检索结果-内蒙古大学图书馆

中华流行病学杂志 2009年第7期30卷 663-667页

作者：刘静杨洋宫菊丽张子宁张旻王亚男姜拥军戚中田潘启超钟平尚红中国医科大学附属第一医院卫生部艾滋病免疫学重点实验室沈阳110001 解放军第二军医大学微生物教研室上海市预防医学研究院艾滋病病毒免疫研究室

目的了解中国部分地区HIV-1和HCV合并感染人群中HCV基因亚型的流行、分布及其与HIV-1感染疾病进展的关系。方法对186份获自河南、云南、新疆、吉林和辽宁省HW-1／HCV合并感染人群标本（HCV病毒载量〉1000cop／ml），用反转录巢式聚合酶... 详细信息

目的了解中国部分地区HIV-1和HCV合并感染人群中HCV基因亚型的流行、分布及其与HIV-1感染疾病进展的关系。方法对186份获自河南、云南、新疆、吉林和辽宁省HW-1／HCV合并感染人群标本（HCV病毒载量〉1000cop／ml），用反转录巢式聚合酶链反应方法扩增血浆HCV核心基因区并进行基因亚型分型，同时检测HIV-1和HCV载量以及CD4＋T细胞计数。结果（1）HCV不同基因亚型比例分别为1a（1．7％）、1b（39．9％）、2a（17．9％）、3a（10．4％）、3b（15．6％）、6a（1．2％）、6n（6．4％）和6型未鉴定亚型（7．5％）。HCV2a和1b主要流行于河南省既往有偿献血浆人员中；3a和3b亚型主要流行于新疆和云南静脉注射吸毒者（IDU）中；HCV6型主要流行于云南吸毒人员中。（2）1b亚型的HCVRNA水平显著高于非1b亚型，但在HIV-1载量和CD4＋T细胞数方面差异无统计学意义。2a亚型的HIV-IRNA和HCVRNA水平显著低于非2a亚型。结论HW-1／HCV合并感染人群中HCV基因亚型的流行和分布与流行地区和感染途径有关。新的HCV6型亚型病毒株已经在合并感染的IDU人群中流行。尚未发现HCV基因亚型与HIV感染疾病进展之间的关系。

关键词：丙型肝炎病毒人免疫缺陷病毒合并感染基因亚型

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缺失半胱氨酸富集区的HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的高效表达及免疫原性分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第5期28卷 404-410页

作者：陈璐邓松华曹洁何俊陈秋莉蒋少华廖文婷潘卫第二军医大学微生物教研室上海200433 安徽医科大学病理生理学教研室合肥230032

目的删除人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）HXB2株Tat罗白（长度101个氨基酸）的半胱氨酸富集区（22～37位氨基酸）以提高其在大肠杆菌中的表达量因子稳定性，并分析缺失半胱氨酸富集区后的Tat蛋白[Tat（ΔC）蛋白]免疫原性的改变。方法应用... 详细信息

目的删除人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）HXB2株Tat罗白（长度101个氨基酸）的半胱氨酸富集区（22～37位氨基酸）以提高其在大肠杆菌中的表达量因子稳定性，并分析缺失半胱氨酸富集区后的Tat蛋白[Tat（ΔC）蛋白]免疫原性的改变。方法应用PCR方法对Tat基因的半胱氨酸富集区（64—111位核苷酸）进行缺失突变，获得其突变体序列[Tat（ΔC）DNA]，并构建其重组表达质粒pET-32a-Tat（ΔC）。相同的条件下将pET-32a-Tat（Δc）和***质粒转人大肠杆菌B121（DE3）中进行诱导表达及纯化。用pET-32a-Tat（ΔC）融合蛋白免疫家兔制备抗血清，ELISA和Western blot方法对抗血清进行免疫原性分析。结果pET-32a-Tat（ΔC）蛋白在大肠杆菌中的表达水平（7．12mg／m1）明显高于pET-32a-Tat蛋白（1．50mg／m1）；pET-32a-Tat蛋白在表达纯化后及25℃和4℃放置7d后均有明显二聚体的产生，而pET-32a-Tat（ΔC）蛋白则未形成二聚体；pET-32a-Tat（Δc）蛋白免疫家兔可诱导产生高滴度的抗体（1：320000），该抗体与Tat（Δc）蛋白、Tat蛋白（1—101AA）及化学合成Tat（1～86AA）蛋白均呈特异性反应。结论缺失HIV-1 Tat蛋白的半胱氨酸富集区可明显提高其原核表达水平和蛋白的稳定性并较好地保留其免疫原性，为HIV-1 Tat疫苗研究提供了一种新型免疫原。

关键词：人免疫缺陷病毒Ⅰ型半胱氨酸富集区缺失 Tat蛋白

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HIV-1 HXB2株蛋白酶的原核表达、纯化及其Gag蛋白CAP2NC的切割活性分析

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第二军医大学学报 2008年第4期29卷 365-370页

作者：陈铭潘欣贾建安何俊蒋少华陈璐姚静娟陈秋莉曹洁潘卫第二军医大学基础部微生物学教研室上海200433 安徽医科大学病理学教研室合肥230032 第二军医大学长征医院感染科上海200003

目的:原核表达、纯化HIV-1型HXB2株蛋白酶(protease,PR),用于对HIV-1 Gag P2/NC蛋白酶切割位点序列随机突变的噬菌体展示文库的切割筛选及构建新的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)类药物体外筛选模型。方法:根据HIV-1 HXB2株PR DN... 详细信息

目的:原核表达、纯化HIV-1型HXB2株蛋白酶(protease,PR),用于对HIV-1 Gag P2/NC蛋白酶切割位点序列随机突变的噬菌体展示文库的切割筛选及构建新的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)类药物体外筛选模型。方法:根据HIV-1 HXB2株PR DNA序列设计引物,在PR序列上游添加自切割位点MGTVSFNF 8个氨基酸编码获得PR107 DNA编码序列,将PR107 DNA克隆至原核表达载体pET-32a,序列测定后转化大肠杆菌BL21 DE3进行诱导表达。表达产物经用Ni-NTA亲和柱纯化,经复性后,进行靶蛋白CAP2NC切割试验,SDS-PAGE检测切割结果。结果:成功合成了使用大肠杆菌偏好密码子的HIV-1 PRl07的DNA编码序列,序列测定显示其编码氨基酸序列与原始序列完全一致;成功构建了HIV-1 PR原核表达质粒pETa2a—PR107,转化大肠杆菌BL21 DE3经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为30 000的HIV-1 PR融合蛋白,纯化的目的蛋白浓度为2.54 mg/ml;纯化蛋白经复性后具有对底物蛋白CAP2NC的切割活性,该作用能被PI药物抑制。结论:成功构建大肠杆菌偏好密码子带自切割位点的HIV-1 PR原核表达载体pET32a—PR107,在大肠杆菌中表达,经纯化复性获得了具有切割活性的HIV-1 PR融合蛋白。

关键词： HIV 蛋白酶基因表达切割

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HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析

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安徽医科大学学报 2008年第3期43卷 239-243页

作者：陈璐潘卫曹洁卢海妹何俊蒋少华唐萍李存枚廖文婷邓松华安徽医科大学病理生理教研室合肥230032 第二军医大学微生物教研室上海200433

目的研究对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HXB2株调控蛋白Tat原核表达产生影响的区域和Tat蛋白重要的抗原表位。方法用PCR方法获得Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa),并转入***21(DE3)中进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物。采用间接ELISA方法用兔抗pET32a-Tat抗血清对三种肽段进行免疫原性分析。结果成功构建了pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)质粒,分别表达出相对分子质量(Mr)为23×103、23×103和25×103的融合肽段,其浓度分别为4.26、3.35和5.11mg/ml。间接ELISA结果表明三种融合肽段与兔抗pET32a-Tat抗血清均呈特异性结合反应,其抗体滴度分别为1:128000、1:32000、1:64000,而抗血清与pET32a蛋白仅有较弱结合。结论半胱氨酸富集区(22-37位氨基酸)对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。

关键词： HIV-1/遗传学大肠杆菌/遗传学基因产物,tat/遗传学基因表达

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pGL3-hTERT-tk／GCV对胃癌细胞的促凋亡作用

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中国肿瘤生物治疗杂志 2008年第3期15卷 233-237页

作者：邓志华杨长青王桂琴王晶晶山西医科大学第二医院消化科山西太原030001 山西医科大学基础医学院微生物与免疫学教研室山西太原030001

目的:探讨重组质粒pGL3-hTERT-tk/GCV对胃癌细胞的促凋亡作用。方法:以基因工程方法构建重组质粒pGL3-hTERT-tk和相应的荧光报告质粒pGL3-hTERT-tk-Luc^+;脂质体Lipofectamine^(TM)2000瞬时转染胃癌细胞系SGC-7901并用GCV干预,荧光显微镜观察细胞形态变化和转染效率,TUNEL标记和流式细胞术观察转染后胃癌细胞的凋亡;以上实验均以正常肝细胞L-02为对照。结果:经鉴定,重组质粒pGL3-hTERT-tk中tk片段的长度为1100 bp。荧光素酶标记的阳性、阴性对照及治疗报告质粒pGL3-hTERT-tk-Luc^+均能有效转染高表达端粒酶活性的胃癌细胞SGC-7901,转染效率为(8.2±1.14)%。重组质粒转染胃癌细胞后与GCV共育4 d,细胞的凋亡率为(60.0±1.56)%;被pGL3-hTERT-tk转染的肿瘤细胞细胞周期发生了变化,处于细胞周期早期的细胞大量凋亡,早期凋亡率为(47.1±1.35)%。结论:pGIB-hTERT-tk/GCV对胃癌细胞有强烈的杀伤作用,但不影响正常细胞的生长,有潜在临床应用前景。

关键词：胃癌基因治疗 hTERT启动子自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶

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双歧三联活菌治疗肠易激综合征的临床多中心研究

双歧三联活菌治疗肠易激综合征的临床多中心研究

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第六届全国儿科微生态学学术会议暨儿科微生态学新进展学习班

作者：上海市双歧三联活菌协作组徐正婕王兴鹏江石湖袁耀宗刘文忠谢渭芬李兆申洪秀华交通大学附属上海市第一人民医院消化科上海第二医科大学附属瑞金医院消化科上海第二医科大学附属仁济医院消化研究所第二军医大学附属长征医院消化科第二军医大学附属长海医院消化科第二医科大学微生物教研室

目的观察双歧三联活菌对腹泻型肠易激综合征(IBS)的疗效和安全性。方法采用多中心、随机、开放的临床试验。97例腹泻型IBS患者口服双歧三联活菌胶囊27d。记录并量化治疗前、后患者的症状和大便性状,检查血、尿、粪常规,记录治疗中的不... 详细信息

目的观察双歧三联活菌对腹泻型肠易激综合征(IBS)的疗效和安全性。方法采用多中心、随机、开放的临床试验。97例腹泻型IBS患者口服双歧三联活菌胶囊27d。记录并量化治疗前、后患者的症状和大便性状,检查血、尿、粪常规,记录治疗中的不良事件;7例患者服药前后前后进行选择性粪细菌培养。结果口服双歧三联活菌27d后,患者各项IBS症状评分明显下降,各项症状改善率为74.2%～87.6%,大便Bristol评分显著下降。粪细菌培养显示口服双歧三联活菌使乳杆菌和肠球菌在肠道定植。不良事件2例,与服药无关。结论双歧三联活菌可明显改善腹泻型IBS的症状,且安全性高,耐受性好。

关键词：肠易激综合征双歧三联活菌

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HIV Gag CAP2NC噬菌体蛋白酶切割模型的构建

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生物化学与生物物理进展 2007年第3期34卷 317-325页

作者：贾建安周波蒋少华陈秋莉赵平潘欣温宗梅邓松华卢洪洲潘卫第二军医大学微生物教研室上海200433 安徽医科大学病理学教研室合肥230032 上海市公共卫生中心上海201508

HIV蛋白酶(protease,PR)耐药突变的大量出现严重地影响了AIDS的治疗.应用突变PR对展示HIVPR靶序列随机文库的噬菌体进行切割筛选,可获得突变PR的敏感噬菌体,该噬菌体可用于针对HIVPR耐药突变株的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)新... 详细信息

HIV蛋白酶(protease,PR)耐药突变的大量出现严重地影响了AIDS的治疗.应用突变PR对展示HIVPR靶序列随机文库的噬菌体进行切割筛选,可获得突变PR的敏感噬菌体,该噬菌体可用于针对HIVPR耐药突变株的蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)新药筛选.为了探索这一可能性,将包含HIVPR靶位点P2/NC序列的Gag蛋白CAP2NC片段展示于噬菌体表面,并在该片段的N端连接一可与人免疫球蛋白分子特异结合的固相化标签序列LD3,将该噬菌体固定于人免疫球蛋白包被的酶标板上,用HIVSF2PR进行切割,用抗M13噬菌体酶标抗体ELISA法检测未被切割的剩余噬菌体以反映切割效果.结果表明,所构建的噬菌体能被HIVPR有效切割,最大切割效应可达80%以上,其ELISA检测值明显下降,并且该切割效应与HIVPR呈明显的量效关系,能被PI类药物Indinavir(IDV)特异抑制.首次成功构建了展示HIV Gag CAP2NC片段的噬菌体蛋白酶切割模型,不仅可为研究HIVPR的耐药性变异及其靶序列的适应性变异提供一新的研究平台,同时也为构建一种全新的PI类药物,尤其是针对耐药的PI类药物大规模体外噬菌体筛选模型打下基础.

关键词：人类免疫缺陷病毒蛋白酶蛋白酶抑制剂药物筛选噬菌体展示

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进化免疫球蛋白结合分子LD5的原核表达、纯化及结合活性

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中国生物制品学杂志 2007年第5期20卷 322-326页

作者：蒋少华徐容何俊陈璐卢海妹贾建安陈秋莉潘卫第二军医大学微生物教研室上海200433 安徽医科大学病理生理教研室合肥230032

目的对新型进化免疫球蛋白(Ig)结合分子LD5进行原核表达和纯化,并鉴定其结合活性。方法将LD5基因片段克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达。以8mol/L尿素裂解菌体后,上清经Ni2+-NTA柱纯化,并对纯化蛋白进行SDS-PAG... 详细信息

目的对新型进化免疫球蛋白(Ig)结合分子LD5进行原核表达和纯化,并鉴定其结合活性。方法将LD5基因片段克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌后,IPTG诱导表达。以8mol/L尿素裂解菌体后,上清经Ni2+-NTA柱纯化,并对纯化蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析。以ELISA和Dot blot对LD5蛋白结合IgG、IgM活性进行鉴定。结果LD5分子在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白相对分子质量为59000。Western blot表明纯化的LD5蛋白能特异结合IgG。ELISA结果显示,LD5在结合IgM上较SpA具有明显的优势。结论LD5分子在大肠杆菌中已成功表达,纯化的LD5蛋白保留了天然Ig结合分子的结合活性。

关键词：进化免疫球蛋白结合分子原核表达结合活性

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噬菌体展示耐药突变HIV-1蛋白酶敏感切割位点六肽随机文库的构建

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中国药理学通报 2007年第3期23卷 403-406页

作者：卢海妹周波潘卫贾建安王锦红温宗梅何俊陈露邓松华安徽医科大学病理生理学教研室合肥230032 第二军医大学基础医学部微生物学教研室上海200433

目的构建耐药性突变HIV-1蛋白酶(protease PR)敏感切割位点序列体外噬菌体筛选模型,研究HIV-1蛋白酶耐药性突变与敏感切割序列的关系。方法用含随机核苷酸序列的引物PCR方法对HIV-1gag基因上的CAP2片段的PR切割位点处的氨基酸序列进行... 详细信息

目的构建耐药性突变HIV-1蛋白酶(protease PR)敏感切割位点序列体外噬菌体筛选模型,研究HIV-1蛋白酶耐药性突变与敏感切割序列的关系。方法用含随机核苷酸序列的引物PCR方法对HIV-1gag基因上的CAP2片段的PR切割位点处的氨基酸序列进行随机化,再将重组CAP2片段和NC片段拼接克隆于噬菌体展示载体LD3-pCANT-AB5S上,建立HIV-1蛋白酶靶蛋白切割位点随机化的噬菌体展示文库。结果该噬菌体展示文库库容量为2.6×106,滴度为4.1×1015TU·L-1,CAP2片段插入率为47.8%;序列分析显示切割位点中随机化的核苷酸与氨基酸均呈随机性分布。结论成功地构建HIV-1蛋白酶的敏感切割序列噬菌体筛选文库,为筛选到突变PR敏感切割序列噬菌体及研究耐药HIV-1蛋白酶抑制剂与突变PR的关系打下基础。

关键词：人类免疫缺陷病毒-1 蛋白酶耐药突变噬菌体展示文库

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噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库的构建

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安徽医科大学学报 2007年第2期42卷 128-132页

作者：何俊周霞陈璐陈秋莉王锦红蒋少华陈铭卢海妹潘卫邓松华安徽医科大学病理生理学教研室合肥230032 山西省临床检验中心太原030001 第二军医大学微生物教研室上海200433

目的构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及结构和功能的研究打下基础。方法应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域。用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z... 详细信息

目的构建噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,为应用各种类型免疫球蛋白对该文库进行体外分子进化筛选及结构和功能的研究打下基础。方法应用overlapping PCR制备Protein A的Z结构域。用含随机核苷酸序列的引物,制备对Z结构域的第10、13、27、28、31和32位氨基酸进行随机突变的定点随机突变体库。并在突变体片段两端引入KpnⅠ位点,3′端引入3个氨基酸大小随机连接肽的序列。经KpnⅠ酶切后随机连接,克隆于噬菌粒展示载体pCANTAB5S。克隆产物转化大肠杆菌TG1,辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体展示定点随机突变组合文库。结果该定点随机突变组合文库的转化子数目为6.4×106个,滴度为1.4×1015TU/L;文库中含0.72以上的阳性克隆,其中有2个单结构域的阳性克隆占0.15;15个样品的序列分析显示各突变位点和随机连接肽的氨基酸序列呈随机性分布。结论成功构建了噬菌体展示免疫球蛋白结合分子定点随机突变组合文库,该库库容量在一级结构上具有良好的随机性和多样性,可满足体外分子进化研究的要求。

关键词：细菌噬菌体/遗传学基因文库免疫球蛋白结合分子定点随机突变随机连接肽组合文库体外分子进化

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