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武警医学院学报 2006年第5期15卷 423-426,F0004页

作者：王文良焦炳华杨柳唐康来白春宏刘英杰吕丹武警医学院附属医院骨科天津300162 第二军医大学微生物学教研室上海200433 第三军医大学附属西南医院骨科重庆400037

[目的]研究磨损颗粒刺激单核细胞thp-1后,细胞分泌TNF含量和刺激后条件培养基引起成骨细胞的凋亡。[方法]L929细胞测活和ELISA方法检测单核细胞TNF-α的分泌和分泌的量;TUNEL方法检测磨损颗粒条件培养基对成骨细胞的凋亡作用。[结果]不... 详细信息

[目的]研究磨损颗粒刺激单核细胞thp-1后,细胞分泌TNF含量和刺激后条件培养基引起成骨细胞的凋亡。[方法]L929细胞测活和ELISA方法检测单核细胞TNF-α的分泌和分泌的量;TUNEL方法检测磨损颗粒条件培养基对成骨细胞的凋亡作用。[结果]不同种类磨损颗粒加入thp-1后TNF-α的结果用方差分析比较, 3组数据之间有显著性差异(P<0．05)。将不同颗粒的100 ng／ml组和10 ng／ml组分别两两比较,两组之间结果有显著性差异(P<0．05),100 ng／ml比10 ng／ml TNF值高。[结论]磨损颗粒PE、Co-Cr-Mo、Ti-6Al-4V刺激体外培养单核细胞thp-1分泌TNF-α,3种磨损颗粒之间有显著差异(P<0．05)。磨损颗粒PE、Co-Cr-Mo、Ti-6Al-4V刺激单核细胞thp-1的条件培养基可以引起体外培养成骨细胞凋亡。

关键词：磨损颗粒凋亡 TNF-α成骨细胞松动人工关节

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噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

噬菌体展示重组人淋巴毒素突变体库及受体亲和筛选

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第15次全国干扰素及细胞因子学术会议

作者：沈毅珺刘彦君郑海音潘卫许燕王征杨彤谭靖伟吴劲松吴芳曹峰第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433 上海复旦张江生物医药股份有限公司上海201203 上海复旦张江生物医药股份有限公司上海201203 上海市中医医院上海200032 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433

淋巴毒素(lymphotoxin,LT)通过TNFR1受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性.对LT的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素(rhLT)R46,S106,L130三点随机突变组合文库和S106～F110区域随机突变体库.噬菌体库与固相化T... 详细信息

淋巴毒素(lymphotoxin,LT)通过TNFR1受体传递凋亡信号,从而发挥抗肿瘤活性.对LT的受体结合区域进行多点随机突变,利用噬菌体展示重组人淋巴毒素(rhLT)R46,S106,L130三点随机突变组合文库和S106～F110区域随机突变体库.噬菌体库与固相化TNFR1受体进行亲和筛选,富集了能与TNFR1受体结合的rhLT突变体.随机挑选20个单克隆噬菌体进行ELISA受体结合鉴定,其中80％的克隆与TNFR1受体特异性结合,25％的克隆与TNFR1受体的结合能力高于野生型序列的rhLT.将结合力高的4个突变体克隆于pET32a(+)载体,经过大肠杆菌表达和纯化操作后,检测这些突变体蛋白与TNTR1受体的结合活性和对L929细胞的杀伤活性,发现3个克隆的受体结合性质与其展示于噬菌体上时基本吻合,其中C199克隆与TNFR1的结合活性比野生型序列的rhLT提高了近30％,且其对L929细胞的杀伤活性提高了近90％.应用噬菌体展示技术对淋巴毒素进行体外进化研究的尝试,为下一步的蛋白质结构和功能研究提供了思路,可成为大分子药物开发的有效工具.

关键词：淋巴毒素随机突变噬菌体亲和筛选

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糖基化与HCVE2诱导的体液免疫应答相关性的研究

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微生物学杂志 2006年第5期26卷 19-22页

作者：李平飞李艳梅赵兰娟刘敏万崎陈新文章晓联武汉大学病毒学国家重点实验室基础医学院免疫学系和过敏及其免疫相关疾病湖北省重点实验室湖北武汉430071 清华大学生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室第二军医大学微生物学教研室中国科学院武汉病毒研究所湖北武汉430071

检测丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)包膜蛋白E2糖基化位点对体液免疫功能的影响。野生型E2基因和糖基化突变体型E2基因的真核表达质粒DNA分别肌肉注射BALB/C小鼠,免疫3次,末次免疫后第10 d,眼眶摘眼球取血清,断椎处死小鼠,同时设... 详细信息

检测丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)包膜蛋白E2糖基化位点对体液免疫功能的影响。野生型E2基因和糖基化突变体型E2基因的真核表达质粒DNA分别肌肉注射BALB/C小鼠,免疫3次,末次免疫后第10 d,眼眶摘眼球取血清,断椎处死小鼠,同时设阴性对照和空载质粒对照。血清标本用ELISA检测特异性IgG及其亚类IgG1I、gG2α表达水平,观测特异性体液免疫反应和脾细胞分泌细胞因子水平。与阴性对照和空载组对比,E2和N-糖基化突变体质粒DNA免疫小鼠都能诱导产生强烈的特异性免疫反应(P<0.01),并且N-糖基化突变体(560、576位糖基化突变体)质粒DNA与野生型E2相比,其特异性IgG效价明显降低(P<0.05),IL-4分泌水平明显降低(P<0.05)。E2糖蛋白的560、576位N-糖基化位点是诱导体液免疫反应所需要的,除去560、576位N-糖基化会降低E2诱导的体液免疫应答。

关键词： HCV 包膜蛋白糖基化体液免疫

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糖基化与HCVE2诱导的体液免疫应答相关性的研究

糖基化与HCVE2诱导的体液免疫应答相关性的研究

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第五届全国感染与免疫及生物制品学术研讨会

作者：李平飞李艳梅赵兰娟刘敏万崎陈新文章晓联武汉大学病毒学国家重点实验室基础医学院免疫学系和过敏及其免疫相关疾病湖北省重点实验室湖北武汉430071 中国科学院武汉病毒研究所湖北武汉430071 清华大学生命有机磷化学及化学生物学教育部重点实验室第二军医大学微生物学教研室

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)包膜蛋白E2糖基化位点对体液免疫功能的影响.野生型E2基因和糖基化突变体型E2基因的真核表达质粒DNA分别肌肉注射BALB/C小鼠,免疫 3 次,末次免疫后第 10 d,眼眶摘眼球取血清,断椎处死小鼠,同时设阴... 详细信息

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)包膜蛋白E2糖基化位点对体液免疫功能的影响.野生型E2基因和糖基化突变体型E2基因的真核表达质粒DNA分别肌肉注射BALB/C小鼠,免疫 3 次,末次免疫后第 10 d,眼眶摘眼球取血清,断椎处死小鼠,同时设阴性对照和空载质粒对照.血清标本用ELISA检测特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2α表达水平,观测特异性体液免疫反应和脾细胞分泌细胞因子水平.与阴性对照和空载组对比,E2和N-糖基化突变体质粒DNA免疫小鼠都能诱导产生强烈的特异性免疫反应(P＜0.01),并且N-糖基化突变体(560、576 位糖基化突变体)质粒DNA与野生型E2相比,其特异性IgG效价明显降低(P＜0.05),IL-4分泌水平明显降低(P＜0.05).E2糖蛋白的 560、576 位N-糖基化位点是诱导体液免疫反应所需要的,除去 560、576 位N-糖基化会降低E2诱导的体液免疫应答.

关键词： HCV 包膜蛋白糖基化体液免疫

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丙型肝炎疫苗的研究进展

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免疫学杂志 2005年第B06期21卷 25-27,31页

作者：廖小玲戚中田第二军医大学微生物学教研室上海200433

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的严重威胁人类健康的传染病,目前还没有研制成功有效的预防性疫苗,HCV基因组的高度变异及缺乏易感动物模型一直是妨碍丙肝疫苗发展的瓶颈。随着对HCV免疫清除机制的逐渐认识,... 详细信息

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)感染而引起的严重威胁人类健康的传染病,目前还没有研制成功有效的预防性疫苗,HCV基因组的高度变异及缺乏易感动物模型一直是妨碍丙肝疫苗发展的瓶颈。随着对HCV免疫清除机制的逐渐认识,诱导交叉反应性中和抗体和细胞免疫应答已成为丙肝疫苗研究的基本方向。本文概述了免疫应答在控制HCV感染过程中的作用以及当前丙肝疫苗的研究策略,并分析了丙肝疫苗的发展前景。

关键词：丙型肝炎病毒疫苗中和抗体细胞免疫应答

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噬菌体展示protein A及protein L Ig结合单结构域随机组合文库及Ig亲和筛选

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生物化学与生物物理进展 2005年第6期32卷 535-543页

作者：徐容沈毅臖邓松华蔡春晓陈秋莉贾建安王锦红潘欣潘卫安徽医科大学病理生理学教研室合肥230032 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433

ProteinA和proteinL是细菌产生的两种结构和功能均不同的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)结合分子,在细菌的致病中起重要作用.用含SacⅠ位点的特定引物PCR分别扩增制备proteinA的A、B、C、D抗体结合结构域和proteinL的B3抗体结合结构域,... 详细信息

ProteinA和proteinL是细菌产生的两种结构和功能均不同的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)结合分子,在细菌的致病中起重要作用.用含SacⅠ位点的特定引物PCR分别扩增制备proteinA的A、B、C、D抗体结合结构域和proteinL的B3抗体结合结构域,各结构域DNA片段经SacⅠ酶切后,再随机连接形成各种不同长度的分子组合文库,将该文库呈现在噬菌体表面构建了噬菌体展示Ig结合分子单结构域随机组合文库,所建组合文库容量为2.3×106个菌落形成单位,滴度为4.1×1011TU/ml,包含各种单结构域片段,并以随机方式连接.用人Ig对该文库进行4轮亲和筛选,随机挑选36个代表性的阳性克隆进行序列测定分析表明,亲和筛选获得了多种非天然形式存在的新的Ig结合分子结构,其中32个克隆具有由proteinL的单结构域和proteinA的单结构域间隔重复排列而成的特征性(MDPL-MDPA)n结构.对噬菌体展示Ig结合分子单结构域随机组合文库的体外分子进化研究的尝试,为Ig结合分子的结构和功能研究提供了一新的途径,也为Ig结合分子的定向改造打下基础.

关键词：噬菌体展示分子进化结构域组合文库 protein A protein L

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新型血管生成抑制人内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子_(151)治疗胃癌的实验研究

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中华实验外科杂志 2005年第2期22卷 230-234,F003页

作者：李喆方国恩闻兆章华积德曹贵松毕建威戚中田潘卫第二军医大学附属长海医院普通外科上海200433 第二军医大学微生物学教研室

目的　研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用。方法　构建携带hENDO VEGI151融合基因的重组腺病毒载体 ,脂质体介导法包装重组腺病毒AdIL 3 /hENDO VEGI151。体... 详细信息

目的　研究重组腺病毒表达的人内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子151(hENDO VEGI151)融合蛋白对胃癌的抑制作用。方法　构建携带hENDO VEGI151融合基因的重组腺病毒载体 ,脂质体介导法包装重组腺病毒AdIL 3 /hENDO VEGI151。体外检测融合基因的表达及融合蛋白的生物学活性。应用鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM )模型及荷人胃癌裸鼠模型 ,进一步观察融合蛋白对活体血管生成的影响和融合基因治疗活体胃癌的疗效。结果　用TCID50 法测定携带融合基因的重组腺病毒滴度为 4.2× 10 11TCID50 /ml;用聚合酶链反应 (PCR)、逆转录 (RT) PCR和免疫组织化学方法证实融合基因可被转导入SGC 790 1细胞内并稳定高效地转录和表达 ;Westernblot显示融合蛋白可被分泌到胞外发挥作用 ;融合蛋白可强烈抑制ECV 3 0 4细胞生长及鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成。AdIL 3 /hENDO VEGI151治疗可强烈抑制裸鼠体内种植瘤生长 ,明显下调肿瘤微血管密度 ,促进胃癌细胞凋亡。结论　hENDO VEGI151是一条新型强效的肿瘤血管生成抑制基因 ,其表达产物可能通过作用于肿瘤新生血管形成的不同环节强烈抑制新血管生成和肿瘤生长 ,值得进一步研究。

关键词：治疗融合基因胃癌人内皮细胞融合蛋白血管内皮细胞重组腺病毒 VEGI 生长抑制因子血管生成抑制

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DC-SIGN和L-SIGN与丙型肝炎病毒感染

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生命的化学 2005年第4期25卷 287-290页

作者：陈秋莉戚中田第二军医大学微生物学教研室上海200433

近年来发现的树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)及其相关分子L-SIGN与丙型肝炎病毒的致病机制及其感染的慢性化有关,该文介绍DC-SIGN和L-SIGN的发现、生... 详细信息

近年来发现的树突细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin,DC-SIGN)及其相关分子L-SIGN与丙型肝炎病毒的致病机制及其感染的慢性化有关,该文介绍DC-SIGN和L-SIGN的发现、生物学特点及其与丙型肝炎病毒相互作用的研究进展。

关键词：丙型肝炎病毒受体感染 DC—SIGN L—SIGN

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Ad-VEGI_(151)对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

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第二军医大学学报 2005年第9期26卷 1006-1008页

作者：刘银萍柳林潘欣徐琪潘东艳第二军医大学长海医院眼科上海200433 第二军医大学微生物学教研室上海200433

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用。方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质... 详细信息

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用。方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达。X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达。结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法。Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质。结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法。

关键词：血管内皮细胞生长抑制因子基因治疗腺病毒载体

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内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子_(151)融合基因治疗胃癌的作用及其机制

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中华实验外科杂志 2005年第10期22卷 1186-1189页

作者：李喆方国恩华积德毕建威潘欣戚中田第二军医大学附属长海医院普通外科上海200433 第二军医大学附属长海医院基础部微生物学教研室上海200433

目的探讨新型内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因(hENDOVEGI151)治疗胃癌的作用机制。方法应用重复感染系数(MOI=100)的重组腺病毒AdhENDOVEGI151转染胃癌SGC7901、MKN28细胞和血管内皮ECV304细胞4h后,继续培养6d,噻唑... 详细信息

目的探讨新型内皮细胞抑制素血管内皮细胞生长抑制因子151融合基因(hENDOVEGI151)治疗胃癌的作用机制。方法应用重复感染系数(MOI=100)的重组腺病毒AdhENDOVEGI151转染胃癌SGC7901、MKN28细胞和血管内皮ECV304细胞4h后,继续培养6d,噻唑蓝(MTT)比色法检测第1至6天3种细胞的存活率;流式细胞仪(FCM)丙化碘锭(PI)单染色法检测转染后48h胃癌和内皮细胞凋亡的情况;应用DNA片断化试验分析转染后12、24、36、48h时ECV304凋亡情况;应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)和蛋白印迹法(Westernblot)检测融合基因转染对SGC7901表达促血管生成因子VEGF165的影响。结果AdhENDOVEGI151治疗强烈抑制ECV304增殖,72h抑制率为55.18%,144h抑制率89.86%;FCM检测出现明显凋亡峰,凋亡细胞约占(20.70±5.83)%,并且出现G1期阻滞(65.41±2.38)%和S期明显减少(21.81±1.52)%,与AdLacZ组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);转染组细胞DNA出现典型的梯形条带,尤以转染后24～36h最为明显,AdLacZ组及对照组DNA无裂解。AdhENDOVEGI151转染对胃癌细胞无直接毒性作用,但明显下调胃癌细胞VEGF165的表达水平。结论AdhENDOVEGI151治疗一方面强烈抑制内皮细胞增殖,诱导凋亡;另一方面抑制胃癌细胞表达VEGF165,多角度联合抑制肿瘤新生血管形成,使肿瘤细胞因缺血而发生大量凋亡。

关键词：胃癌基因治疗血管内皮细胞生长抑制因子151 血管内皮细胞生长抑制因子融合基因治疗内皮细胞抑制素胃癌细胞 ECV-304细胞 SGC-7901 肿瘤新生血管形成

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