：倪之嘉潘卫王元和戚中田傅宏傅志仁王强第二军医大学长征医院普通外科上海200003 第二军医大学长征医院基础医学部微生物学教研室

目的 :研究表达人内皮细胞抑制素 ( endostatin)的腺病毒载体的体外活性作用。方法 :用重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外转染人结肠癌 SW62 0细胞 ,观察肿瘤细胞生长情况 ,并观察其上清对大鼠肺毛细血管内皮细胞、新生牛主动脉内皮... 详细信息

目的 :研究表达人内皮细胞抑制素 ( endostatin)的腺病毒载体的体外活性作用。方法 :用重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外转染人结肠癌 SW62 0细胞 ,观察肿瘤细胞生长情况 ,并观察其上清对大鼠肺毛细血管内皮细胞、新生牛主动脉内皮细胞及人脐静脉内皮细胞生长的影响。结果 :MTT法检查证实重组腺病毒对结肠癌细胞生长无抑制 ,锥虫蓝染色证实转染的人结肠癌 SW62 0细胞上清对各种血管内皮细胞的生长均有较强的抑制作用。结论 :重组人内皮细胞抑制素腺病毒载体体外对各种血管内皮细胞生长均有较强的抑制作用。

关键词：重组人内皮细胞抑制素腺病毒科血管内皮体外活性

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利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2002年第4期22卷 385-388页

作者：李爱玲孙瑛勋洪海燕于鸣赵法伋郭俊生沈倍奋第二军医大学军队卫生教研室上海200433 军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室第二军医大学微生物学教研室

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴... 详细信息

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。

关键词：基因重组抗原 CD20基因单克隆抗体细胞凋亡间接免疫荧光法免疫沉淀法流式细胞术抗体制备

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影响人干细胞因子基因高效表达的因素探讨

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免疫学杂志 2002年第3期18卷 225-228页

作者：洪海燕戚中田赖春宁冯健男王建安刘涛沈倍奋第二军医大学微生物学教研室上海200433 军事医学科学院基础医学研究所分子免疫室北京100850

目的分析SD序列长度、基因起始码ATG和终止码TAA上下游处RNA的二级结构及密码子偏性等影响表达效率的主要因素,以期实现重组人干细胞因子在原核细菌中高效表达。方法分析并修改编码人SCF氨基酸的密码子,分段合成改造后的基因,PCR一次... 详细信息

目的分析SD序列长度、基因起始码ATG和终止码TAA上下游处RNA的二级结构及密码子偏性等影响表达效率的主要因素,以期实现重组人干细胞因子在原核细菌中高效表达。方法分析并修改编码人SCF氨基酸的密码子,分段合成改造后的基因,PCR一次性完成拼接,将基因克隆到pBV-220载体上,诱导表达。结果天然人SCF基因在pBV-220载体的表达占菌体总蛋白的9.5％,基因改造后SCF占菌体总蛋白的27％,表达的蛋白能够为SCF的单克隆抗体所识别,初步纯化的SCF蛋白纯度大于80％,能够促进Mo7e细胞的增殖活性。结论密码子偏性是影响SCF在原核细菌中高效表达的主要因素,通过改变密码子偏性能过实现高效表达。

关键词： pBV-220 RNA 二级结构蛋白表达全基因合成干细胞因子

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从随机9肽库中筛选HCV抗原表位

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中国免疫学杂志 2002年第12期18卷 836-838页

作者：柯屾戚中田温新宇施明赵平沈倍奋解放军总医院基础医学研究所北京100853 第二军医大学微生物学教研室上海200433 军事医学科学院基础医学研究所北京100850

目的 :用患者血清中抗HCV抗体从随机 9肽库中筛选HCV抗原表位。方法 :将病人血清用硫酸铵粗提后 ,用ProteinA亲和层析柱纯化和制备抗HCV多克隆抗体 ;以此为筛选配基 ,对噬菌体表面展示的随机 9肽库进行亲和筛选。结果 :三轮筛选的投入... 详细信息

目的 :用患者血清中抗HCV抗体从随机 9肽库中筛选HCV抗原表位。方法 :将病人血清用硫酸铵粗提后 ,用ProteinA亲和层析柱纯化和制备抗HCV多克隆抗体 ;以此为筛选配基 ,对噬菌体表面展示的随机 9肽库进行亲和筛选。结果 :三轮筛选的投入产出比逐轮升高至 5 0× 10 - 3 、假阳性率逐轮降低至 0 2 % ,提示具有良好的富集效果。从第三轮挑选出的 15个克隆进行结合试验 ,发现 7个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应 ;测序表明 6个克隆的外源肽含有核心序列SPVAXVLXT。用阳性噬菌体克隆检测 2 0例病人血清 ,有程度不等的阳性反应。结论 :用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位。

关键词：噬菌体随机肽库抗原表位丙型肝炎病毒 HCV

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